Журнал неорганической химии, 2023, T. 68, № 3, стр. 363-372

ВВЕДЕНИЕ

Различные виды межлигандного взаимодействия и факторы, способствующие росту устойчивости смешанных комплексов 3d-металлов с аминокислотами с дополнительными донорными группами, такими как гистидин, лизин, орнитин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, были исследованы в работах [1, 2]. На примере многочисленных комплексов Cu(II) с указанными аминокислотами L- и D-рядов были рассмотрены не только возникающие стереоселективные эффекты, но и различные виды межлигандного взаимодействия посредством водородных связей, π–π-стекинга (в случае аминокислот с ароматическим фрагментом). При этом авторы изучали в основном комплексы Cu(II), в которых в силу тетрагонального искажения эти эффекты проявляются сильнее. Значительно реже в этом аспекте рассматриваются комплексы Ni и Zn, имеющие, как правило, октаэдрическое окружение.

Интерес к смешанному комплексообразованию 3d-металлов с биологически активными молекулами не снижается. Смешанные комплексы Cu(II), Ni, Zn с гистидином и производными имидазола служат моделями связывания катиона металла с олигогистидиновыми фрагментами, активно используемыми при модификации белковых молекул с целью их разделения посредством аффинной IMAC-хроматографии, а также таргетирования [3, 4]. Комплексы меди(II) с L-гистидином способствуют эффективному расщеплению плазмидной ДНК при физиологических значениях рН и температуры [5]. Нуклеазная активность комплексов цинка в последнее время также активно изучается [6, 7]. Условием успешного использования комплексов, в том числе смешанных, в различных медико-биологических методиках является тщательное изучение равновесий с их участием.

Ранее тройные системы M(II)–His–Orn (M = = Ni, Zn) исследовали в основном потенциометрическим методом [8, 9], и структурный аспект в этих работах ограничивался почти исключительно анализом констант равновесия. Более того, в указанных работах в основном рассчитывали константы устойчивости смешанных комплексов с двумя аминокислотными остатками, вследствие чего уточнение ионного состава растворов и выявление особенностей координации указанных аминокислотных остатков в смешанных комплексах на основе сравнительного анализа термодинамических данных является актуальным. Поскольку аминокислоты оснóвного типа (His, Lys, Orn) способны к поливариантной координации как в составе цвиттер-ионной, так и в составе анионной формы, выявление типа координации аминокислотного остатка только по результатам pH-потенциометрии крайне затруднительно и требует привлечения данных целого ряда методов. Часто в определенном диапазоне pH в растворе одновременно присутствует несколько комплексных частиц с относительно небольшими долями накопления. Поэтому для надежного определения их физико-химических характеристик требуется корректный учет вклада каждой из рассматриваемых частиц. При этом информативность данных того или иного метода в зависимости от объекта исследования может быть совершенно различной. Все вышесказанное позволяет утверждать, что независимое определение состава комплексов и их констант устойчивости потенциометрическим (или подходящим спектральным) методом с последующим расчетом термодинамических характеристик равновесий комплексообразования по данным калориметрии является предпочтительным, а часто даже единственно возможным. Такой подход хорошо себя зарекомендовал.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Солянокислые L-гистидин (Reanal) и L-орнитин (Acros) марки “ч. д. а.” использовали без дополнительной очистки. Концентрацию рабочего раствора (1 моль/кг раствора) сульфата цинка квалификации “х. ч.” устанавливали комплексонометрически. Бескарбонатный раствор гидроксида натрия готовили по обычной методике на дистиллированной воде, свободной от CO₂. Используемый для создания ионной силы нитрат калия марки “ч. д. а.” дважды перекристаллизовывали из водного раствора.

В ходе работы была проведена серия pH-метрических титрований растворов (ZnSO₄ + HHis · · HCl + HOrn · HCl + KNO₃) 0.2 M раствором NaOH при 25ºС и ионной силе 0.5 (KNO₃) при соотношениях Zn : His : Orn = 1 : 1 : 1, 1 : 2 : 1 и 1 : 1 : 2. В ячейку для титрования помещали 20 мл титруемого раствора и добавляли титрант (3–5 мл). При этом величина pH менялась в диапазонах 4–8.3 (Ni : His : Orn = 1 : 1 : 1), 4–9.3 (Ni : His : Orn = = 1 : 1 : 2) и 4–10.0 (Ni : His : Orn = 1 : 2 : 1). Концентрация ионов цинка во всех опытах составляла 0.01 моль/л. Методика измерения ЭДС цепи со стеклянным электродом и ее калибровки была аналогична приведенной в [10]. Обработку экспериментальных данных рН-метрических измерений проводили по программе PHMETR [11], основанной на минимизации функции правдоподобия F = Σ(р_сН_эксп – р_сН_расч)², где р_сН = –lg[H⁺] – соответственно экспериментальные и рассчитанные по модели величины с учетом протекания реакций:

Обработку потенциометрических данных проводили аналогично [10]. В случае соотношения Zn : His : Orn = 1 : 1 : 1 согласие между рассчитанной кривой и экспериментом достигалось при учете образования смешанных комплексов состава Zn(Orn)(His), Zn(HOrn)(His)⁺ и ZnH₂(Orn)(His)²⁺. При соотношении Zn : His : Orn = = 1 : 1 : 2 адекватной была модель комплексообразования, которая учитывала смешанные комплексы состава ZnH_i(His)(Orn)₂, где (i = 1, 2, 3) (заряд опущен) наряду с однороднолигандными комплексами и смешанными комплексами состава 1 : 1 : 1. Образование комплекса Zn(His)(Orn)$_{2}^{ - }$ не выявлено по причине гетерогенного характера системы при высоких значениях pH. В случае соотношения Zn : His : Orn = 1 : 2 : 1 соответствие расчетных и экспериментальных кривых титрования достигалось при учете образования комплексов состава Zn(His)₂(Orn)^–, NiH(His)₂(Orn) и NiH₂(His)₂(Orn)⁺.

Значения lg K реакций (3)–(5) для гистидина (9.02 и 15.07 соответственно) и орнитина (10.52 и 19.35 соответственно) были взяты из критических обзоров [12, 13], значения констант устойчивости однороднолигандных комплексов Zn с орнитином и гистидином – из надежно выполненных работ [14, 15] соответственно (табл. S1 ). Рассчитанные константы устойчивости смешанных комплексов приведены в табл. 1. Диаграммы долевого распределения в изучаемой системе при различных соотношениях Zn : His : Orn представлены на рис. 1–3.

Определение тепловых эффектов проводили на ампульном калориметре смешения с изотермической оболочкой и термисторным датчиком температуры. Надежность работы калориметра проверяли по теплоте растворения KCl в воде при 298.15 K. Были измерены тепловые эффекты смешения Δ_mixH раствора сульфата Zn с щелочными растворами аминокислот, содержащими фоновый электролит KNO₃ (табл. S2 ). Концентрация цинка после смешения составляла 0.005 моль/л. Компьютерное моделирование равновесий по программе RRSU [11] позволяло подобрать оптимальные условия проведения термохимического эксперимента. Обработку данных калориметрических измерений проводили по программе HEAT [11] с учетом вкладов процессов ионизации воды (Δ_rH₍₁₎ = –56.90 кДж/моль) [16], протонирования аминокислот (Δ_rH₍₃₎ = –45.15 кДж/моль, Δ_rH₍₄₎ = –75.65 кДж/моль [17] для гистидина и Δ_rH₍₃₎ = –51.92 кДж/моль, Δ_rH₍₄₎ = –99.00 кДж/моль [18] для орнитина), образования однороднолигандных комплексов Zn с гистидином (Δ_rH₍₆₎ = = –20.1 кДж/моль, Δ_rH₍₇₎ = –45.6 кДж/моль) [19] и смешанных комплексов указанных выше составов в суммарный тепловой эффект. Вклад комплексов Zn с орнитином в суммарный тепловой эффект в данных условиях был небольшим.

Спектры ЯМР на ядрах ¹Н и ¹³С регистрировали на приборе Bruker AVANCE III-500 с частотами 500.17 МГц на ядрах протона и 125.76 МГц на ядрах углерода при температуре 298 K. Использование температурной приставки Bruker BVT 3000 позволяло поддерживать температуру с точностью 0.1 K. В качестве внешнего стандарта использовали циклогексан (δ_эксп = 1.77 м. д. для ¹Н и δ_эксп = 27.6 м. д. для ¹³С). Была приготовлена серия растворов (растворитель – D₂O) с соотношением Zn : His : Orn = 1 : 1 : 1 и 1 : 2 : 1 при величине pH, отвечающей максимальному выходу смешанолигандной формы. Необходимую величину pH (pD) создавали введением наряду с кристаллическими ZnSO₄, HHis · HCl и Horn · HCl рассчитанного количества кристаллического KOH марки “х. ч.”. Концентрация комплексоната Zn в растворе составляла 0.250 моль/кг D₂O. Значения химических сдвигов сигналов функциональных групп Orn и His в растворах изученных комплексов приведены в табл. S3 и S4 . Спектры ЯМР ¹Н растворов изученных комплексов представлены на рис. 4, 5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В литературе имеются данные лишь одной работы [9], в которой методом рН-метрии были изучены тройные системы Zn–L-гистидин, гистамин–диаминокарбоновая кислота. Авторами работы установлено существование в растворе трех смешанных частиц состава ZnH_i(His)(Orn), где i = 0, 1, 2 (заряд опущен), однако не выявлены смешанные комплексы иной стехиометрии. Тем не менее константы устойчивости комплексов указанного состава, полученные в настоящей работе и работе [9], достаточно хорошо согласуются с учетом различий в условиях эксперимента. Таким образом, представляло интерес не только уточнить ионный состав растворов в системе Zn–His–Orn в широком интервале концентрационных соотношений и pH, но и использовать термодинамический подход к оценке строения образующихся смешанных комплексов.

Анализ литературных данных позволил указать на ряд структурных особенностей координации остатка гистидина катионом цинка. Так, в работе [24], выполненной с привлечением двумерной гомо- и гетероядерной корреляционной ЯМР-спектроскопии, а также DFT-расчетов, была предложена схема координации остатков гистидина в бис-гистидинате Zn. В частности, при повышении pH раствора до 7.5 катион Zn(II) оказывается связанным с донорными атомами N_am, O_COO и N_im двух остатков гистидина и имеет октаэдрическое окружение. На это указывает пространственная близость атомов азота α-аминогруппы и пиридинового кольца в гистидине, что следует из данных 2D ¹⁵N–¹⁵N PDSD ЯМР-эксперимента. Кроме того, тридентатный характер остатков гистидина и шестивершинное строение комплекса подтверждены оптимизацией геометрии, что, в свою очередь, хорошо согласуется с данными кросс-поляризационного ¹³C ЯМР-эксперимента. Полученный при рН 7.5 комплекс His–Zn(II) наиболее близок по структуре к кристаллическому Zn(D,L-His)₂ [25]. При дальнейшем увеличении pH до 11 обнаружено, что атом азота пиридинового типа имидазольного фрагмента по-прежнему координируется катионом Zn(II), а атом азота пирольного типа депротонируется, образуя водородные связи с соседней молекулой воды. При рН 14 оба атома азота депротонированного имидазольного фрагмента становятся идентичными и координируются разными катионами Zn(II), образуя макромолекулу. Не менее интересны в свете строения гистидинатов цинка результаты работы [26], где с применением XANES- и EXAFS-спектроскопии выявлено ближайшее окружение катиона цинка в растворах гистидинатов в широком диапазоне pH 0.5–11.5. При pH 9.02 остатки гистидина, связанные с цинком, выступают в качестве бидентатных лигандов. При этом комплекс имеет тетраэдрическую геометрию. Это полностью согласуется с данными рентгеноструктурного анализа кристаллического образца дигидрата бис-L-гистидината цинка (запись HISZND01 в базе данных CCDC) [27], где имеет место гистаминный способ координации остатков гистидина, хотя в более ранних работах [28, 29] было установлено тетрагональное окружение катиона цинка в составе ди- и пентагидратов бис-L-гистидината цинка (длина связи Zn–O_COO значительно больше связей Zn–N_am и Zn–N_im). При подкислении раствора (pH ~ 5.87) комплекс принимает октаэдрическую геометрию с четырьмя внутрисферными молекулами воды и двумя монодентатными гистидиновыми лигандами, координированными посредством α-аминогруппы. Предложенная авторами структура комплекса [Zn(HHis)₂(H₂O)₄]²⁺, к сожалению, не указывает на характер протонирования остатков гистидина, однако совершенно очевидно, что предпочтительным является глицинатный способ координации. Тем не менее в качестве монодентатного лиганда можно рассматривать и цвиттер-ионную форму HHis, где координация осуществляется через имидазольный фрагмент, что весьма характерно для цинка. Когда протонирование гистидина завершено (pH < 2.29), цинк окружен шестью молекулами воды. К сожалению, авторы не рассматривают образование комплекса [ZnHHis₂]⁺, в котором остатки гистидина, очевидно, имеют разные типы координации.

Рассчитанные термодинамические параметры изученных реакций приведены в табл. 1. Как уже отмечалось ранее в аналогичном исследовании с участием комплексов Ni [10], при оценке возможного типа координации лигандов более информативным является анализ термодинамических параметров присоединения анионной или цвиттер-ионной формы орнитина к моно- и бис-комплексам Zn с гистидином. Нами рассматривались также процессы смешанолигандного комплексообразования Zn с гистидином и глицином [20] в качестве модельных процессов. Так, реакция присоединения анионной формы орнитина к комплексу ZnHis⁺ является более экзотермичной по сравнению с реакцией присоединения цвиттер-ионной формы. Указанное явление наблюдалось и в случае аналогичных реакций с участием никеля [10]. При этом параметры присоединения HOrn^± к ZnHis⁺ близки к параметрам аналогичной реакции с участием глицина, а также к параметрам реакций образования глицинатных комплексов Zn, что позволяет с уверенностью говорить о преобладании тридентатного (N, N, O) типа координации орнитина в составе комплекса Zn(His)(Orn). По-видимому, в растворе устанавливается равновесие между формами смешанного комплекса с би- и тридентатным типом координации орнитина, которое смещено в сторону последнего. Термодинамические параметры присоединения HOrn^± к ZnHis⁺, рассчитанные с учетом протонирования α-аминогруппы и предполагающие координацию цвиттер-ионной формы орнитина посредством ε-аминогруппы и ее монодентатный характер, оказываются явно завышенными (табл. 1). На глицинатный тип координации цвиттер-ионной формы орнитина указывает близость термодинамических параметров рассматриваемого процесса и реакции присоединения остатка глицина к ZnHis⁺ и ZnGly⁺ (табл. 2).

Термодинамические параметры присоединения цвиттер-ионных форм гистидина и орнитина к катиону цинка с образованием комплекса Zn(HHis)(HOrn)²⁺ рассчитывали с учетом возможного протонирования остатка гистидина как по α-аминогруппе, так и по имидазольному кольцу. При этом остаток орнитина считали преимущественно протонированным по ε-аминогруппе и, как следствие, координированным по глицинатному фрагменту. Учет протонирования остатка гистидина по имидазольному фрагменту дает явно завышенные значения lg K и экзоэффекта рассматриваемой реакции, хотя это и предполагает участие в координации именно глицинатного фрагмента. Аналогичная ситуация наблюдалась и для комплекса Ni такого же состава. В то же время учет протонирования остатка гистидина по α-аминогруппе и, как следствие, координация HHis^± посредством гетероатома азота пиридинового типа дают значения lg K и Δ_rH, близкие к таковым для процесса образования бис-глицинатного комплекса цинка. Это предполагает глицинатный тип координации цвиттер-ионных форм орнитина и гистидина в комплексе состава Zn(HHis)(HOrn)²⁺ (табл. 3). Очевидно, поведение глицинатного и имидазольного фрагментов гистидина при его протонировании и последующей координации нельзя полностью рассматривать как независимое. В случае орнитина и лизина тезис о независимом поведении двух атомов азота при их координации оказывается более обоснованным по причине протяженной алифатической части и пространственного разделения донорных атомов.

Рассчитанные нами константы процессов сопропорционирования

для L = Gly [20], HOrn, Orn составили соответственно 0.97, 1.99 и 1.65 лог. ед. Расчет константы равновесия (15) для L = Orn проводили с использованием данных по устойчивости комплекса Zn(Orn)₂, приведенных в работе [30], так как эта величина в работе [14] не была получена. Все константы равновесия пересчитывали на I = 0.5. Полученные нами значения lgK₍₁₅₎ ненамного больше статистически ожидаемого значения 0.3. Причиной этого является отсутствие в случае Gly такого фактора экстрастабилизации смешанного комплекса, как увеличение дентатности лиганда(ов). В случае L = HOrn K₍₁₅₎ достигает 2 лог. ед., что, скорее всего, можно объяснить наличием слабого взаимодействия (водородной связи) между протонированной ε-аминогруппой остатка орнитина и карбоксильной группой гистидина.

Как и в случае комплексов Ni, термодинамические параметры образования смешанных комплексов с тремя аминокислотными остатками свидетельствуют о конкуренции между донорными атомами лигандов. В частности, реакции присоединения анионных форм His^– и Orn^– соответственно к комплексам Zn(His)(Orn) и Zn(His)₂ с образованием комплекса Zn(His)₂(Orn)^– характеризуются небольшими экзоэффектами. Присоединение остатка гистидина или орнитина здесь возможно только за счет понижения дентатности уже координированных остатков аминокислот. Слабый экзоэффект свидетельствует о том, что присоединение третьего аминокислотного остатка приводит к перераспределению дентатности лигандов в комплексе, не сопровождающемуся увеличением числа координированных атомов азота аминного типа. При этом присоединение His^– к комплексу Zn(His)(Orn) характеризуется несколько большим экзоэффектом, что косвенно указывает на устранение от координации ε-аминогруппы орнитина и координацию второго остатка гистидина посредством глицинатного фрагмента, в то время как присоединение Orn^– к комплексу Zn(His)₂ характеризуется меньшим экзоэффектом, очевидно, вследствие нарушения структуры устойчивого координационно-насыщенного бис-гистидината цинка и перехода от гистаминного к глицинатному типу координации. Похожее соотношение отмечалось и для комплексов никеля.

Комплекс ZnHisOrn₂ в ходе исследований не обнаружен в силу развивающегося в щелочной области осадкообразования. Выявлены протонированные комплексы состава ZnHisH_iOrn₂, где i = = 2, 3 (заряды опущены). Экзоэффект присоединения цвиттер-ионной формы орнитина к ZnHis₂ с образованием ZnHHis₂Orn, рассчитанный с учетом протонирования остатка орнитина как по ε-, так и по α-аминогруппе, оказался больше, чем при образовании комплекса ZnHis₂Orn^–, но близок к тепловому эффекту присоединения цвиттер-ионной формы орнитина к комплексу ZnHis⁺. При этом значение lg K заметно меньше. Данный факт косвенно подтверждает координацию остатка орнитина по глицинатному типу. Учет протонирования остатка орнитина по α-аминогруппе, предполагающий монодентаный характер HOrn⁺, дает явно завышенные значения константы равновесия и экзоэффекта. На основании того, что оснóвные свойства ε-аминогруппы орнитина значительно выше, чем имидазольного фрагмента остатка гистидина, можно с уверенностью говорить о том, что в структуре ZnH(His)₂(Orn) протонированным оказывается остаток орнитина. Более того, экзотермичность рассматриваемого процесса указывает на рост числа координированных атомов азота, приводящий к появлению комплекса с ближайшим окружением {2N_am, 2N_im, N_am, O_COO), т.е. в составе этого комплекса один или два остатка гистидина сохраняют гистаминный способ координации.

При образовании смешанолигандного комплекса ${\text{ZnHHis(HOrn)}}_{2}^{{2 + }}$ термодинамические параметры были рассчитаны для двух случаев: а) с учетом протонирования α-аминогруппы гистидина и ε-аминогруппы орнитина и б) с учетом протонирования имидазольного фрагмента гистидина и ε-аминогруппы орнитина. Наиболее вероятные значения были получены при учете протонирования α-аминогруппы гистидина и ε-аминогруппы орнитина. В данном случае протонированными оказываются все три аминокислотных остатка. Наиболее возможной является координация остатков орнитина по глицинатному фрагменту, в то время как цвиттер-ионная форма гистидина может координироваться посредством как глицинатного фрагмента, так и гетероатома азота имидазольного кольца. Вполне вероятно, что реализуются оба способа координации и в растворе сосуществуют обе структуры.

В структуре комплекса состава ${\text{Zn(His)(HOrn)}}_{2}^{ + }{\text{,}}$ по всей видимости, протонированными оказываются оба остатка орнитина. Экзоэффект процесса:

несколько уступает тепловому эффекту образования ${\text{ZnHHis(HOrn)}}_{2}^{{2 + }}$ (табл. 1). Принимая во внимание тот факт, что тепловой эффект этого процесса определен с максимальной в наших условиях погрешностью, можно предполагать, что в комплексах состава ${\text{ZnHis(HOrn)}}_{2}^{ + }$ и ${\text{ZnHHis(HOrn)}}_{2}^{{2 + }}$ все три аминокислотных остатка координированы по глицинатному типу. Таким образом, гистаминный способ координации остатка гистидина в комплексе ${\text{ZnHis(HOrn)}}_{2}^{ + }$ оказывается маловероятным.

Данные ЯМР-спектроскопии косвенно подтверждают выводы, сделанные на основании сравнительного анализа термодинамических данных. Из спектров ПМР (рис. 4, 5) хорошо видно, что с ростом pH (pD) наибольшее смещение отмечается для сигналов протонов имидазольного фрагмента гистидина. При этом сигналы смещаются в область сильного поля. Это указывает на координационную активность имидазольного фрагмента и возможность вовлечения в координацию двух атомов азота гистидина. Сосуществование в одной и той же области рН различных однородно- и смешанолигандных частиц с относительно невысоким процентным содержанием сильно осложняет интерпретацию изменения величины химсдвига линий в спектре ЯМР растворов с соотношением Zn : His : Orn = 1 : 2 : 1. Изучение спектров ЯМР растворов с соотношением Zn : His : Orn = 1 : 1 : 2 оказывается крайне затруднительным в силу осадкообразования, а их информативность еще больше снижается.

Спектроскопия ЯМР на ядрах углерода уже привлекалась ранее [21] для изучения равновесий в системах Zn–His–L (L = en, Gly). Данные ¹³С ЯМР-спектроскопии были использованы для расчета констант устойчивости комплексов состава ZnH_nHis₂L, где n = –1, 0, 1 (заряд опущен). По мнению авторов, только учет образования указанных выше тройных комплексов, содержащих два остатка гистидина, наряду с комплексами состава ZnHisL дает довольно хорошее соответствие между расчетными и экспериментальными профилями pD. Из полученных нами данных (рис. 4) видно, что сигналы протонов, связанных с β- и δ-атомами углерода соответственно гистидина и орнитина, с ростом pH сильно уширяются. Это может быть обусловлено так называемым внутрихелатным обменом, отвечающим равновесию между формами смешанного комплекса с гистаминоподобным и тридентатным типами координации остатка гистидина, с одной стороны, и глицинатным и тридентатным {N, N, O} типами координации остатка орнитина – с другой. К сожалению, выявить эту тенденцию сложно, так как даже в наиболее щелочном растворе содержание комплексов Zn(His)(HOrn)⁺ и Zn(His)(Orn) оказывается сопоставимым. Таким образом, данный эффект наблюдается в условиях равновесия между двумя указанными смешанными комплексами на фоне депротонирования δ-аминогруппы остатка орнитина.

Хорошо прослеживаемая корреляционная зависимость констант устойчивости смешанных комплексов Ni(II) [10] и Zn указывает прежде всего на их сходное строение. И хотя для этих двух металлов было установлено существование в растворе смешанных комплексов не всех составов, можно указать на ожидаемое значение константы устойчивости смешанного комплекса одного металла при известной аналогичной величине для другого. Нами были предложены составы смешанных комплексов с указанием ближайшего окружения и наиболее вероятных типов координации аминокислотных остатков катионом цинка (табл. 3). В ряде случаев можно говорить о сосуществовании в растворе как минимум двух структур одного и того же комплекса, различающихся типом координации либо характером межлигандного взаимодействия. В условиях относительно низкой информативности спектральных методов или неприменимости того или иного их вида сравнительный анализ термодинамических параметров позволяет сделать обоснованные выводы о строении смешанных комплексов металлов в растворе.