Химическая физика, 2022, T. 41, № 12, стр. 60-65

ВВЕДЕНИЕ

Использование биотехнологий в сельском хозяйстве ориентировано на стабильное развитие сельскохозяйственного производства. Методы культивирования растительных тканей наиболее часто используются в качестве биотехнологических инструментов для базовых и прикладных целей: как для исследований процессов развития растений, так и для их коммерческого получения с конкретными промышленными и агрономическими признаками, а также для селекции растений, удаления вирусов из инфицированных особей с целью выращивания высококачественного здорового растительного материала и улучшения урожая [1].

Центральной проблемой биотехнологии является интенсификация биопроцессов как за счет повышения потенциала биологических агентов и их систем, так и за счет усовершенствования методов применения биокатализаторов [2–6]. В этом отношении использование наноразмерных структур в различных приемах оздоровления и культивирования посадочного материала, а возможно, и клонального размножения растений, представляет собой перспективное направление. Подбор питательных сред, обеспечивающих потребности культуры ткани продуцента в химических компонентах, необходимых для оптимального роста и развития растений и/или биосинтеза целевого продукта, является важным фактором создания эффективной биотехнологической системы. Смеси минеральных солей (макро- и микроэлементов) – обязательные компоненты питательных сред, помимо витаминов и сахарозы как источника углерода.

Наши многолетние исследования позволили установить следующие особенности действия НЧ на биосистемы. Наночастицы металлов имеют низкую токсичность, в 7–50 раз меньшую токсичности металлов в ионной форме; обладают пролонгированным и полифункциональным действием; в биотических дозах, т.е. в дозах, в 10–50 раз меньших максимально переносимых доз, стимулируют обменные процессы; легко проникают во все органы и ткани, проявляют синергидный эффект с природными полисахаридами, а их биологическая активность зависит от особенностей строения частиц и их физико-химических характеристик [7–10]. Учитывая эти уникальные свойства НЧ металлов, мы включили их в состав питательной среды вместо солей.

Большая часть новейшей литературы по применению нанотехнологий посвящена удобрениям и пестицидам в виде наночастиц, а также сенсорам при выращивании и защите растений [11]. Удобрения с наночастицами – это экологически чистые удобрения или “интеллектуальные” удобрения, способные уменьшить нормы внесения удобрений и снизить потери питательных веществ из них, в основном фосфора и азота [12]. Наночастицы обеспечивают постепенное и контролируемое высвобождение питательных веществ и эффективное использование их растениями, что помогает предотвратить загрязнение водных объектов и окружающей среды [13]. Удобрения с наночастицами способны как сами обеспечивать растения питательными веществами, так и усиливать действие удобрений даже при применении их в меньших количествах [14]. Внекорневое применение таких удобрений снижает стресс у растений [15].

Удобрения с наночастицами можно разделить на следующие категории в зависимости от потребности растений в питательных веществах: 1) удобрения с макроэлементами, 2) удобрения с микроэлементами. Удобрения с макроэлементами состоят из комбинации элементов, таких как калий (K), магний (Mg), азот (N), кальций (Ca) и фосфор (P). По прогнозам, общее потребление макроэлементных удобрений увеличится до 263 млн т в 2050 г., что свидетельствует о существенной потребности в этих удобрениях в сельскохозяйственном секторе.

Группа ученых [16] проверила эффективность действия наночастиц Mg и Fe на рост черноглазого гороха (Vigna unguiculata) путем внекорневой подкормки и отметила увеличение фотосинтетической способности листьев и массы семян, что, в свою очередь, привело к повышению урожайности культуры. Наночастицы Ca вместе с гуминовыми кислотами улучшали рост проростков арахиса на 30% [17]. Наши исследования показали, что предпосевная обработка семян ярового ячменя наночастицами железа, цинка и меди в составе полимерной пленки повышает урожайность на 4.1% по сравнению с необработанными семенами. При этом влажность бункерного зерна была ниже, чем влажность зерна контрольной группы на 2.2%, что способствовало экономии энергии при его сушке [18].

На основании вышеизложенного становится очевидным, что при культивировании растений в асептических условиях замена солей жизненно необходимых металлов железа, цинка, меди в составе питательной среды Мурасиге–Скуга на НЧ этих металлов может оказаться эффективной [19]. В представленной работе наночастицы этих элементов с заданными физико-химическими характеристиками в разных концентрациях индивидуально или в комбинации друг с другом в разных соотношениях вводились в состав питательной среды.

Целью наших исследований было изучение морфометрических, физиологических, анатомических показателей растений перца, выращенного на модифицированной наночастицами железа среде Мурасиге–Скуга, и его урожайности при культивировании в грунте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наночастицы железа были получены методом высокотемпературной конденсации на установке Миген-3 в ФИЦ химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН [20]. Исследование физико-химических характеристик НЧ железа было проведено сотрудниками Лаборатории нано- и микроструктурного материаловедения. Определены: средний диаметр наночастиц Fe (27.0 ± 0.51 нм), содержание кристаллической металлической фазы (53.6%), содержание фазы оксида железа Fe₃O₄ (46.4%), толщина оксидной пленки (3.5 нм) [21].

Объект исследования – культура растения перца Capsicum annuum L. сорта LJ-king. Для культивирования растений в работе использовали питательную среду Мурасиге–Скуга [19].

В подготовленные стерильные банки с питательной средой раскладывали по 3 шт. семян перца в каждую банку. Для каждого варианта среды использовали по 10 банок с тремя семенами в каждой. Банки с семенами помещали на стеллажи в стерильной комнате с контролируемым постоянным режимом: температура – 22–25 °С, влажность – 36%, освещенность – 3500–3000 лк в режиме 12 ч свет/12 ч темнота в сутки.

Через 15 сут роста проверяли всхожесть семян. Через 40 сут роста и развития растений оценивали следующие морфометрические показатели: длину корня, длину ростка, массу зеленой части растений; физиологические показатели: активность корня и содержание хлорофилла. Активность корня определяли по восстановлению трифенилтетразолия хлорида (ТТХ). Корни инкубировали с раствором ТТХ при 37 °C в течение 1.5 ч. Добавляли H₂SO₄, этилацетат, корень растирали в ступке пестиком, и суспензию фильтровали. На спектрофотометре измеряли поглощение фильтрата при длине волны 485 нм [22]. Выделение хлорофилла из листьев перца проводили путем экстракции 100%-ным ацетоном. Экстракты центрифугировали и измеряли их спектры поглощения при 662 и 645 нм [23].

Для оценки урожайности растения перца через 60 дней от начала культивирования растений в асептических условиях посадочный материал из стерильных банок высаживали в почву теплицы. В теплице поддерживали следующие условия: температура почвы составляла 10–25 °C, температура воздуха днем – 13–28 °C, ночью – 15–20 °C в зависимости от фазы роста и развития растений.

Почву в теплице для посадки перцев готовили следующим образом: сначала вспахивали, затем добавляли органическое удобрение и снова вспахивали, добиваясь равномерного перемешивания. Органическое удобрение содержало N, P₂O₅ и K₂O. Доза вносимого органического удобрения составляла 150 кг/м². Для полива растений применяли капельный метод. Капельная оросительная труба проходила в почве. Почву мульчировали пластиком, благодаря чему сохраняли влажность почвы.

Статистическую обработку данных осуществляли в программах Microsoft Excel 2010 и Statistica 20 (“StatSoft, Inc.”, USA). Определяли средние значения изучаемых показателей (М) и стандартные ошибки среднего (±SEМ). Достоверность различий между вариантами (р) оценивали методами параметрической (t-критерий Стьюдента) статистики. Различия между вариантами считали статистически значимыми при p ≤ 0.05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Культивирование растений на питательных средах в асептических условиях отвечает современным требованиям качества посадочного материала [11]. Одним из факторов культивирования растений являются условия их выращивания. Помимо температуры и освещенности, большое значение имеет состав питательных сред, как правило, сбалансированный по содержанию не только витаминов, аминокислот, гидролизатов, хелатов и других веществ, но и по содержанию макро- и микроэлементов. Учитывая уникальные биологические свойства НЧ металлов, мы разработали способ введения в питательную среду наночастиц жизненно необходимых элементов, заменяя сульфаты металлов на НЧ. Высокая реакционная способность наночастиц накладывает определенные требования на способ приготовления питательных сред, поскольку наночастицы, обладающие высокой удельной поверхностью, в водной среде активно агрегируют друг с другом. При этом необходимо сохранять стерильность питательной среды. Подробно процедура создания стерильной питательной среды с наночастицами металлов на основе среды Мурасиге–Скуга описана в нашем патенте [19].

Одним из жизненно важных элементов для роста растений является железо, дефицит которого приводит к развитию хлороза растений, задержке роста и снижению урожайности [24]. В последнее время НЧ железа стали использовать в виде удобрений с целью повышения как урожайности, так и качества продукции растениеводства. Показано, что эти НЧ повышают абсорбцию питательных веществ, увеличивают фотосинтетическую активность листьев, усиливают обменные процессы [25]. Однако морфометрические, физиологические, анатомические изменения растений, культивированных на питательных средах с добавлением наночастиц Fe, не изучены. Ранее нами установлено, что наночастицы металлов обладают биотическим действием, т.е. стимулируют обменные процессы в концентрациях, в 10–100 раз меньших значений максимально переносимой дозы. С учетом этого факта в питательные среды наночастицы Fe были введены в концентрациях, в 2–100 раз меньших, чем стандартная концентрация железа сульфата в среде Мурасиге–Скуга. Содержания остальных компонент, входящих в состав питательной среды, оставляли без изменений [19].

При выращивании растения перца на питательной среде, содержащей вместо железа в ионной форме НЧ железа в концентрациях 0.06, 0.3 и 3.0 мг/л, наблюдается изменение морфометрических параметров растений (рис. 1, 2). Так, длина корня растения при концентрациях НЧ железа 0.06, 0.3 и 3.0 мг/л увеличивается на 54%, 118% и 102%, соответственно, по сравнению с растениями, выращенными на стандартной среде Мурасиге–Скуга. Стимуляцию роста корней при действии наночастиц Fe наблюдали многие авторы на примере различных растений, в том числе арахиса, сои, шпината и др. [25–30]. Введение в состав питательной среды НЧ железа слабо отражается на длине ростка и зеленой массе растения (рис. 1).

Рис. 1.

Изменение длины корня (I), длины ростка (II) и массы зеленой части растения перца (III), культивированного в асептических условиях на питательной среде Мурасиге–Скуга (1) и на модифицированной среде с наночастицами Fe в концентрациях 0.06 (2), 0.3 (3), 3.0 мг/л (4); данные представлены в виде опыт/контроль (О/К), %; * – р ≤ 0.05.

Рис. 2.

Фотография проростков растения перца, культивированного в асептических условиях на питательной среде Мурасиге–Скуга (1) и на модифицированной среде с НЧ железа в концентрациях 0.06 (2), 0.3 (3) и 3.0 мг/л (4).

На рис. 3 представлены результаты влияния НЧ железа в составе питательной среды Мурасиге–Скуга на физиологические показатели растения перца. Видно, что при выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо железа в ионной форме наночастицы железа в концентрации 0.06 и 0.3 мг/л, активность корня перца сорта LJ-king увеличивается соответственно на 59% и 58% по сравнению с контролем. Следовательно, полученные нами результаты, а также данные других исследователей демонстрируют, что НЧ железа в оптимальной концентрации являются фактором стимуляции роста и активности корня при формировании корневой системы растений.

Рис. 3.

Изменение активности корня (I), содержания хлорофилла (II) и прорастания семян растения перца (III), культивированного в асептических условиях на питательной среде Мурасиге–Скуга (1) и на модифицированной среде с НЧ железа в концентрациях 0.06 (2), 0.3 (3) и 3.0 мг/л (4); данные представлены в виде опыт/контроль (О/К), %; * – р ≤ 0.05.

Введение в питательную среду НЧ железа вместо железа в ионной форме оказывает влияние на прорастание семян и содержание хлорофилла. Как видно из рис. 3, введение в питательную среду НЧ железа в концентрации 0.06 мг/л повышает показатель прорастания семян перца на 3.5%, а в концентрациях 0.3 и 3.0 мг/л – способствует увеличению содержания хлорофилла в листьях соответственно на 5% и 27% по сравнению с контролем.

После 60 дней от начала культивирования растений в асептических условиях посадочный материал из стерильных банок высаживали в почву теплицы. Через 80 дней после высаживания растений был собран урожай перцев. Результаты исследования приведены на рис. 4.

Рис. 4.

Изменение показателей растения перца (I – урожайность, II – количество плодов, III – прорастание семян), посадочный материал которого выращен в асептических условиях на питательной среде Мурасиге–Скуга (1) и на модифицированной среде с НЧ железа в концентрациях 0.12 (2), 0.6 (3) и 3.0 мг/л (4); данные представлены в виде опыт/контроль (О/К), %; * – р ≤ 0.05.

Видно, что урожайность растения перца в экспериментальных группах разная. Так, наибольшую урожайность показал посадочный материал, выращенный на питательной среде с НЧ железа в концентрации 0.6 мг/л. По количеству плодов и общей массе значения показателей превышают контроль соответственно в 2.06 и 2.25 раза по сравнению с контролем.

При использовании НЧ железа в растениеводстве были изучены изменения физиологических функций растений. Так, установлено действие наночастиц Fe₂O₃ на рост арахиса. Показано, что НЧ оксида железа стимулируют рост, увеличивают длину корней, высоту и биомассу растений, регулируя содержание фитогормонов и активность антиоксидантных ферментов [31]. Влияние наночастиц Fe₃O₄ выражается в снижении общего содержания хлорофилла и каротиноидов и повышении уровня малонового диальдегида и основных показателей перекисного окисления липидов растений лаванды и тимьяна [32]. Однако наблюдаемые физиологические эффекты наших исследований и других авторов далеки от объяснения механизмов воздействия НЧ железа на растения. Мы предположили, что возможный механизм стимулирующего действия НЧ железа на растения может быть связан с изменением структуры и функции биологических компонентов.

В нашем исследовании проведен систематический анализ влияния наночастиц Fe на изменения структуры клеток листьев растения перца сорта C. annuum [31]. Установлено, что НЧ железа регулируют рост растений, причем низкие их концентрации играют положительную роль в образовании большего количества хлоропластов и способствуют более плотной упаковке гран в листьях по сравнению с контролем (действием Fe²⁺). Известно, что биогенез хлоропластов и организация гран являются двумя жизненно важными процессами развития хлоропластов, обеспечивающими захват света во время фотосинтеза [33]. Кроме того, было высказано предположение, что укладка гран играет важную роль в защите фотосистемы II, расположенной в сложенном гране, как это было представлено Андерсоном и Aрo в 1994 году [34]. Повышенное содержание хлорофилла также свидетельствует об усилении эффективности фотосинтеза в растительных клетках.

Анатомические исследования свидетельствуют, что при действии НЧ железа изменения затрагивают толщину клеточных стенок (табл. 1). Известно, что растительные клеточные стенки проявляют крайнюю прочность на растяжение, а изменения механических свойств клеточных стенок могут не только существенно влиять на распределение устьиц и проницаемость клеточной стенки, но и на размер растительных клеток [30]. Не следует забывать также, что наночастицы Fe в биологических системах активно участвуют в реакции Хабера–Вайса с образованием OH^•-радикалов, которые могут вызвать ослабление клеточной стенки, облегчить растяжение клеток и тем самым способствуют увеличению параметров растений [35]. При действии НЧ железа происходит увеличение сосудистых пучков листьев, что приводит к усилению переноса питательных веществ. Наблюдаемые нами особенности изменения анатомии листа, мезофилла, плотности упаковки гран, величины клеточной стенки являются одним из важных ответов на воздействие наночастиц Fe, которые при действии в биотических концентрациях обеспечивают получение хорошо развитого посадочного материала, способствующего повышению урожайности перца.

Дальнейшие исследования с применением методов геномики, транскриптомики и протеомики позволят раскрыть сложные механизмы стимуляции процессов роста и развития растений при использовании нанотехнологий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Растения, выращенные в асептических условиях, отвечают современным требованиям к качеству посадочного материала. Наши исследования показывают, что посадочный материал, выращенный на питательной среде Мурасиге–Скуга, в которую вместо сульфата железа введены наночастицы железа, имеет улучшенные морфометрические и физиологические показатели за счет структурной перестройки. Благодаря совместному использованию био- и нанотехнологии получен посадочный материал с хорошо развитой и активной корневой системой и улучшенными морфометрическими и физиологическими показателями, что позволяет повысить урожайность плодов перца.

Авторы благодарят Министерство образования и науки РФ и сотрудников лаборатории ФИЦ ХФ РАН под руководством А.Н. Жигача за поддержку в проведении экспериментов.