Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова, 2021, T. 71, № 5, стр. 605-619

МЕТОДИКА

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для выполнения поставленных задач проведено сравнительное исследование следующих областей коры больших полушарий мозга: дорсо-латеральной предцентральной, вдоль центральной борозды, и верхней височной по границе с латеральной бороздой. В зависимости от линейки антител, использованных в ходе иммуногистохимического маркирования, дополнительных методов исследования и гестационного возраста плода (см. табл. 1) описание материала скомпоновано следующим образом: в первый раздел включены 3 случая в возрасте 20–22 нед; во второй – 3 случая в возрасте 23–24 нед; в третий – 4 случая в возрасте 25–26 нед; в четвертом разделе анализируются результаты иммуномаркирования нейронов коры полушарий мозга плодов 20–26 нед гестации антителами к МАР2.

В результате анализа препаратов мозга 20–22-недельных плодов, окрашенных по методу Ниссля, установлено, что в коре обеих исследованных областей можно выделить три зоны: маргинальную, бедную клеточными элементами, плотноклеточную корковую пластинку, более редкоклеточную субпластинку, которая плавно переходит в интермедиальную зону. Толщина коры, включая маргинальную зону и субпластинку до границы с интермедиальной зоной в предцентральной области, составила 1100 ± 31 мкм, в височной – 970 ± 14 мкм. Графики значений оптической плотности подкрепили визуальные наблюдения (рис. 1 (а)).

Рис. 1.

Цитоархитектоника коры верхней височной области (а) и распределение липидов на фронтальном срезе височной доли (б) мозга человека 21 нед гестации. На (а) – срез височной доли, окрашенный по Нисслю, цитоархитектоника коры верхней височной области и график оптической плотности. Обозначения: MZ – маргинальная зона, CP – корковая пластинка, SP – субпластинка. CP дополнительно выделена цветом в соответствии с границами кластера фосфадилхолина PC(30:0). На (б) – распределение детектированных липидов на срезе. Отмечены фосфадилхолины, кластеры которых приурочены к корковой пластинке височной области.

Fig. 1. Cytoarchitectonics of the upper temporal region (а) and the distribution of certain lipids on the frontal section of the temporal lobe (b) of the brain of a human fetus at 21 weeks of gestation. (а) – section of the temporal lobe, stained according to Nissl, cytoarchitectonics of the upper temporal region and a graphics of optical density. Designations: MZ – marginal zone, CP – cortical plate, SP – subplate. The CP is additionally highlighted in color in accordance with the boundaries of the phosphadylcholine PC cluster (30:0). (b) – distribution of the detected lipids on the section; phosphadylcholines which are confined to the cortical plate of the temporal cortex are highlighted by a dashed circles.

Граница корковой пластинки с маргинальной зоной и субпластинкой подтверждается данными имиджинговой масс-спектрометрии (MALDI IMS). Липиды головного мозга демонстрируют широкое биохимическое и функциональное разнообразие, а также, в зависимости от свойств, избирательную приуроченность к определенным ядрам или слоям серого вещества, к белому веществу разных отделов мозга. Из тех липидов, которые удалось идентифицировать в образцах коры височной доли мозга плодов 20–22 нед гестации, оказались фосфодилхолины, при этом три из них: PC(30:0), PC(36:7), PC(38: 8) – выделены только в кортикальной пластинке (рис. 1 (б)), но не в маргинальной зоне и субпластинке, что подтверждает данные цитоархитектоники.

Данные о более сложном строении корковой пластинки получены методом иммуногистохимии с антителами к CTIP2 и FOXP1, SATB2. Иммуномаркирования высокого качества удалось добиться только на одном образце височной доли с высокой плотностью CTIP2+ и FOXP1+ ядер нейронов (см. табл. 1), тем не менее результат заслуживает анализа, так как убедительно демонстрирует диверсификацию CTIP2+ и FOXP1+ нейронов. Реконструкция нескольких полей зрения верхней височной области коры площадью около 0.5 см² (рис. 2) наглядно иллюстрирует, что FOXP1+ нейроны представлены во всей корковой пластинке, но их совокупность разделена полосой, в которой плотность таких клеток заметно снижается. Уровень с низкой плотностью FOXP1+ ядер совпадает по глубине залегания с зоной максимальной плотности CTIP2+ нейронов.

Рис. 2.

Взаимодополняющие кластеры CTIP2+ и FOXP1+ нейронов коры височной области мозга человека 20 нед гестации. Стрелка указывает на латеральную борозду, верхняя височная область – слева от борозды.

Fig. 2. Complementary groups of CTIP2+ and FOXP1+ neurons in the temporal cortex of the brain of the fetus at 20 weeks of gestation. The arrow indicates the lateral gyrus, the superior temporal region to the left of the arrow.

В возрасте 23–24 нед гестации стратификация корковой пластинки в верхней височной и предцентральной областях коры усложняется. На препаратах, окрашенных по Нисслю, слой eII становится более плотноклеточным, чем ниже расположенные слои, которые выделить цитоархитектонически не удается. В этот период начавшаяся стратификация коры сопровождается ее утолщением до 1450 ± 18 мкм в предцентральной и до 1104 ± 23 мкм в височной областях.

Иммуногистохимическое выявление нейронов корковой пластинки предцентральной и височной областей коры проводили с использованием антител к слой-специфичным транс-крипционным факторам: CTIP2, SATB2, FOXP1. Поскольку в исследуемый период цитоархитектонически сложно выделить слои корковой пластинки, при подсчете ИГХ+ элементов на изображение анализируемого участка коры предварительно наносили сетку из ячеек с длиной стороны 164 мкм. Такую же сетку наносили на соседний срез, окрашенный по Нисслю. Благодаря этому приему стало возможным проследить динамику численности иммунопозитивных клеток по поперечнику коры, определить более высокую плотность маркированных элементов на определенном уровне коры и таким образом получить представление о формировании слоев корковой пластинки. По поперечнику коры полушарий мозга плодов 23–24 нед гестации маркированные нейроны распределялись следующим образом: SATB2+ превалировали в верхней части корковой пластинки, CTIP2+ и FOXP1+ – в ее нижней части. Количественная оценка SATB2+, CTIP2+ и FOXP1+ клеток показала, что самая высокая плотность CTIP2+ ядер обнаружена на глубине 660–990 мкм предцентральной области коры и 425–920 мкм – височной. Максимум FOXP1+ ядер установлен на глубине 600–1000 мкм предцентральной коры и 400–950 мкм – височной. Максимальная плотность SATB2+ нейронов установлена на глубине 200–650 мкм предцентральной и 95–600 мкм височной областей (рис. 3). Зоны распределения всех трех маркеров перекрываются, поэтому для определения границ слоев мы ориентировались на те уровни, в которых плотность ИГХ+ нейронов была максимальна. По компактному расположению SATB2+, CTIP2+ и FOXP1+ элементов установлены предполагаемые границы цитоархитектонических слоев на препаратах, окрашенных по Нисслю (рис. 4). Дальнейшее исследование проводили с учетом назначенных границ слоев еII-еVI корковой пластинки. Дополнительно оценивали количество иммунофлуоресцентных ядер нейронов относительно общей численности всех ядер, окрашенных DAPI, в каждом из слоев обеих исследованных областей. В предцентральной области максимальное количество FOXP1+ элементов отмечено в глубокой части слоя еV и в слое еVI, где оно достигало 12%, а в слое еII и субпластинке снижалось до 3%; максимум CTIP2+ клеток установлен в слое еV – 5%, в слое еIII и еVI – сокращался до 3%; численность SATB2+ нейронов в слое еIII достигала 13% и падала до 6% в слоях еII и еVI. В верхней височной области максимум FOXP1+ элементов отмечен в слое еV и пограничном уровне слоя еVI, где он составил 8%, а в слоях еII и еVI снижался до 3%; численность CTIP2+ ядер в слоях еV и еVI была одинакова и составила около 5%, сокращаясь до 1% в слоях еII и субпластинке; численность SATB2+ нейронов в слое еIII достигала 12%, падала до 6% в слоях еII и еVI. Таким образом, выделение слоев по численному доминированию нейрохимически однородных клеток возможно даже тогда, когда цитоархитектонические признаки слоев еще не выражены.

Рис. 3.

Количество иммунопозитивных клеток на разных уровнях коры дорcолатеральной предцентральной (а) и верхней височной (б) областей полушарий мозга человека 23–24 нед гестации. По оси Х – толщина коры в мкм. По оси Y – количество иммунопозитивных клеток.

Fig. 3. The distribution of immunopositive cells at different levels of the cortex of the dorso-lateral precentral (а) and superior temporal (б) regions of the cerebral cortex of a human fetus at 23–24 weeks of gestation. X-axis is the thickness of the cortex (mkm). Y-axis is the number of immunopositive cells.

Рис. 4.

Стратификация коры дорсо-латеральной предцентральной области полушарий мозга человека 23–24 нед гестации по локализации иммунопозитивных нейронов и при окраске по Нисслю. Обозначения: MZ – маргинальная зона, eII – слой II, eIII – слой III, eV – слой V, eVI – слой VI корковой пластинки, SP – субпластинка.

Fig. 4. Stratification of the dorso-lateral precentral cortex of the fetus at 23–24 weeks of gestation by the localization of immunopositive neurons and by Nissl staining. Designations: MZ – marginal zone, eII – layer II, eIII – layer III, eV – layer V, eVI – layer VI of the cortical plate, SP – subplate.

В возрасте 25–26 нед гестации стратификация кортикальной пластинки в верхней височной и предцентральной областях коры практически не усложнялась по сравнению с описанным выше сроком 23–24 нед. На препаратах, окрашенных по Нисслю, отмечено утолщение коры до 1550 ± 28 мкм в предцентральной и до 1150 ± 18 мкм в височной областях. На материале этого возраста не удалось получить высококачественных результатов иммуногистохимической обработки с антителами к слой-специфичным транс-крипционным факторам. Несмотря на то что локализация SATB2+, CTIP2+ и FOXP1+ элементов была сходной со сроком 23–24 нед гестации в обеих областях коры, интенсивность реакции и плотность иммунопозитивных ядер нейронов оказались низкими, оценить их количественный состав не удалось.

Как уже отмечалось выше, те маркеры транскрипционных факторов, которые применялись в исследовании, отражают функциональную характеристику проекционных нейронов в соответствии со связями, которые формируют их аксоны – нисходящие субкорковые или корково-корковые. Морфологию таких нейронов возможно исследовать по экспрессии МАР2 – белка, ассоциированного с микротрубочками и специфичного только для нейронов (Минин, Кулик, 2004; Bennett et al., 2013). Поскольку нами предварительно были определены границы слоев кортикальной пластинки, развитие МАР2-пирамидных нейронов анализировали с учетом их залегания в определенном слое (рис. 4).

В корковой пластинке верхней височной и предцентральной областей коры мозга плодов 20–22 нед гестации МАР2-позитивные нейроны располагались компактно, образуя в предцентральной коре пласт толщиной около 170 ± 25 мкм, а в височной – около 250 ± 35 мкм. Такие МАР2+ клетки имели вытянутую округло-треугольную форму сомы, короткие, извитые неветвящиеся апикальные дендриты. В дальнейшем, вплоть до конца второго триместра, наблюдали заметное увеличение количества МАР2+ нейронов и расширение зоны поперечника, которую они занимали в корковой пластинке, до 500 ± ± 39 мкм в предцентральной и 450 ± 42 мкм в височной областях 25–26-недельных плодов. Все иммунопозитивные клетки были пирамидными, по площади профильного поля их можно было разделить на мелкие (45–90 мкм²), средние (100–190 мкм²) и крупные (200–380 мкм²). Анализ локализации нейронов, относящихся к каждому из трех размерных классов, показал, что средние и мелкие равномерно распределены по поперечнику зоны МАР2+ клеток, а крупные залегают в глубине (рис. 5).

Рис. 5.

МАР2-позитивные нейроны в коре дорсо-латеральной предцентральной области полушарий мозга человека 20 (а) и 26 (б) нед гестации. Обозначения: eIII, eV – слои III и V корковой пластинки.

Fig. 5. MAP2-positive neurons in the dorsal precentral region of the cerebral cortex of fetuses at 20 (а) and 26 (б) weeks of gestation. Designations: eIII, eV – layers III and V of the cortical plate.

После совмещения изображений срезов, окрашенных по Нисслю и обработанных ИГХ с антителами к МАР2, стало очевидным, что уровень крупных МАР2+ пирамид совпадает со слоем eV, который предварительно выделен по максимальной плотности CTIP2+ элементов, а средних и мелких МАР2+ нейронов – со слоем eIII с высокой плотностью SATB2+ ядер. Такая же очередность дифференцировки и локализация МАР2-позитивных нейронов в слоях eIII и eV характерны и для коры верхней височной области большого мозга.

Несмотря на то что мы не смогли добиться устойчивого иммуноокрашивания со всеми маркерами для каждого срока гестации и всех исследованных случаев, результаты, полученные разными методами, дополняют друг друга, подтверждая синхронность и общую закономерность стратификации верхней височной и предцентральной коры в период с 20-й по 26-ю неделю гестации.

Ключевую роль в регуляции начальных этапов стратификации коры выполняют клетки Кахаля–Ретциуса маргинальной зоны. В коре мозга человека строение этих нейронов, их нейрохимические характеристики изучены слабо. При этом маргинальная зона коры фетального мозга имеет сложную пространственную организацию, в связи с чем для ее исследования требуется иммуноокрашивание более толстых, чем принято обычно, срезов. С помощью такой обработки удалось выявить клетки Кахаля–Ретциуса, что подтверждается их рилин-позитивностью, помимо этого они иммунопозитивны к МАР2. Нейроны Кахаля–Ретциуса имели треугольную форму тела с площадью профильного поля от 100 до 250 мкм². От сомы клетки отходили от 3 до 5 дендритов, широко ветвящихся параллельно поверхности коры, и один нисходящий отросток, тела нейронов залегали в поверхностной части маргинальной зоны. Волоконное сплетение ниже зоны локализации клеток Кахаля–Ретциуса состояло из идущих параллельно пиальной поверхности коры взаимно пересекающихся N200+ отростков (рис. 6). Полученные результаты свидетельствуют о том, что маргинальная зона содержит те структурные компоненты – рилин-позитивные нейроны Кахаля–Ретциуса и сплетение горизонтальных волокон, которые регулируют миграцию нейробластов в кору.

Рис. 6.

Организация маргинальной зоны коры верхней височной области полушарий мозга человека 25–26 нед гестации по результатам иммунофлуоресцентного маркирования крупного (762 × 762 × 180 мкм) фрагмента ткани. (а) – клетки Кахаля–Ретциуса поверхностного уровня маргинальной зоны. (б) – волоконное сплетение глубокого уровня маргинальной зоны.

Fig. 6. Organization of the marginal zone of the temporal region of fetal cerebral cortex at 25–26 weeks of gestation, results of immunostaining of a large block (762 × 762 × 180 mkm) of tissue after optical clearing. (а) – Cajal–Retzius cells of the surface level of the marginal zone. (б) – fiber plexus of the deep level of the marginal zone.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе показано, что в течение 20–26 нед гестации две области коры полушарий мозга человека: дорсо-латеральная предцентральная вдоль центральной борозды и верхняя височная по границе с латеральной бороздой – развиваются синхронно, хотя топографически они удалены друг от друга и относятся к разным функциональным системам мозга. Этот факт подтверждает принцип регионального кортикогенеза в среднем периоде гестации (Поляков, 1937), а также ранее выдвинутое предположение о том, что первичные борозды указывают на сходство развития прилежащих к ним областей коры полушарий мозга (Zhang et al., 2013). О том же свидетельствуют особенности функционального коннектома (совокупности проводящих трактов) мозга плода человека, в котором к концу второго триместра беременности визуализируются некоторые межполушарные и субкорковые тракты (Turk et al., 2019). Авторы справедливо полагают, что становление трактов зависит от уровня развития отдельных регионов коры полушарий мозга и для полного понимания закономерностей становления связей нужны маркеры созревания нейронов.

В данной работе описаны некоторые особенности созревания неокортекса, выявленные с помощью иммуногистохимических маркеров. Установлено, что в период с 20-й по 26-ю неделю гестации в обеих исследованных областях мигрировавшие в корковую пластинку клетки избирательно синтезируют транскрипционные факторы, определяющие их положение в конкретном слое и тип проекционных связей, которые они образуют, – субкорковые или корково-корковые. В течение исследованного периода происходит утолщение коры, но преимущественная приуроченность SATB2+ нейронов к слоям eII и eIII, а FOXP1+ и CTIP2+ – к слоям eV и eVI – не изменялась. Морфология этих клеток – форма сомы, специфика дендритного древа – свидетельствует о том, что они являются пирамидными проекционными нейронами, динамика их развития, приуроченность, в зависимости от размера, к разным слоям коры подтверждают характер генерируемых ими связей – корково-корковые или субкорковые и корково-спинальные.

Помимо сведений о морфологии нейронов, иммуногистохимическое выявление МАР2 – белка, ассоциированного с микротрубочками, может служить маркером критического периода развития пирамидных клеток, в течение которого нейроны высоко чувствительны к воздействию неблагоприятных факторов среды. Основанием для такого предположения является то, что синтез МАР2 характеризует начало активного дендрогенеза и включение клетки в нейронные сети, а этому сопутствует ослабление нейропротекторных механизмов (Kaech et al., 1996; Fontaine-Lenoir et al., 2006). Гибель нейронов в коре мозга у человека как результат осложненной беременности не доказана, но патологические последствия развития олигодендроцитов и активности нейроглии у детей с проблемами периода внутриутробного онтогенеза, включая недоношенность, известны (Кудряшова и др., 2019; Shaw et al., 2021). Очевидно, что судьбы нейронов и глии неразрывно связаны, а это позволяет анализировать возможность маркирования критического периода развития нейронов по состоянию элементов цитоскелета. Согласно результатам настоящего исследования, в корковой пластинке предцентральной и височной областей коры полушарий мозга первые МАР2+ пирамидные клетки отмечены у 20-недельных плодов в слое eV, к 26-й неделе формируются нейроны слоя eIII, а это предположительно указывает на то, что критические сроки развития нейронов слоев eIII и eV приходятся на разные периоды гестации.

Правомерность выдвинутого предположения о критических сроках развития нейронов подтверждают исследования И.А. Журавина и соавт. (Vasilev et al., 2016). Исследователи доказали, что постмитотическая дифференцировка проекционных нейронов энторинальной коры полушарий мозга крыс происходит на 14-м и 18-м дне эмбриогенеза. Экспериментальная гипоксия в эти дни приводила к тому, что в первый месяц после рождения плотность пирамидных нейронов в коре мозга крысят снижена по сравнению с контрольными животными.

С широким внедрением в клиническую практику методов МРТ-диагностики появились убедительные факты избирательных повреждений кортикоспинальных и межполушарных трактов коры полушарий, вызванных неблагоприятными факторами внутриутробного развития. Так, генез детского церебрального паралича, который считают олицетворением детской неврологии, обусловлен проблемами пренатального периода развития, в том числе недоношенностью (Ермолина и др., 2016). Дефицит моторного поведения у этих детей коррелирует с замедленным созреванием, нарушением структуры и траектории кортикоспинального тракта (Papadelis et al., 2019). Гораздо шире, согласно данным МРТ, распространены отклонения в структуре межполушарных связей, которые чаще всего описывают как агенезии (полное или частичное отсутствие) или гипоплазии (недоразвитие) мозолистого тела (Bekiesinska-Figatowska et al., 2017; Koerte et al., 2018; Lieb, Ahlhelm, 2018). Выраженные гипоплазии мозолистого тела часто обнаруживают у детей, развивавшихся в измененных условиях гестации, например, рожденных женщинами с гипотиреозом, с фетальным алкогольным синдромом и недоношенных (Lebel et al., 2008; Samadi et al., 2008; Tkachenko et al., 2008). Оценка демографических факторов риска развития агенезий и гипоплазий мозолистого тела у детей, клинически значимой и относительно частой категории нарушений развития мозга, свидетельствует о том, что одной из главных причин является недоношенность плода (Glass et al., 2008). Гипоплазии мозолистого тела часто дополняют пороки развития кортикоспинальных трактов при ДЦП (Краснощекова и др., 2016; Back et al., 2001).

Описанные нарушения проводящих трактов – пирамидного и мозолистого тела – согласуются с высказанным предположением о критических периодах развития проекционных нейронов слоев eV и еIII коры полушарий мозга человека в конце второго триместра внутриутробного онтогенеза.

Новизна полученных в настоящей работе результатов очевидна, и они лишь отчасти подтверждают данные ранее выполненного исследования по пренатальному развитию предцентральной области коры мозга человека (Saito et al., 2011).

ВЫВОДЫ

1. В период с 20-й по 26-ю неделю внутриутробного развития в предцентральной и верхней височной областях коры полушарий нейроны, идентифицированные по экспрессии транскрипционных факторов, приурочены к разным слоям корковой пластинки: SATB2-позитивные – к слоям eII, eIII, FOXP1-позитивные и CTIP2-позитивные – к слоям eV, eVI.

2. Во втором триместре внутриутробного развития в корковой пластинке предцентральной и верхней височной областей коры полушарий мозга человека пирамидные нейроны, идентифицированные по экспрессии белка, ассоциированного с микротрубочками (МАР2), появляются в слое eV у 20-недельных, в слое eIII – у 26-недельных плодов.

3. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что две топографически удаленные области коры полушарий мозга человека – предцентральная и верхняя височная – развиваются синхронно.

Работа выполнена на оборудовании ресурсного центра молекулярных и клеточных технологий (МиКТ) Научного Парка СПбГУ (Проект № 109-306).