Физиология растений, 2022, T. 69, № 5, стр. 480-489

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день известно 26 токсикогенных видов из рода Pseudo-nitzschia [1], в том числе P. calliantha. Все эти виды привлекают внимание как источники домоевой кислоты − нейротоксина, принадлежащего к гетероциклическим аминокислотам и вызывающего амнезическое отравление моллюсками (ASP – amnesic shellfish poisoning) [2, 3]. В отличие от других морских токсинов, она является полярным пренилированным производным пролина и вызывает повреждение и гибель нервных клеток в результате гиперактивации глутаминовых рецепторов центральной нервной системы [4]. В период быстрого увеличения численности токсикогенных водорослей домоевая кислота способна накапливаться и передаваться по пищевым цепям [5]. Наступление периодов “цветения” циклично [6] и, очевидно, тесно связано с важнейшими биологическими характеристиками видов: жизненным циклом и половым воспроизведением [7].

Жизненный цикл P. calliantha изучен достаточно хорошо [8–11]. Как и у других представителей класса Bacillariophyta, он состоит из двух основных фаз. В период вегетативной фазы клетки делятся митотически. Затем, при достижении клетками определенных размеров, наступает генеративная фаза, в течение которой возможно половое воспроизведение, сопровождающееся гаметогенезом, оплодотворением, формированием ауксоспор и инициальных клеток. Следствием является появление новых поколений вегетативных клеток [12–14].

В настоящее время в литературе сообщается о 53 видах Pseudo-nitzschia [15], большинство из которых близкородственны и мало различимы при определении видовой принадлежности с использованием световой микроскопии. Результаты молекулярно-генетического анализа также зачастую недостаточны для доказательства расхождения видов, как в случае различающихся морфотипов, так и у криптических видов [16–19]. Существует несколько критериев вида [20]. В рамках биологической концепции вида [21] основным сущностным критерием видообразования является утрата возможности генетического обмена вследствие появления репродуктивной изоляции. Методы репродуктивной биологии, в первую очередь экспериментальное скрещивание клонов, позволяют на практике определить видовые границы.

Морская диатомовая токсикогенная водоросль P. calliantha имеет широкий современный ареал. Она встречается в Арктике (например, у острова Гершель), на Европейском побережье Атлантики, в Черном море и других местах [9, 10, 22–26]. В связи с широким распространением P. calliantha возникает вопрос о конспецифичности популяций, удаленных друг от друга на тысячи километров [27].

Цель работы – установление наличия или отсутствия репродуктивной изоляции между географически удаленными популяциями, представленными штаммами, по своему морфотипу относящимися к P. calliantha.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлась планктонная пеннатная диатомовая водоросль Pseudo-nitzschia calliantha Lundholm, Moestrup & Hasle (рис. 1а, б). Для получения материалов в 2017–2019 гг. отбирались планктонные пробы из следующих мест: у побережий Юго-Восточного и Юго-Западного Крыма (г. Керчь, восточная оконечность мыса Опук, 45°02′54 с.ш., 36°14′58 в.д.; Карадагская бухта, 44°54′48 с.ш., 35°14′05 в.д.; бухта Львиная, 44°91′11 с.ш., 35°20′56 в.д.; бухта Ласпи, 44°24′44 с.ш., 33°42′57 в.д.; Севастопольская бухта, 44°37′00 с.ш., 33°31′37 в.д.; Каламитский залив, 45°09′51 с.ш., 33°28′07 в.д.; озеро Донузлав, 45°18′44 с.ш., 33°00′56 в.д.), Вьетнама (бухта Халонг 20°54′00 с.ш., 107°12′00 в.д.) и Канарских островов (остров Тенерифе 28°01′40 с.ш., 16°35′33 в.д.) (рис. 2). Из проб, доставленных в лабораторию, микропипеточным способом [28] с использованием инвертированных оптических микроскопов Nib-100 и Bif-100 (Китай) выделены одиночные клетки, давшие начало клоновым культурам. Измерение клеток производили на микроскопе Biolar PI (“PZO”, Польша) с помощью окулярной линейки, калиброванной по объект-микрометру. Фотографии сделаны при помощи микроскопа NIB-100 и фотокамеры Canon PowerShot A95 (“Canon”, США). Электронные фотографии панцирей получены на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) Carl Zeiss LIBRA-120 (“Carl Zeiss Group”, Германия). Для изучения морфотипов клоновых культур изготовлены постоянные препараты панцирей, залитые высокопреломляющей средой [29].

Рис. 1.

Pseudo-nitzschia calliantha, клетки клона 8.0123-G: а ‒ общий вид клеток, световая микроскопия, масштаб линейки 1.1 мкм; б ‒ фрагмент створки, показывающей фибулы и штрихи, трансмиссионная электронная микроскопия, масштаб линейки 2 мкм.

Рис. 2.

Для получения материала отобраны планктонные пробы из следующих мест: 1 – Крым (юго-восточное и юго-западное побережья), 2 ‒ Вьетнам (бухта Халонг), 3 ‒ Канарские острова (остров Тенерифе).

Культуры содержали в стеклянных чашках Петри диаметром 10 см и колбах Эрленмейера объемом 100 мл в изолированном помещении с постоянной температурой 20 ± 2°C при естественном освещении от окон с северной стороны. Для смешанных посевов использовали стеклянные чашки Петри диаметром 5 см. В качестве культуральной среды применяли модифицированную искусственную среду ESAW [30]. Пересев в свежую среду осуществляли с периодичностью 10 дней. Скрещивание производили в среде с соленостью 36‰. Для адаптации черноморские штаммы за две недели до начала экспериментов были переведены в среду с указанной соленостью. Для определения содержания домоевой кислоты (ДК) культуры наращивали в колбах Эрленмейера объемом 500 мл. Концентрацию ДК в культурах измеряли методом конкурентного иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов ASP direct cELISA kit (“Biosence laboratories AS”, Норвегия). Пробоподготовку и анализ выполняли в соответствии с рекомендациями производителя [31]. Предел обнаружения метода cELISA составлял 0.003 мг · кг^–1, предел количественного определения − 0.011 мг · кг^–1.

В образцах культур, находящихся в стационарной фазе роста, была определена суммарная концентрация токсина в пересчете на единицу объема культуры и его внутриклеточная концентрация. Перед анализом подсчитывали количество клеток диатомей в пробе, используя световой микроскоп (СМ) Olympus BX 41 (Япония). Клетки в аликвотах объемом 50 мл разрушали ультразвуком в течение пяти минут с помощью ультразвуковой установки Branson Sonifer 450 (“Branson Ultrasonics Corp.”, США) мощностью 100 Вт с использованием зонда диаметром 1 см при охлаждении на льду в течение 2–4 мин. Затем проверяли разрушение клеток под СМ. При необходимости повторяли процедуру. Полученную пробу фильтровали через одноразовый шприцевой фильтр (Millex-GS Sprise Filter Unit, размер пор 0.22 мкм, “Merck Millipore”, Германия) для удаления клеточного мусора. Фильтрат до проведения анализа хранили при температуре –20°C. Измерения оптической плотности растворов выполняли с помощью микропланшетного фотометра BioTek ELx800 (“BioTek”, США) при длине волны 450 нм. Внутриклеточную концентрацию (пг · кл^–1) рассчитывали путем деления суммарной концентрации ДК (пг · мл^–1) на количество клеток в миллилитре в соответствующих образцах.

Тотальная ДНК была выделена из моноклоновых культур с помощью раствора для выделения ДНК InstaGene™ Matrix Bio-Rad (США), согласно методике производителя. Амплификацию фрагментов гена rbcL хлоропластной ДНК (номер доступа в Генбанке 68648857) проводили с помощью ПЦР, используя готовую смесь реактивов ScreenMix (“Евроген”, Россия) и пару праймеров rbcL66+ (5'-TTAAGGAGAAATAAATGTCTCAATCTG-3') и rbcL1255 – (5'-TTGGTGCATTTGACCACAGT-3') [32]. Амплификация региона хлоропластной ДНК была проведена при следующих условиях: начальная денатурация – 5 мин при 95°C, далее 35 циклов денатурации при 94°C (30 с), отжига праймеров при 57°C (30 с) и элонгации при 72°C (90 с), и финальной элонгации при 72°C (5 мин). Контроль результатов ПЦР осуществляли путем горизонтального электрофореза продуктов амплификации в 1.5% агарозном геле в 1.5х трис-ацетатном буфере, pH 7.6 (1х буфер: 40 мМ трис, 1 мМ EDTA, уксусная кислота, вода) с последующим окрашиванием SYBR Safe (“Bio-Rad”, США) и фотографированием в УФ-свете в системе гель-документации GelDoc XR (“Bio-Rad”, США). Очистка фрагментов ДНК была произведена с помощью ExoSAP-IT kit (“Thermo Fisher Scientific”, США) согласно протоколу производителя. Для реакции секвенирования применяли набор BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (“Applied Biosystems”, США) с использованием сначала прямого, а затем обратного праймеров, указанных для ПЦР. Очистку продуктов реакции секвенирования от непрореагировавших меченых нуклеотидов осуществляли с помощью набора BigDye XTerminator TM Purification Kit (“Applied Biosystems”, США). Определение нуклеотидных последовательностей проводили методом Сэнгера в двух направлениях при помощи прямого и обратного праймеров, указанных для ПЦР, с последующим электрофорезом с использованием генетического анализатора Genetic Analyzer 3500 (“Applied Biosystems”, США). Полученные последовательности были проверены вручную, собраны и выровнены с помощью алгоритма ClustalW со стандартными параметрами в программе MegaX [33]. Последовательности гена rbcL для исследованных нами штаммов депонированы в базу данных Генбанк под номерами OM223068–OM223073. Для получения массива данных из Генбанка были взяты 54 последовательности гена rbcL хпДНК различных видов рода Pseudo-nitzschia. Две последовательности Nitzschia palea (Kützing) W. Smith были выбраны в качестве внешней группы. После финального редактирования общий массив данных содержал 62 последовательности по 845 п.н. каждая. Далее в программе MEGA X для имеющегося набора данных была определена модель нуклеотидных замен (GTR+G+I), и на ее основе проведен филогенетический анализ методом максимального правдоподобия (ML) с использованием 1000 бутстреп-повторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На протяжении 2018 г. было проведено несколько десятков экспериментов по скрещиванию клонов из разных популяций: черноморской, тихоокеанской и атлантической. Половое воспроизведение наблюдали как внутри отдельных популяций: черноморской и вьетнамской, так и при межпопуляционных скрещиваниях (табл. 1). За 4-летний период наблюдений внутриклонового воспроизведения не отмечали, что говорит о вероятной облигатности гетероталлического пути в системе скрещивания этого вида.

Как и у большинства других видов Pseudo-nitzschia, в смешанных посевах сексуально совместимых штаммов клетки, участвующие в половом воспроизведении, образуют гаметангиальные пары. В гаметангиальных клетках формируются по две гаметы. Все гаметы морфологически неразличимы. При этом обе гаметы мужского гаметангия активны, способны к перемещению. Плавно перетекая, они сливаются с гаметами женского гаметангия. Формируются зиготы. Растущие ауксоспоры и инициальные клетки параллельны друг другу и перпендикулярно прикреплены к панцирям родительских клеток (рис. 3).

Рис. 3.

Этапы процесса полового воспроизведения сексуально совместимых штаммов P. calliantha: а, б – клетки гаметангии с прикрепленными к ним зиготами; в – растущими ауксоспорами; г – инициальными клетками; а, б, в ‒ масштаб линейки – 1.1 мкм; г – масштаб линейки – 0.7 мкм.

Филогенетическое дерево, построенное на основании полиморфизма фрагмента гена rbcL хпДНК, показывает схожесть черноморских штаммов P. calliantha (озеро Донузлав и бухта Львиная) и девяти штаммов из Генбанка, выделенных из Адриатического моря (Триестский залив, побережье Италии и Словении). Нуклеотидные отличия в хлоропластном гене репродуктивно совместимых вьетнамского и черноморских штаммов оказались крайне незначительными (одна нуклеотидная замена). Такое же незначительное расхождение можно отметить для черноморских штаммов и штамма AL-117 из Тирренского моря (номер в Генбанке DQ813825). Адриатический штамм PS 12 (LR594650) отличался на четыре нуклеотида (рис. 4). Несмотря на незначительное число, нуклеотидные замены в гене rbcL у P. calliantha влияли на аминокислотную последовательность кодируемого белка. Таким образом, в изменчивой области аминокислотной последовательности у вьетнамского штамма 7.1230-B лейцин был заменен на фенилаланин. Однако этот признак нельзя назвать апоморфным, так как данная замена встречается и у других штаммов рода Pseudo-nitzschia.

Рис. 4.

Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия на основании сравнения 60 нуклеотидных последовательностей гена rbcL хпДНК представителей рода Pseudo-nitzschia. В обозначениях ветвей дерева указаны видовые названия, названия штаммов, номера в Генбанке и места обитания. Значения бутстрепов указаны только для узлов, поддержанных более чем на 50%.

Для определения токсикогенной активности выполнен иммуноферментный анализ (ELISA/ИФА), который показал относительно высокую концентрацию домоевой кислоты в крымских клоновых культурах P. calliantha (табл. 2). Из 15 изученных штаммов в таблице представлены те, у которых внутриклеточное содержание домоевой кислоты оказалось выше 0.003 пг · кл^–1. Наибольшая концентрация ДК (0.063 пг · кл^–1) наблюдалась в черноморском штамме 7.0804-Si5.

ОБСУЖДЕНИЕ

Изученные аллопатрические популяции P. calliantha разделены большими расстояниями. Между Черным и Южно-Китайским морями около 8 тыс. км, между Черным морем и Канарскими островами более 4.5 тыс. км, между Канарскими островами и Южно-Китайским морем около 12.5 тыс. км. Несмотря на удаленность популяций, между ними отсутствует биологический репродуктивный барьер, по крайней мере, нет презиготической изоляции в первом поколении. Такой обширный ареал говорит о космополитизме этого вида, о чем сообщают и другие авторы [18, 34]. Примеры отсутствия репродуктивной изоляции между удаленными популяциями известны также для других видов из рода Pseudo-nitzschia, в частности вида P. pungens [27, 35].

P. calliantha можно считать эвригалинным видом, у него достаточно широкая толерантность к солености (18–40‰ в наших экспериментах). При этом наблюдения за клоновыми культурами показали, что черноморские штаммы с повышением солености нарастали лучше, чем в “родной” для них среде 18‰. Вьетнамские и канарские штаммы, напротив, в среде с пониженной соленостью практически переставали делиться, что приводило к слабому нарастанию культур. Можно предположить, что изначально океанический вид P. calliantha, распространяющийся течениями, попав в новое для него место обитания (Черное море в постэвксинский период), был способен адаптироваться к изменившимся условиям. Различия условий местообитания популяций делают возможным изменения некоторых экофизиологических характеристик, как в случае с P. pungens [36]. Даже если допустить наличие экофизиологических различий между изученными популяциями P. calliantha, можно констатировать, что они не столь значительны для появления репродуктивных барьеров и расхождения видов.

Большинство изученных видов рода Pseudo-nitzschia двудомны, для них характерно гетероталлическое половое воспроизведение. Гомоталлизм впервые отмечен у P. brasiliana [37]. Это единственное описание полового процесса, протекавшего в моноклоновой культуре. В литературе встречаются требующие дополнительных исследований предположения о возможном гомоталлизме у представителей этого рода [8, 9].

Как отмечалось выше, вид P. calliantha токсичен. Высокая концентрация ДК, обнаруженная в черноморском клоне 7.0804-Si5, согласуется с соответствующими данными (0.10 пг · кл^–1) для изолятов P. calliantha из прибрежных вод Канады, где этот вид был определен как основной источник накопления ДК мидиями и другими моллюсками [38]. Необходимо заметить, что культивируемые на двух разных средах черноморские клоны P. calliantha показали различающиеся значения токсичности: в среднем 0.14 пг · кл^–1 в среде Гольдберга и 0.43 пг · кл^–1 в среде F/2 [39]. У P. pungens, еще одного токсикогенного вида, встречающегося в Черном море, внутриклеточная концентрация ДК в изученных штаммах (0.10–0.23 пг · кл^–1) оказалась более высокой, сходной с данными для этого вида из прибрежных вод Новой Зеландии (0.47 пг · кл^–1) [40].

Согласно директиве Евросоюза 2002/225/ЕС, максимально допустимая концентрация ДК в моллюсках, употребляемых в пищу, не должна превышать 20 мкг · г^–1 моллюсков. Полученное нами для культур водорослей значение 19 мкг · мл^–1 может указывать на потенциальную угрозу загрязнения моллюсков домоевой кислотой у берегов Крыма.

Работа выполнена в рамках государственного задания Карадагской научной станции им. Т. И. Вяземского – природного заповедника Российской академии наук – филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Институт биологии южный морей имени А. О. Ковалевского Российской Академии наук” “Изучение фундаментальных физических, физиолого-биохимических, репродуктивных, популяционных и поведенческих характеристик морских гидробионтов”, номер госрегистрации 121032300019-0. Иммуноферментный анализ содержания токсина в культурах выполнен в рамках государственного задания ННЦМБ Дальневосточного отделения Российской Академии наук “Динамика морских экосистем, адаптации морских организмов и сообществ к изменениям среды обитания”, номер госрегистрации 121082600038-3, с использованием оборудования Центра коллективного пользования (ЦКП) “Морской биобанк”. Электронные фотографии получены с использованием оборудования ЦКП “Дальневосточный центр электронный микроскопии”. Молекулярно-генетический анализ осуществлен в Институте физиологии растений имени К. А. Тимирязева Российской Академии наук в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, номер госрегистрации 121041200194-7.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.