Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2023, T. 59, № 3, стр. 145-167

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Появление 2–2.5 миллиарда лет назад цианобактерий, способных к оксигенному фотосинтезу, который сопровождается выделением кислорода (O₂), привело к возрастанию его концентрации в атмосфере. В этих условиях увеличился внутриклеточный уровень активных форм кислорода (АФК). Живые организмы приспособились к сосуществованию с АФК, разработали стратегии, позволяющие использовать их в различных физиологических процессах, оптимизировали аэробный энергетический метаболизм и развили механизмы нейтрализации токсичных АФК [1]. Наличие абиотических фотохимических процессов позволяет предполагать, что даже более ранние формы жизни, предшествующие цианобактериям, могли обладать системами метаболизма O₂/АФК и антиоксидантной защиты [2]. Клетки тканей с высоким уровнем метаболизма и энергетическими затратами имеют высокий уровень внутриклеточных АФК и приобрели в ходе эволюции хорошо развитую систему антиоксидантной защиты (АОЗ). К таким клеткам относятся, в частности, клетки ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и фоторецепторы сетчатки, которые подвергаются воздействию света и обладают интенсивным метаболизмом [3]. Удовлетворение энергетических потребностей фоторецепторов требует усиленного потребления O₂, поступающего в сетчатку через сеть капилляров сетчатки или капилляров сосудистой оболочки [4]. Интенсивность аэробных процессов в сетчатке, приводящих к выработке большого количества АФК, вызвала необходимость формирования специализированного интенсивно пигментированного слоя клеток РПЭ, способного к активной нейтрализации АФК и предотвращению окислительного стресса (ОС). РПЭ образует плотные контакты с наружными сегментами фоторецепторами сетчатки, участвуя в создании иммунной привилегии сетчатки, и взаимодействует с сосудистой оболочкой глаза [5]. Со стороны сосудистой оболочки РПЭ подстилает мембрана Бруха (МБ), в состав которой входят компоненты эндотелия сосудистой оболочки, богатой капиллярами, и уплотненного фибриллярного слоя собственно базальной пластинки РПЭ [6]. МБ участвует в регуляции диффузии биомолекул (протеогликанов, хемокинов, цитокинов, факторов роста, токсичных продуктов жизнедеятельности) между фоторецепторами, РПЭ и сосудистой оболочкой. Комплекс фоторецепторы-РПЭ-MБ-сосудистая оболочка обеспечивает формирование гематоретинального барьера (ГРБ) [7].

РПЭ играет центральную роль в обеспечении функционирования сетчатки, осуществляя фагоцитоз дисков наружных сегментов фоторецепторов и защиту фоторецепторов от избытка света, поддержание баланса рН и ионов в субретинальном пространстве, доставку в нейральные слои сетчатки метаболитов (глюкоза, аминокислоты), продукцию факторов роста [8]. Регуляция баланса окислительно-восстановительных реакций, постоянно протекающих в РПЭ и фоторецепторах, обеспечивает контроль процессов пролиферации, гибели, дифференцировки клеток РПЭ на протяжении всего онтогенеза [7]. Поддержание стабильного состояния дифференцировки клеток РПЭ имеет решающее значение для функционирования сетчатки. Структурные, метаболические и генетические нарушения в РПЭ и пограничных тканях, под воздействием экзогенных или эндогенных факторов, сопровождающиеся накоплением избытка АФК, ведут к активации ОС [9], который является важным звеном в патогенезе дегенеративных патологий сетчатки [10].

В процессе эволюции в организмах сформировались сложные системы АОЗ, которые представлены несколькими уровнями регуляции (звеньями), обеспечивающие снижение уровня АФК и их негативных последствий. Системы АОЗ предусматривают использование репаративных механизмов для восстановления поврежденных структур, в числе которых аутофагия РПЭ и ремоделирование поврежденных белков [11].

Несмотря на прогресс в понимании механизмов, роль факторов АОЗ в регуляции гомеостаза клеток и стратегиях клеточного ответа РПЭ, а также связь этих факторов с другими эндогенными защитными регуляторными системами у позвоночных охарактеризованы далеко не полностью. Существуют эволюционно закрепленные видовые отличия реакции клеток РПЭ на ОС у позвоночных. Клеточный ответ РПЭ позвоночных на повреждение и воспаление, сопровождающихся нарушением ГРБ, баланса окислительно-восстановительных реакций и активацией ОС, может вызвать как развитие патологических процессов в нейронах и глии сетчатки (у млекопитающих), так и обеспечить их восстановление (у ряда хвостатых амфибий) [12]. Изучение роли ОС и АОЗ в клеточном ответе РПЭ хвостатых амфибий заслуживает особого внимания, поскольку эти животные, в отличие от млекопитающих, способны к трансдифференцировке РПЭ в нейроны и глию сетчатки, а также к структурному и функциональному восстановлению слоя РПЭ после повреждения [13]. Отдельные сведения о роли ОС в пигментированных клетках эпителия радужки – источника для регенерации хрусталика у хвостатых амфибий, получены на уровне анализа изменений транскриптома. Конверсия пигментный эпителий-хрусталик сопровождается активацией редокс-чувствительных генов: Hmox1, Fam213a, Erg1, Serpinb10 и др. [14].

В обзоре проведен анализ накопленных с использованием современных подходов данных о молекулярно-генетических механизмах регуляции окислительно-восстановительного метаболизма и стабильности клеток РПЭ позвоночных. Особое внимание уделено обсуждению роли в системе АОЗ ключевых ОС-зависимых факторов транскрипции Nrf2, с точки зрения консерватизма и эволюционной вариабельности. Высказано предположение о том, что разный ответ клеток РПЭ на действие ОС, у позвоночных с высокими или ограниченными регенерационными способностями, обусловлен особенностями эндогенных систем защиты, в частности, системы АОЗ.

ЭКЗОГЕННЫЕ И ЭНДОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ

Воздействие экзогенных факторов (избыточный свет, ионизирующее излучение, высокие температуры, гипоксия, химические вещества, механическое повреждение) обусловливает высокий риск окислительного повреждения РПЭ и фоторецепторов [15–18]. Смена светового режима влияет на pH, концентрацию ионов Ca²⁺ и K⁺, увеличивает потребление кислорода, вызывая генерацию АФК в этих клетках [19]. В РПЭ и нейральных слоях сетчатки относительно высокое парциальное напряжение кислорода обеспечивает синтез АТФ в митохондриях. При этом более 90% O₂ восстанавливается до H₂O, а 1–5% O₂ участвуют в образовании АФК. Эндогенными источниками АФК, помимо митохондрий, являются мембранно связанные NADPH-оксидазы (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX), лизосомы (фагосомы), пероксисомы, меланосомы [20–22].

Эндогенные факторы предрасположенности РПЭ к ОС включают высокую скорость метаболизма и окислительных реакций в РПЭ и фоторецепторах. В сетчатке постоянно обновляются внешние диски фоторецепторов: слущивающиеся “отработанные” диски, мембраны которых содержат большое количество полиненасыщенных жирных кислот (ПЖК), утилизируются в РПЭ [20]. В процессе зрительного цикла происходит изомеризация 11-цис-ретиналя в транс-ретиналь в составе родопсина и продуцируются АФК, которые вызывают перекисное окисление ПЖК [23, 24], накопление липофусцина (ЛФ) [21], окисление (обесцвечивание) меланина, выполняющего защитную роль, за счет активного участия в “нейтрализации” АФК, в первую очередь, синглетного кислорода [22]. В большинстве случаев поврежденные под действием ОС в РПЭ клеточные компоненты деградируют и заменяются вновь синтезированными в результате репаративной аутофагии [25]. В постмитотических клетках РПЭ интенсивность повреждения зависит от степени аутофагии, накопления продуктов клеточного распада. Возрастные изменения, связанные с накоплением и депонированием ЛФ в лизосомах, являются значимым фактором риска развития ОС-зависимых патологий РПЭ [26]. Метаболические нарушения, приводящие к накоплению ионов Н⁺ и снижению рН в РПЭ, являются общей характеристикой апоптотических стимулов, связанных с депривацией цитокинов или усилением генерации АФК. В условиях ОС возрастает фагоцитарная нагрузка клеток РПЭ, что проявляется в повышении интенсивности фагоцитоза апоптотических фрагментов и утилизации продуктов метаболизма МБ [20].

Разобщение контактов РПЭ с фоторецепторами при отслойке сетчатки, действии ультрафиолета, светового облучения, значительно увеличивает накопление в РПЭ продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [27]. Процессы свободнорадикального окисления при нарушении целостности и гомеостаза РПЭ усиливаются, что, в совокупности с факторами воспаления, нарушает работу регуляторных и ферментных систем [28]. Эти процессы вызывают накопление продуктов окисления (малоновый диальдегид, 4-гидроксиноненаль, конечные продукты гликолиза), повреждение липидов клеточных мембран, белков и нуклеиновых кислот [20]. ОС нарушает общий клеточный гомеостаз клеток РПЭ, затрагивает большинство внутриклеточных процессов и взаимодействие с окружающими тканями (фагоцитоз, аутофагия, транспорт метаболитов) (рис. 1). Деструктивная активность АФК в клетках проявляется в окислении белков, мембранных липидов, повреждении ДНК [29]. В клетках РПЭ происходит накопление и нарушение метаболизма остаточных молекулярных компонентов, их экспорта, из-за высвобождения лизосомальных ферментов в цитозоль, что приводит к снижению экранирующей и антиокислительной функций РПЭ и является пусковым звеном дегенеративных процессов [10].

Рис. 1.

Клеточные процессы в ретинальном пигментном эпителии и пограничных с ним тканях млекопитающих, при окислительном стрессе. Внутриклеточными мишенями являются липиды, белки, ДНК, повреждение которых отражает интенсивность окислительного стресса и степень поражения клеток. Условные обозначения: RPE – retinal pigment epithelium, DNA – deoxyribonucleic acid, ECM – extracellular matrix.

Клеточные процессы, контролирующие продукцию и элиминацию избыточного количества АФК, обеспечивают реализацию функций клеток РПЭ и фоторецепторов [21, 26]. Важная роль в контроле состояния клеток принадлежит окислительно-восстановительным процессам, равновесию между прооксидантной и антиоксидантной системами [10]. Это равновесие обеспечивается активностью сигнальных белков, ферментов, редокс-чувствительных генов, которые контролируют синтез ДНК, проницаемость мембранных каналов и другие процессы, направленные на поддержание стабильности гомеостаза клеток [30, 31]. Сдвиг равновесия в РПЭ в сторону окислительных процессов ведет к ОС, дисфункции РПЭ и фоторецепторов [10].

Большинство генов, мутации в которых приводят к ОС-зависимым патологиям сетчатки, кодируют факторы транскрипции с высокой и специфической экспрессией в РПЭ и фоторецепторах. Такие мутации могут вызывать интенсификацию накопления ЛФ в РПЭ, приводить к снижению числа или полному отсутствию меланосом, дезорганизации МБ и внеклеточного матрикса (ВКМ) [12, 26].

ПРООКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА И ИСТОЧНИКИ АФК В РЕТИНАЛЬНОМ ПИГМЕНТНОМ ЭПИТЕЛИИ

Прооксидантная система, компоненты которой вовлечены в развитие ОС, включает различные виды АФК (супероксидный анион ${}^{\centerdot }{\text{O}}_{2}^{ - }$, гидроксильный радикал ·OH, синглетный кислород ¹O₂, перекись водорода H₂O₂), низкомолекулярные прооксиданты (ионы переходных металлов Mn, Fe, Cu), а также специализированные ферменты, которые генерируют АФК (NADPH-оксидаза, NO-синтаза, ксантиноксидаза) [29, 32] (рис. 2).

Рис. 2.

Эндогенные системы (антиоксидантная и др.), обеспечивающие поддержание гомеостаза и защиту клеток ретинального пигментного эпителия млекопитающих от экзогенных и эндогенных факторов окислительного стресса. Интенсификация окислительных процессов приводит к развитию ОС, патологическим процессам и гибели клеток. Условные обозначения: 1 – фоторецепторы, 2 – ретинальный пигментный эпителий (RPE), 3 – меланосомы, 4 – ядро, 5 – липофусцин, 6 – друзы, 7 – мембрана Бруха, 8 – хориокапиляры сосудистой оболочки. SOD – superoxide dismutase, CAT – catalase, GPX – glutathione peroxidase, PRDX – peroxiredoxin; ROS – reactive oxygen species, ·OH – hydroxyl radical, ¹O₂ – singlet oxygen, ${}^{\centerdot }{\text{O}}_{2}^{ - }$ – superoxide, H₂O₂ – hydrogen peroxide, NO – nitric oxide. DNA – deoxyribonucleic acid.

Супероксидные анионы ^•O₂ возникают в клетках РПЭ и сетчатки как продукт цепи окислительного фосфорилирования митохондрий при синтезе АТФ [33], а в цитозоле – в результате активности NADPH-оксидаз [34]. NADPH-оксидазная система генерирует ^•O₂ и H₂O₂, участвующие в нейтрализации патогенов [35]. У большинства млекопитающих идентифицированы 7 изоформ NADPH-оксидаз: NOX1–5 и DUOX1–2 [36]. Уже на ранних этапах эволюции произошла дивергенция на кальций-регулируемые NOX (NOX5, DUOX1-2), являющиеся наиболее “древними” и консервативными, и NOX, активируемые регуляторными субъединицами (NOX 1–4). NOX2 и NOX4 присутствуют у всех позвоночных, NOX1 появляется у рыб и амфибий, а NOX3, очевидно, является самым “молодым” членом семейства, обнаруженным только у птиц и млекопитающих [37]. Источником фотоиндуцированной генерации супероксидных анионов ^•O₂ в РПЭ служит ЛФ, который при облучении видимым светом (преимущественно в синем диапазоне) восстанавливает молекулы кислорода O₂ до ^•O₂ [38], которые, как предполагается, инициируют процесс деградации меланина [39, 40]. Гидроксильный радикал ·OH может продуцироваться лизосомами, в результате радиолитического расщепления воды, или образования пероксинитрита (ONOO^–), в результате реакции между супероксид-ионом ${\text{O}}_{2}^{ - }$ и оксидом азота NO. Синглетный кислород ¹O₂, который образуется в результате фотосенсибилизации и возбуждения молекул ЛФ, рибофлавина или ретиналя, также является разрушительным метаболитом, который, как и ·OH, агрессивен, но не стоек, и быстро реагирует с разными клеточными компартментами [41].

Органеллами, специализирующимися на метаболизме перекиси водорода H₂O₂, также являются пероксисомы, содержащие FAD-оксидоредуктазы (флавинадениндинуклеотид зависимые оксидоредуктазы), которые участвуют в бета-окислении ПЖК. В пероксисомах образуются ацетил-КоА ацилтрансфераза (ACOX), альдегидогенные фосфолипиды (плазмалогены) и желчные кислоты, а в качестве побочных продуктов – H₂O₂, которая утилизируется каталазой [42]. Фермент ACOX появляется у эукариот, известно, что у человека он представлен тремя изоформами (ACOX1-3) [43].

При накоплении продуктов перекисного окисления в РПЭ со стороны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) развивается реакция на неструктурируемый белок, направленная на восстановление протеостаза. При избыточном накоплении окисленные формы белков теряют свойственную им структуру и агрегируют, что может приводить к дополнительной активации стресса ЭПР. Накопление агрегированных белков усугубляет ОС, вызывая разрыв лизосом и развитие реакций воспаления [44]. Повреждение РПЭ и сетчатки, действие АФК (Н₂О₂) вызывают секрецию АТФ, активацию АТФ-зависимых Са²⁺-каналов (P2XR7), высвобождение из внутриклеточных депо ионов Са²⁺ и усиление их транспорта в клетку. Цепь этих реакций увеличивает проницаемость мембран, вызывая набухание митохондрий, выход цитохрома C в цитоплазму [45].

Несмотря на тот факт, что АФК являются неустойчивыми соединениями, они оказывают существенное влияние на работу важных внутриклеточных ферментных систем (протеиназы, фосфатазы, фосфолипазы); обеспечивая изменения активности генов, кодирующих факторы транскрипции, и редокс-зависимых генов, которые принимают участие в контроле дифференцировки, метаболизма и пластичности клеток РПЭ [46–48]. Глобальные изменения экспрессии генов, принадлежащих к различным функциональным кластерам, затрагивают сигнальные пути, которые обеспечивают защиту клеток от ОС или контролируют гибель клеток РПЭ и сетчатки (апоптоз, некроз и др.) [49].

КЛЮЧЕВЫЕ КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ В РЕТИНАЛЬНОМ ПИГМЕНТНОМ ЭПИТЕЛИИ

Транскрипционное профилирование выявило активацию редокс-чувствительных генов, регулирующих апоптоз, аутофагию в клетках РПЭ, при развитии патологических процессов [50, 51]. Обнаружены возрастание уровня экспрессии ОС-чувствительных генов и изменение уровня экспрессии генов, обеспечивающих устойчивость к окислительным реакциям в клетках РПЭ человека, в ответ на действие перекиси водорода H₂O₂ [52].

Редокс-чувствительные факторы транскрипции. К редокс-чувствительным факторам первой линии защиты клеток в РПЭ относят факторы транскрипции Nrf2, FOXO, HSF1 и другие, которые являются сенсорами АФК и обеспечивают запуск системы АОЗ [52]. Позвоночные имеют шесть паралогичных генов, которые кодируют факторы транскрипции семейства “cap ‘n’ collar” суперсемейства лейциновой молнии (bZip). Из них четыре фактора являются активирующими (Nrf1, Nrf2, Nrf3, NF–E2), а два – ингибирующими (Bach1 и Bach2) [53]. Центральную роль в активации системы АОЗ, наряду с белками теплового шока, играет фактор транскрипции Nrf2 (Nuclear factor E2 p45-Related Factors) [54]. Nrf2 контролирует экспрессию антиоксидантных, противовоспалительных и целого ряда метаболических генов [55]. Появление Nrf2 связывают с глобальным переходом от анаэробных условий обитания к аэробным. Ортологи Nrf2 появились у предков грибов около 1.5 млрд лет назад. Первая дивергенция Nrf2 произошла во время разделения грибов и Metazoa (1.0–1.2 млрд лет назад). Уровень атмосферного O₂ постепенно возрастал во второй половине палеозойской эры (359–252 млн лет назад), в конце этого периода произошла очередная дивергенция Nrf2, сопровождающая появление и эволюцию млекопитающих [56].

Nrf2 имеет в своем составе 7 консервативных доменов Neh1-Neh7. Домен Neh1 содержит два сайта: “cap ‘n’ collar” – щелочную область лейциновой молнии (bZIP), которая обеспечивает связывание с ДНК, и сигнал ядерной локализации. N-концевой домен Neh2 содержит 7 остатков лизина, участвующих в убиквитинировании, и два мотива (ETGE и DLG), которые обеспечивают связывание с Keap1. Neh3, Neh4 и Neh5 являются трансактивационными доменами, которые опосредуют взаимодействие Nrf2 с другими коактиваторами (CBP, CREB-binding protein). Neh5 отвечает за цитоплазматическую локализацию Nrf2 [57]. Neh6, обогащенный остатками серина, обеспечивает связывание с белком, включающим бета-трансдуциновые повторы, содержащие дипептиды триптофана и аспарагиновой кислоты (WD-повторы), что ведет к убиквитинированию Nrf2 и его деградации [58]. Neh7 взаимодействует с ретиноидным Х-рецептором-α (RXR-α), что блокирует сигнальную ось Nrf2-ARE [59].

Древний белок Nrf2 вместо 7 доменов, характерных для млекопитающих, по-видимому, имел всего три домена: Neh1, -3 и -6, а также область связывания с ЭПР. Такая структура Nrf2 сохранилась у современной гидры. Домен Neh2, обеспечивающий связь с Keap1, появился у триплобластов (многоклеточные животные, начиная с плоских червей). У вторичноротых появляются домены Neh4 и Neh5. В то же время у нематоды (Caenorhabditis elegans) Nrf2 теряет большинство исходных доменов, включая C-концевую часть домена Neh1, который обеспечивает связь с ДНК. С появлением позвоночных в Nrf2 окончательно сформировались шесть функциональных доменов (Neh1-Neh6), тогда как был утрачен домен, обеспечивающий локализацию белка в ЭПР [54].

Фактор транскрипции Nrf2 является одним из ключевых факторов регуляции ОС у позвоночных. Ортологи Nrf2 обнаружены у представителей всех классов позвоночных, причем степень их идентичности – наиболее высокая в пределах класса, и минимальная у наиболее удаленных эволюционно классов позвоночных (рис. 3).

Рис. 3.

Филограмма ортологов Nrf2, построенная методом ближайших соседей на основе базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/).

Филогенетический анализ доменов Nrf2 показывает, что домены Neh1 (обеспечивает связывание фактора с ДНК) и Neh2 (ответственен за взаимодействие с Keap1) являются наиболее консервативными (идентичность не менее 70%) у всех классов позвоночных (от древнего класса лопастоперых рыб, представителем которых является латимерия, до человека). Домены Neh3-Neh6 демонстрируют вариабельность у низших позвоночных (амфибии, рыбы), а домен Neh7, ответственный за взаимодействие с RXR-α, эволюционирует, по-видимому, наиболее быстро: у рыб его сходство с человеком не превышает 27%, у птиц – 41%, у яйцекладущих млекопитающих (утконос) – 33% (табл. 1).

Рис. 4.

Филогенетический анализ ортологов фактора транскрипции Nrf2 позвоночных. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей фактора транскрипции Nrf2 позвоночных выполнено с помощью алгоритма CrustalO из пакета программ Unipro UGENE (ver. 45.00). Консервативные аминокислотные остатки выделены синим цветом, интенсивность метки пропорциональна степени консервативности. Границы доменов (Neh1-Neh7) даны в соответствии с [57] и выделены прямоугольными рамками.

Рис. 4.

Окончание

В норме Nrf2 находится в неактивном состоянии в комплексе с Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1). В результате активности CUL3-E3 (Cullin 3-based ubiquitin ligase) Nrf2 подвергается поли-убиквитинированию и деградации протеасомами. ОС вызывает конформационные изменения Keap1, высвобождая Nrf2, который фосфорилируется, мигрирует в ядро клетки, где образует комплекс с факторами транскрипции Maf [60]. Этот комплекс индуцирует экспрессию ряда генов, взаимодействуя с их цис-регуляторными последовательностями – антиоксидантными реагирующими элементами (Antioxidant Response Elements, ARE) [61].

Регуляторная ось Keap1-Nrf2-Maf является эволюционно консервативной и обнаружена у всех видов, от Drosophila melanogaster до человека [61]. Nrf2 активирует в РПЭ как антиоксидантные, так и противовоспалительные сигнальные каскады [62, 63]. Под контролем Nrf2 находятся гены, регулирующие энергетический метаболизм, репарацию ДНК и детоксикацию. Nrf2 связывается с промоторными областями генов, кодирующих цитопротекторные белки, в частности, гемоксигеназу-1 (НО-1) [64]. Мыши с нокаутом Nrf2 демонстрируют снижение аутофагии клеток РПЭ, с ярко выраженными признаками возрастной макулярной дегенерации сетчатки (ВМД) [65]. В свою очередь, экспрессия Nrf2 регулируется в РПЭ фактором транскрипции, ассоциированным с микрофтальмией (Mitf) [66], который действует как антиоксидант, регулируя биогенез митохондрий и окислительно-восстановительный гомеостаз в РПЭ [30].

Факторы транскрипции Nrf1 и Nrf3, по-видимому, возникли в ходе дивергентной эволюции Nrf2, и функционируют независимо от Keap1. Они локализованы в ЭПР и участвуют в защитной реакции на неструктурированный белок. Гены, содержащие ARE, могут быть активированы также факторами транскрипции EP300 и CREB [67]. С другой стороны, существуют репрессоры факторов транскрипции Nrf (Bach1, Bach2), которые предотвращают избыточную активацию системы АОЗ [68]. Среди редокс-чувствительных факторов транскрипции, принимающих участие в регуляции метаболизма и аутофагии, важную роль в РПЭ играют PPAR, CREB, TFEB, FOXO1/3, FXR [69], а также регуляторные белки ATG7 и Beclin-1 [70]. Биоинформационный анализ позволил выявить потенциальные ARE в ряде генов, участвующих в АОЗ клеток позвоночных [71], в частности, у представителей семейства PITX/Pitx, кодирующие факторы транскрипции [72–74].

Антиоксидантные ферментные системы защиты включают ферменты, нейтрализующие, и восстанавливающие АФК (рис. 2). ОС индуцирует экспрессию ферментов фазы II метаболической детоксикации: хинон-акцепторную оксидоредуктазу, гемоксигеназу-1 (НО-1), каталитическую субъединицу (GCLC) и субъединицу-модификатор глутамат-цистеин лигазы (GCLM) [75, 76].

Действие света или H₂O₂ вызывают активацию в РПЭ и сетчатке таких ферментов АОЗ как супероксиддисмутазы (SOD), пероксиредоксины (PRDX), каталазы (CAT), глутатионпероксидазы (GPX) [77–79]. SOD – металлофермент, который катализирует превращение ${}^{\centerdot }{\text{O}}_{2}^{ - }$ в H₂O₂. С использованием генетических моделей млекопитающих (мышей) показано, что мутации SOD1^–/– и SOD2^–/– обусловливают высокую восприимчивость к ОС, патологическую неоваскуляризацию и дегенерацию сетчатки [80, 81]. Основной функцией PRDX является восстановление пероксидов (H₂O₂, алкилгидропероксиды и др.) в результате окисления тиоловой группы (R-SH) цистеина в активном центре этого фермента до сульфоновой кислоты (R-SOH) [77]. CAT превращают H₂O₂, которая образуется в результате β-окисления жирных кислот в пероксисомах, в воду и кислород. В РПЭ содержание CAT на порядок выше, чем в других тканях глаза [82]. GPX является ферментом, “нейтрализующим” H₂O₂ при низком уровне ОС. У млекопитающих описано 7 изоформ GPX. GPX4 широко представлен у позвоночных, обладающих развитой нервной системой и имеющих ПЖК в составе плазматических мембран. GPX4 содержит в своем составе селеноцистеин и катализирует расщепление H₂O₂ до H₂O в цитозоле или восстановление гидроперекисей липидов в спирты, используя глутатион в качестве восстанавливающего агента [79]. Снижение активности GPX4 в РПЭ и фоторецепторах повышает их чувствительность к ОС [83].

Еще одна группа ферментов (дегидрогеназы, липазы, пептидазы, протеазы, трансферазы, ферменты репарации ДНК) участвуют в восстановлении или элиминации поврежденных биомолекул в РПЭ [43, 84]. АФК, генерируемые в РПЭ через электронно-транспортную цепь под воздействием света, кислорода, окислительного фосфорилирования, могут восстанавливаться с помощью систем NADPH, глутатиона и антиоксидантных ферментов [77, 79]. NADPH-оксидазы участвуют в регуляции клеточных сигнальных каскадов – наиболее изученный механизм их действия – окисление редокс-активных цистеинов в активном центре протеинфосфатаз. Показано участие протеинтирозинфосфатазы 26 (PTPN26) в фосфорилировании белков-компонентов сигнальных путей, управляющих пролиферацией, гибелью, дифференцировкой, метаболизмом клеток РПЭ [85].

Компоненты антиоксидантной защиты с функциями шаперонов и хелаторов ионов металла. Важным аспектом, негативно влияющим на стабильность клеток РПЭ, является нарушение метаболизма железа, накопление которого токсично для клеток и связано со снижением аутофагии и эффективности хелатирующих агентов [86]. В РПЭ функцию фотозащиты и антиоксиданта, нейтрализующего АФК, выполняет меланин, посредством хелатирования редокс-активных ионов железа и меди, связывания свободных радикалов (главным образом, синглетный кислород ¹O₂) [87]. Меланин взаимодействует с анионами ^•O₂, вызывая их окисление в молекулярный кислород, а также способен восстановливать ^•O₂ до H₂O₂ [88]. Присутствующий в РПЭ железосвязывающий цитозольный и митохондриальный ферритин хелатирует и “нейтрализует” ионы железа, которые способны катализировать образование гидроксильного радикала ·OH, снижая их концентрацию [89].

Другим эндогенным белком с металлосвязывающими свойствами является металлотионеин (Мт), который содержит большое количество остатков серина и активируется, помимо ОС, глюкокортикоидами и ионами тяжелых металлов, такими как цинк, медь и ртуть, действуя в качестве “поглотителя” свободных радикалов [90]. Эволюция форм Мт, также как и SOD, непосредственно связана с появлением в земной атмосфере свободного кислорода. У млекопитающих число изоформ Мт достигает максимума, появляются две дополнительные группы Мт, специфичные для нейральной ткани и многослойных слущивающихся эпителиев [91].

В клетках РПЭ конститутивно экспрессируются шапероны: DJ-1 [92], антиоксидант/шаперон α-1 микроглобулин, связывающий АФК [93], низкомолекулярные шапероны (sHSP). Основная роль шаперонов состоит в предотвращении внутриклеточного накопления цитотоксических белков и регуляции фолдинга белков [94]. sHSP обнаружены во всех доменах живых организмов и, по-видимому, эволюционировали независимо у многоклеточных животных (Eumetazoa), грибов и растений. sHSP содержат эволюционно консервативный домен α-кристаллинов и вариабельные N- и C-концевые последовательности, которые эволюционировали независимо друг от друга. α-кристаллины препятствуют апоптозу клеток РПЭ, участвуя в активации реакций фосфорилирования в сигнальном пути PI3K/Akt, что обеспечивает устойчивость клеток РПЭ к ОС. αB-кристаллин обеспечивает восстановление уровня GSH в митохондриях [79]. У мышей с нокаутом генов αA- и αB-кристаллинов в условиях ОС наблюдали накопление АФК клетками РПЭ и последующую дегенерацию фоторецепторов [95, 96]. В геноме человека, кроме αA- и αB-кристаллинов, представлены еще восемь sHSP. ОС вызывает снижение уровня АТФ в клетках РПЭ и сетчатки, в числе первых защитных факторов начинают действовать АТФ-независимые sHSP. Активация HSPB1 (HSP27) приводит к блокаде Ca²⁺-индуцируемого апоптоза в результате ингибирования каспазы-3 и предотвращения выхода цитохрома С из митохондрий в цитоплазму [97]. После частичного восстановления клеток включается экспрессия индуцируемого стрессом АТФ-зависимого шаперона HSP70, который поддерживает окислительно-восстановительный гомеостаз, путем восстановления активности GPX и глутатионредуктазы. Снижение уровня глутатиона при ОС ведет к накоплению продуктов ПОЛ и гибели клеток путем ферроптоза [98]. HSP70 также участвует в регуляции опосредованного аутофагией протеолиза белков в РПЭ [99].

Шаперон HSP70 и близкий ему белок HSP110 являются наиболее эволюционно консервативными. Процент идентичности гомологов белков этих семейств у прокариот и эукариот достигает 50%. У человека насчитывается 13 генов HSP70, причем два из них видоспецифичны и отсутствуют у других позвоночных. В геноме ряда рыб обнаружены множественные копии генов HSP70, что, очевидно, является следствием дупликации генома [100].

Низкомолекулярные антиоксиданты включают жирорастворимые и водорастворимые. Жирорастворимые антиоксиданты (α-токоферол, убихинон кофермент Q10, витамин A, каротиноиды) локализуются в основном в мембранах митохондрий и лизосом, обеспечивая защиту липидов от перекисного окисления, за счет прерывания автокаталитической реакции ПОЛ [98, 101]. Водорастворимые антиоксиданты (витамин С, глутатион, флавоноиды) локализуются в цитозоле, где они действуют как “поглотители” АФК. Витамин C необходим для поддержания метаболизма ионов железа, обеспечения восстановления Fe³⁺ до Fe²⁺ [102]. Большинство позвоночных способны синтезировать витамин C из глюкозы в печени (млекопитающие), в почках (рыбы, амфибии, рептилии). Однако некоторые млекопитающие (человек, морская свинка, летучие мыши) утратили способность к синтезу витамина C [103].

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕССОМ, И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МИШЕНИ В РЕТИНАЛЬНОМ ПИГМЕНТНОМ ЭПИТЕЛИИ

Наиболее стабильные виды АФК (H₂O₂, оксид азота) служат посредниками в межклеточной передаче сигналов, фосфорилировании белков, метаболизме нуклеотидов [104]. Под влиянием умеренного ОС в РПЭ и фоторецепторах активируются сигнальные пути АОЗ, тогда как интенсивный и продолжительный ОС запускает сигнальные пути запрограммированной гибели клеток, формы которой (апоптоз, пироптоз, ферроптоз, некроптоз) превалируют в той или иной степени, в зависимости от интенсивности ОС и степени деструкции клеток [48, 105]. Апоптоз и пироптоз наблюдаются у всех многоклеточных, хотя могут обеспечиваться различными сигнальными путями. Наиболее “молодой” формой гибели клеток является некроптоз, который появляется у млекопитающих [106].

Факторы стресса могут вызывать апоптоз с использованием внешнего или внутреннего сигнальных путей. Каспаза-зависимые сигнальные пути, как внешний, так и внутренний, вовлечены в начальные стадии развития ОС в РПЭ. Внешний (рецептор-зависимый) апоптоз в РПЭ может запускаться двумя типами рецепторов на плазматической мембране: FAS (CD95) и рецепторами фактора некроза опухоли (TNFR1), которые активируют сигнальные каскады, с участием каспаз [107]. Внутренний путь апоптоза инициируется повреждением клеток, с высвобождением цитохрома С из пермеабилизированных митохондрий. Оба пути активируют эффекторный протеолитический фермент каспазу-3 [106]. Количество генов, кодирующих каспазы, варьирует у разных видов [108].

Ключевые ОС-зависимые сигнальные пути апоптоза в клетках РПЭ опосредованы каскадами протеинкиназ: JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/Stress activated protein kinase), p38, ASK1 (Apoptosis signal-regulating kinase 1), PKC (Protein kinase C) [48, 109]. Процессы ПОЛ в РПЭ человека значительно усиливаются при гипоксии, часто сопровождающей ОС. В перинуклеарном пространстве происходит накопление HIF-1α, NF-kB, синтез VEGF, каспазы-3 и поли(АДФ-рибоза)-полимеразы, что связано с развитием апоптоза [17, 110].

Среди всех АФК наиболее изучено действие на клетки РПЭ экзогенной H₂O₂. В нескольких работах показано, что Н₂О₂ в физиологическом диапазоне концентраций (1 нМ до 0.1–0.5 мкМ) действует как сигнальная молекула, активирует рецептор-зависимую стимуляцию пролиферации клеток, опосредованно оказывая влияние на экспрессию генов [110, 111]. Низкие концентрации H₂O₂ индуцируют в РПЭ чувствительные к ОС сигнальные пути, в которые вовлечены факторы транскрипции Nrf2, Keap1 и активируемые ими антиоксидантные ферменты, что приводит к стимуляции пролиферации и увеличению жизнеспособности клеток [112].

Более высокие концентрации H₂O₂ вызывают умеренный ОС в РПЭ, сопровождаемый воспалительными реакциями с участием NF-kB и AP-1 [110] и гибелью клеток путем пироптоза. Обработка клеток РПЭ человека in vitro H₂O₂ в течение 24 ч индуцирует мобилизацию кальция, усиленную продукцию провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, фосфорилирование белков p38, MAPK, ERK, JNK и ICAM-1, перинуклеарное накопление фактора транскрипции NF-κB, продукцию HIF-1α [111].

Сильно выраженный ОС вызывает накопление продуктов ПОЛ (акролеин и др.), нарушение целостности и деполяризацию мембран митохондрий, стимулирует продукцию АФК поврежденными митохондриями [105]. Развивающиеся молекулярные процессы в РПЭ и фоторецепторах сетчатки на фоне накопления продуктов гликолитического распада и полиолов связаны с нарушениями функций Nrf2, мембранных транспортеров и митохондрий, что ведет к апоптозу или некроптозу клеток [113]. Избыточная продукция АФК (H₂O₂) повышает активность кальциевой АТФазы в РПЭ и нейронах, приводит к снижению внутриклеточного и возрастанию внеклеточного уровня АТФ [114], активации пуринорецепторов P2RX7, индуцирует приток внеклеточного Ca²⁺ в клетку. Ca²⁺ активирует окислительные ферменты (DUOX1, NADPH-оксидазу), стимулируя быстрый выброс H₂O₂. Эти процессы сопровождаются снижением активности глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), активацией сигнального пути с участием PKC, приводят к подщелачиванию лизосом, накоплению ЛФ, образованию друз, содержащих окисленные формы липопротеинов, повышают уязвимость клеток РПЭ к ОС, вызывая их гибель по пути апоптоза или некроза [115].

Существует перекрестная связь между митохондриями и лизосомами при апоптозе клеток РПЭ, вызванном ОС. Пермеабилизация мембран лизосом (ПМЛ) является ранним событием во многих случаях апоптоза. Высвобождаемые лизосомальные ферменты пермеабилизуют мембраны митохондрий, что еще более усиливает продукцию АФК и ПМЛ [99]. Если ПМЛ не является триггерным событием апоптоза, этот процесс индуцируется на более поздних стадиях несколькими механизмами, усиливающими сигналы гибели клеток. Процесс опосредован действием высвобождаемых катепсинов, участвующих в каспаза-независимом сигнальном пути апоптоза клеток РПЭ. На линии клеток ARPE-19 человека показано, что окислительный стрессор 7-кетохолестерол индуцирует стресс ЭПР, каспаза-зависимый апоптоз в результате использования опосредованных рецепторами сигнальных путей с участием каспаз-8 и -12 [116]. При этом в клетках РПЭ не было выявлено активации митохондриального пути апоптоза, с участием каспазы-9, что, как предполагается, может объясняться возрастанием активности белков теплового шока, препятствующих расщеплению (активации) каспазы-9 во время инициации апоптоза [95, 117]. Каспаза-12 в неактивном состоянии локализуется на цитозольной поверхности ЭПР, при ОС она запускает каскад реакций, приводящий к активации эффекторной каспазы-3 [116].

В экспериментах, моделирующих в РПЭ ОС действием H₂O₂, с использованием нокдауна и/или специфических блокаторов, обнаружена роль ряда генов, участвующих в регуляции аутофагии. В клетках ARPE-19, обработанных ингибитором внутриклеточных регуляторов рН и обмена ионов Na⁺/H⁺ (5-N, N-гексаметилен)-амилоридом (HMA), происходит активация этого процесса. Применение ингибиторов протеасом стимулирует процесс аутофагии клеток РПЭ, в результате ингибирования сигнального пути PI3K-Akt-mTOR [118, 119]. Предполагается, что индукция аутофагии может быть общей реакцией клеток РПЭ и важным механизмом, обеспечивающим их устойчивость и стабильность в условиях умеренного ОС [105]. Другим аспектом действия H₂O₂ является усиление секреции клетками РПЭ трансформирующего фактора роста TGFβ, который стимулирует продукцию ангиогенного фактора роста сосудов VEGF и нейротрофического фактора TNFα [120, 121]. Накопление в РПЭ окисленных фосфолипидов усиливает ATF4-зависимую секрецию VEGF, опосредованную протеинкиназой CK2 [122].

Механизмы действия ОС на дифференцировочный статус клеток РПЭ включают множественные сигнальные пути, которые используют общие компоненты и могут действовать антагонистически. В настоящее время наиболее эффективными стратегиями восстановления функций РПЭ при различных дегенеративных заболеваниях остаются стратегии, направленные на мобилизацию эндогенных защитных систем клеток, которые обеспечивают предотвращение ОС и преодоления его последствий [123–125]. Возможные способы стабилизации функционального состояния клеток РПЭ нацелены на акцепторы АФК, восстановление метаболизма пограничных тканей (фоторецепторов, сосудистой оболочки), стабилизацию МБ. Особого внимания, в связи с этим, заслуживает регуляция важных звеньев системы АОЗ, в которых участвует Nrf2 [112, 113].

Предлагаемые стратегии терапии патологий, ассоциированных с ОС-зависимым эпителиально-мезенхимным переходом (ЭМП) в РПЭ, направлены на прямую нейтрализацию АФК с помощью экзогенных антиоксидантов [126, 127], подавление продукции АФК путем снижения экспрессии прооксидантных генов и активности ферментов прооксидантной системы, активацию аутофагии, образование аутолизосом [52, 128], индукцию экспрессии антиоксидантного фактора транскрипции Nrf2 [64, 75, 76, 112], активацию HO-1 [126], SIRT-1 [129], GPХ, SOD и CAT [130–133], регуляцию редокс-чувствительных микро РНК [134, 135], использование хелаторов железа [136].

Молекулярными мишенями для терапии ОС могут являться NADPH-оксидазы, фактор эндотелия сосудов VEGF, под влиянием которого усиливается продукция АФК NADPH-оксидазами [137], каспаза-3 [138], индуцируемый гипоксией фактор HIF-1α [139]. Ингибиторы протеасом стимулируют аутофагию клеток РПЭ, в результате блокирования сигналов PI3K-Akt-mTOR [119]. Стимуляция пуринорецепторов A2AR обеспечивает поддержание баланса между АТФ и аденозином в РПЭ, постоянство уровня cAMP и рН лизосом, препятствует избыточному накоплению ЛФ [140, 141]. Активация металлопротеиназ MMP-14 и TIMP2 [142], сигнального пути ERK/CREB [143], сигналов, запускаемых через рецепторы TLR3 (Toll-like receptor 3) защищает клетки РПЭ от негативного действия H₂O₂ [144]. Действие азапептидных лигандов направлено на поддержание процесса аутофагии и восстановление окислительно-восстановительного гомеостаза РПЭ [133, 145].

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И СТРАТЕГИИ ОТВЕТА КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ

Ранние события при нарушении целостности РПЭ при повреждении или патологии у позвоночных в ответ на ОС универсальны, характеризуются развитием реакций воспаления, направленных на защиту и выживание клеток. Разобщение связи РПЭ и фоторецепторов приводит к изменению полярности клеток РПЭ, ремоделированию МБ и плотных контактов, реорганизации ВКМ, интерфоторецепторного матрикса, цитоскелета, в норме обеспечивающих стабильное состояние клеток. Нарушение барьерных функций РПЭ сопровождается усилением продукции АФК. Эти изменения нарушают баланс факторов микроокружения РПЭ, вызывая повышение продукции проокислительных и снижение противовоспалительных факторов [19, 146].

Важным аспектом изменений межклеточных взаимодействий РПЭ, сопровождаемых ОС, является проявление свойств пластичности клеток РПЭ [5, 146]. У млекопитающих ОС, возникающий при разобщении контактов РПЭ и фоторецепторов (отслойка сетчатки), является триггером дедифференцировки клеток РПЭ [12], запуска их конверсии по пути возникновения мезенхимного фенотипа и фиброзной ткани [13]. В то же время у хвостатых амфибий разобщение связи РПЭ и фоторецепторов запускает трансдифференцировку (конверсию) клеток РПЭ в фенотип нейронов и глии. В итоге происходит восстановление структуры и функций как всех слоев сетчатки, так и собственно слоя РПЭ (редифференцировка) [147]. В тканях этих животных большинство процессов, часто рассматриваемых с точки зрения физиологии как разрушительные и направленные на защиту клетки (реакции воспаления, иммунный ответ, гибель клеток, продукция АФК, активация белков стресса), могут выполнять позитивную роль в регенерации. Так, АФК рассматриваются в качестве ведущих кандидатов для триггерных сигналов активации и поддержания регенерации тканей у хвостатых амфибий [148, 149]. При повреждении мозга у взрослых тритонов в ткани присходит запуск репаративного нейрогенеза, необходимого для компенсации погибающих нейронов. Однако интенсивность этого процесса снижается при ингибировании продукции АФК [149]. Ранее полученные на модели регенерации аксонов нейронов у рыб сведения свидетельствуют в пользу предположения о позитивной роли H₂O₂ в регенерации [150]. Данные цитируемых работ позволяют выдвинуть предположение о том, что низкие концентрации АФК могут быть использованы животными, обладающими высокими способностями к регенерации, для активации программ восстановления ткани. В частности, они могут быть задействованы в механизмах замещения утраченных нейронов из эндогенных клеточных резервов, путем трансдифференцировки клеток РПЭ у хвостатых амфибий. Предполагается, что возникшие в ходе эволюции ОС-зависимые механизмы защиты РПЭ способствуют предотвращению патологического ЭМП клеток РПЭ у хвостатых амфибий, в отличие от млекопитающих. Разные стратегии поведения клеток РПЭ позвоночных, в ответ на действие ОС, могут находить объяснение в особенностях сигнальных путей (доменной организации ключевых компонентов и их экспрессии), формирующих защитные системы клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Длительная эволюция в аэробных условиях привела к развитию систем защиты, которые обеспечивают адаптацию позвоночных к условиям среды обитания и клеточный ответ на действие стресса [151, 152]. Дисфункция РПЭ под действием эндогенных или экзогенных факторов, сопровождаемая нарушениями межклеточных взаимодействий и окислительно-восстановительного баланса, может вызывать изменение фенотипических свойств РПЭ (рис. 1, 2). Длительный и интенсивный ОС приводит к глобальным изменениям метаболизма клеток РПЭ, нарушению активности системы АОЗ и, в конечном итоге, к серьезным патологиям сетчатки [29, 48].

Проведенный анализ литературы позволил выявить как консерватизм, так и вариабельность основных компонентов сигнальных путей, связанных с поддержанием гомеостаза и обеспечивающих защиту клеток РПЭ от разрушительного действия ОС. Консервативность основных элементов системы АОЗ позволяет использовать модельные организмы для изучения молекулярно-генетических механизмов ОС-зависимых патологий РПЭ человека, разрабатывать стратегии их предотвращения и терапии. Ключевые эволюционно-консервативные молекулярные звенья ОС-зависимых сигнальных путей, изучаемые на моделях РПЭ экспериментальных животных и клеточных системах РПЭ человека, могут служить потенциальными мишенями для селективных ингибиторов компонентов провоспалительных сигнальных путей и ЭМП, или активации АОЗ в РПЭ [23, 27, 60]. Несмотря на прогресс в изучении механизмов ОС-ассоциированных патологий РПЭ, до сих пор не удалось разработать эффективных методов стабилизации состояния РПЭ и блокирования развития дегенеративных процессов на ранних стадиях. Во многом это обусловлено различиями метаболизма РПЭ и нейральных слоев сетчатки, многофакторностью патологий, в которые также вовлечены клетки микроокружения (иммунного звена, эндотелиоциты сосудистой оболочки) [48, 113, 125]. Идентифицированные в РПЭ молекулярные мишени, как было отмечено, могут объединять несколько  сигнальных путей, в том числе антагонистические [6, 10, 113]. Кроме того, данные, получаемые на разных модельных объектах, демонстрируют важность учета таксон-специфических особенностей структуры генома и активности регуляторных систем [106]. Филогенетический анализ ключевых ОС-связанных факторов транскрипции семейства Nrf2 [54, 57] и других компонентов АОЗ [79, 91, 100] позвоночных обнаруживает как консервативность, так и вариабельность доменной структуры кодируемых белков, что может иметь адаптационное значение к условиям среды и обусловливать различия клеточного ответа РПЭ.

Восприимчивость и устойчивость клеток РПЭ к ОС, помимо особенностей функционирования системы АОЗ, может объясняться различной степенью вклада внутриклеточных компартментов в продукцию АФК. К настоящему моменту остаются нерешенными многие вопросы, касающиеся взаимосвязи системы АОЗ с другими эндогенными системами в механизмах регуляции поведения клеток РПЭ (пластичности), в ответ на ОС (при повреждении) у позвоночных с различающимся потенциалом к восстановлению РПЭ. Это подчеркивает фундаментальную значимость изучения эволюции метаболических и сигнальных путей действия АФК, в контексте механизмов эндогенных систем защиты, с целью поиска способов обеспечения стабильности гомеостаза и дифференцировки клеток РПЭ в условиях окислительного повреждения у млекопитающих при травме и патологии.