Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2023, T. 59, № 3, стр. 223-231

ВВЕДЕНИЕ

В основе циклических проявлений жизнедеятельности находится эндогенная программа циркадианной ритмичности, нарушение которой может приводить к системной десинхронизации и к пагубным для здоровья последствиям. Для большинства живых существ временным синхронизатором служит внешний фактор – световой режим. У позвоночных животных информация о свете поступает в центральные циркадные биологические часы (супрахиазматические ядра передней части гипоталамуса, СХЯ), затем распространяется по всему организму посредством автономной нервной системы и гормона пинеальной железы – мелатонина (N-ацетил-5-метокситриптамина) [1]. Показано, что условия освещенности оказывают значительное влияние на морфологию пинеальной железы [2], которая, в свою очередь, участвует в регуляции функций физиологических систем [3, 4]. Так, в условиях стандартного светового режима LD (12 ч свет/12 ч темнота) колебания синтеза мелатонина достаточно стабильны в течение суток [5] и сохраняются, но становятся менее выраженными или нерегулярными у крыс, перемещенных из LD в режим постоянной темноты (DD) [3, 5]. Хроническое воздействие как постоянной темноты DD, так и постоянного света (LL) приводит к нарушению циркадных ритмов [1, 3, 5], снижению массы пинеальной железы [6], изменению морфологии этого органа [2], а также к тревожно-депрессивному поведению [1, 3] и к световому десинхронозу [1, 7].

На сегодняшний день существует очень ограниченное число работ, целью которых являлось изучение влияния светового десинхроноза в период беременности на циркадные ритмы физиологических систем у потомства [1, 8, 9]. В отличие от циркадной системы взрослого организма, скоординированной с циклами свет/темнота, циркадная система плода и новорожденного в значительной степени зависит от эндогенных материнских ритмов (в частности, ритма мелатонина) [8, 9]. При этом, если становление и синхронизация циркадной системы эмбриона происходят под влиянием материнских циркадианных ритмов через плацентарный барьер, то в раннем постнатальном периоде – за счет мелатонина, содержащегося в материнском молоке, и интенсивного социального взаимодействия с матерью [1, 8, 9]. Такие сигналы от матери напрямую управляют ритмами в раннем постнатальном онтогенезе до тех пор, пока у новорожденного не сформируются собственный генератор эндогенных ритмов в СХЯ и суточный ритм синтеза мелатонина пинеальной железы [4]. В организме новорожденных животных мелатонин участвует в регуляции большого количества биохимических процессов и физиологических функций (пролиферация и дифференцировка клеток, половое созревание, поведение, ритм сна и бодрствования, иммунный ответ) [9, 10]. Поэтому нарушение циркадного ритма секреции мелатонина в период беременности и в раннем постнатальном онтогенезе может привести к негативным последствиям и проявиться на более поздних сроках развития.

Пинеальная железа претерпевает в процессе онтогенеза перестройки инволютивного характера [11]. Уменьшение продукции мелатонина при старении индуцирует резистентность к инсулину, нарушение сна, метаболизма и приводит к ожирению [12]. Поэтому среди проблем физиологии очевидный интерес представляет и возрастной аспект исследования модификации циркадной ритмики физиологических систем у млекопитающих, особенно при системной десинхронизации. Анализ современных источников литературы показывает, что воздействие как света ночью, так и длительных периодов темноты, оказывает значительное влияние на эндогенные циркадные ритмы гормонов, участвующих в метаболизме липидов и углеводов у млекопитающих [1, 7]. Однако несмотря на активные исследования в этой области, недостаточно изучена роль пинеальной железы и продуцируемого ею мелатонина в регуляции пищеварительной функции, особенно в возрастном аспекте.

В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение влияния длительной (пожизненной) световой депривации, воздействие которой начиналось с периода эмбрионального развития (DD/DD) или с момента рождения (LD/DD), на возрастные изменения массы тела, кормо- и водопотребления, а также активности пищеварительных ферментов в тканях поджелудочной железы у самцов крыс.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”. Опыты проводили на крысах Вистар (самцы и самки) собственной разводки, первоначально полученных из питомника лабораторных животных “Пущино” (научно-производственное подразделение Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Московская область). Всех животных содержали в стандартных помещениях вивария Петрозаводского государственного университета площадью 25 м² в индивидуальных клетках размером 42 × 26 × ×18.5 см при температуре 23 ± 1° и влажности в диапазоне от 45 до 55%, в качестве подстилочного материала использовали древесную стружку. Крысы получали стандартный готовый лабораторный корм (РФ, ЗАО “Тосненский комбикормовый завод”, ГОСТ Р50258-92) и фильтрованную водопроводную воду без ограничений. Для разведения 4-месячных самцов и самок крыс содержали в условиях стандартного фиксированного режима освещения (12 ч света 750 лк/12 ч темноты; LD) или при постоянной темноте (0–0.5 лк, DD). После рождения потомства самок первой группы вместе с приплодом в случайном порядке разделили на две подгруппы – либо оставили при стандартном регулярно чередующемся освещении (LD; контрольные животные), либо перенесли в постоянную темноту (LD/DD). Самок и потомство, рожденное в группе DD, оставили в условиях постоянной темноты (DD/DD). Последующие исследования проводили на потомстве. Все манипуляции с животными проводились при красном свете ламп (не более 0.5 лк). В ходе эксперимента проводилось определение таких физиологических показателей, как масса тела (ежемесячно), а также с использованием метаболических клеток для лабораторных животных кормо- и водопотребление (в 6, 12 и 18 мес).

В возрасте 1, 2, 3, 6-ти, 12, 18 и 24 мес по 4 самца из каждой группы декапитировали и отбирали образцы тканей поджелудочной железы для последующего анализа. Для определения активности пищеварительных ферментов образцы тканей гомогенизировали в 2.0 мл ледяного буферного раствора (рН 6.9, состоящего из 20 мМ Na₂HPO₄ и 6.7 мМ NaCl). Гомогенаты поджелудочной железы центрифугировали при 6000 g в течение 15 мин, при 4°С. Общую протеолитическую активность определяли спектрофотометрически (спектрофотометр СФ-2000, Россия) с использованием субстрата гемоглобина – по приросту тирозина при 280 нм. Активность амилазы определяли с помощью спектрофотометра Thermo Spectronic Genesys 20 (Thermo Fisher Waltham, США), используя в качестве субстрата крахмал (концентрацию продукта комплекс крахмала с йодом измеряли при 600 нм). Липаза гидролизует трибутират глицерина до свободной жирной кислоты и глицерина. Количество продукта активности липазы (глицерина) определяли спектрофотометрически при 530 нм (спектрофотометр Thermo Spectronic Genesys 20, Thermo Fisher Waltham, США). Активность ферментов выражали в мкмоль продуктов гидролиза (для амилазы – в мг крахмала), образующихся за 1 мин в расчете на 1 г ткани [подробное описание методик см. 13].

Полученные данные обработаны общепринятыми статистическими методами, используя пакеты программ MS Excel и Prism 7, и были представлены в виде медианы (Me) и процентилей (25%, 75%) (распределение, отличное от нормального). Ввиду небольшого количества образцов использовали критерий Краскела–Уоллиса (Kruskal–Wallis H-test, непараметрический дисперсионный анализ) с post-hoc тестом по Манна–Уитни, использовали поправку на множественность сравнений FDR (false discovery rate). Различия считались статистически достоверными при p < 0.05. Взаимосвязь между исследуемыми показателями у крыс (n = 24) в разных режимах освещения анализировали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Анализ статистической мощности не производили.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние длительной световой депривации, воздействие которой начиналось с момента рождения (LD/DD), на исследуемые показатели

В результате проведенного исследования обнаружено, что крысы в режиме LD/DD в возрасте 12 мес потребляли меньше корма (H = 13.768, р < 0.05) и воды (H = 13.789, р < 0.05) по сравнению с LD (табл. 1), и масса их тела в возрасте 3 и 18 мес была минимальна среди всех исследуемых групп (значения H – 8.375 и 8.909 соответственно, р < 0.05) (рис. 1а). Помимо этого, содержание крыс в LD/DD режиме привело к изменению активности пищеварительных ферментов в поджелудочной железе в месячном возрасте (липаза, H = 11.61, р < 0.05) (рис. 1d) и с 12-месячного возраста (протеазы, амилаза и липаза) по сравнению с контролем. Так, в 6, 12, 18 и 24 мес активность протеаз была выше у животных LD/DD (рис. 1b), чем у LD (р < 0.05). При этом активности амилазы (рис. 1c) и липазы (рис. 1d) в 18 мес были ниже у LD/DD животных по сравнению с контрольными животными (р < 0.05).

Таблица 1.

Медианы значений потребления корма и воды самцами крыс линии Wistar в разных экспериментальных группах (в скобках указаны нижний и верхний квартили)

Возраст, месяц	Потребление корма в сутки, г			Потребление воды в сутки, мл
	LD	LD/DD	DD/DD	LD	LD/DD	DD/DD
6	46	43.5	35.5*	52.5	62.5	45
	(43; 50)	(34.5; 50)	(29.5; 38)	(47.5; 62.5)	(53; 68.5)	(33; 50)
12	45.5	35$\diamondsuit $	28*	49	33$\diamondsuit $	31*
	(38; 51.5)	(26; 36)	(26;32)	(41; 69.5)	(30; 40)	(29; 36)
18	43.5	40	28*	50	44	32*
	(40; 45)	(30; 49)	(25; 34)	(41; 58)	(37; 50)	(23; 36)

* Здесь и в табл. 2: LD, LD/DD и DD/DD – группы животных; $\diamondsuit $ – различия достоверны между животными LD и LD/DD (р < 0.05, критерий Краскела–Уоллиса с post-hoc тестом по Манна–Уитни, поправка FDR), * – различия достоверны между животными LD и DD/DD (р < 0.05, критерий Краскела–Уоллиса с post-hoc тестом по Манна–Уитни, поправка FDR), – различия достоверны между животными LD/DD и DD/DD (р < 0.05, критерий Краскела–Уоллиса с post-hoc тестом по Манна–Уитни, поправка FDR); в каждой группе n = 4.

Рис. 1.

Возрастная динамика изученных показателей у самцов крыс при различных световых режимах. (a) – Изменение массы тела, (b) – общей протеолитической активности, (c) – активности амилазы, (d) – активности липазы в поджелудочной железе. LD, LD/DD и DD/DD – группы животных; $\diamondsuit $ – различия достоверны между животными LD и LD/DD (р < 0.05, критерий Краскела–Уоллиса с post-hoc тестом по Манна–Уитни, поправка FDR), * – различия достоверны между животными LD и DD/DD (р < 0.05, критерий Краскела–Уоллиса с post-hoc тестом по Манна–Уитни, поправка FDR), – различия достоверны между животными LD/DD и DD/DD (р < 0.05, критерий Краскела–Уоллиса с post-hoc тестом по Манна–Уитни, поправка FDR); в каждой группе n = 4.

Влияние длительной световой депривации, воздействие которой начиналось с периода эмбрионального развития (DD/DD), на изучаемые параметры

Содержание крыс в DD/DD привело к минимальным значениям потребления корма (6, 12 и 18 мес, р < 0.05) и воды (12 и 18 месяцев, р < 0.05) (табл. 1), но при этом масса тела животных увеличивалась с 3 мес – животные в этой группе имели бо́льшие размеры тела по сравнению с LD и LD/DD в 3 (H = 8.375, р < 0.05), 12 (H = 7.449, р < 0.05) и 18 мес (H = 8.909, р < 0.05) (рис. 1a). Обнаружено, что в возрасте 6 и 12 мес общая протеолитическая активность у крыс в режиме DD/DD была выше в среднем на 20%, чем у LD-животных (р < 0.05), однако в 18 и 24 мес активность протеаз снизилась до контрольных значений (рис. 1b). Активность амилазы к 6 месяцам в DD/DD увеличилась до максимальных значений (H = 8.721, р < 0.05), но уже к 12 мес она снизилась на 40% и была ниже, чем у животных в LD (H = 9.707, р < 0.05) (рис. 1c). В 18 мес как активность амилазы (рис. 1c), так и активность липазы (рис. 1d) были ниже у DD/DD по сравнению с контрольными значениями (р < 0.05). Отмечены следующие различия между группами LD/DD и DD/DD: активность протеаз была выше у крыс в группе LD/DD, чем в DD/DD (возраст 24 мес, р < 0.05) (рис. 1b); активность амилазы в 6‑месячном возрасте была ниже (р < 0.05) у LD/DD-животных по сравнению с DD/DD (р < <  0.05) (рис. 1c).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На становление пищеварительной функции могут оказывать влияние различные факторы (голод, изменение температуры и др.) [14–16]. К таковым также стоит отнести нестандартные световые режимы, например, постоянное освещение и постоянная темнота [1, 7]. В настоящем эксперименте длительное содержание крыс в условиях световой депривации приводило к нарушению возрастной динамики массы тела животных, кормо- и водопотребления, а также активности пищеварительных ферментов в поджелудочной железе. Однако эти изменения в ответ на специфический световой режим различались в зависимости от того, на каком этапе онтогенеза начиналось его воздействие. Так, содержание крыс в LD/DD режиме привело к снижению массы тела в возрасте 3 и 18 мес и потребления корма и воды в 12 мес по сравнению с LD. При этом у животных в режиме DD/DD в возрасте 12 и 18 мес масса тела была максимальна, а потребление корма и воды было минимально среди исследованных групп (рис. 1а, табл. 1). Результаты нашего исследования частично согласуются с ранее полученными данными – в условиях DD (животные содержались в режиме с 25-дневного возраста) у самцов крыс наблюдались увеличение фазы прогрессивного роста и сниженное количество потребляемого корма по сравнению с контролем [7]. Необходимо отметить, что точно так же, как и в нашем эксперименте, в возрасте 3 мес LD/DD-крысы имели минимальную массу тела среди всех исследуемых групп [7].

В результате проведенного нами исследования у крыс во всех световых режимах обнаружены схожие возрастные изменения активности протеаз в поджелудочной железе: до 12 мес протеолитическая активность увеличивалась, что соответствует окончанию фазы стабильного роста и связано с необходимостью в пластическом материале, а затем наблюдалось постепенное ее снижение (рис. 1b). В условиях световой депривации выявлена более высокая активность протеаз (LD/DD – 6, 12, 18, 24 и DD/DD – 6 и 12 мес) по сравнению с контролем. Онтогенетические изменения активности амилазы у крыс в условиях длительной световой депривации с момента рождения (LD/DD) были сходны с группой LD. Достоверные различия между указанными группами в активности фермента отмечались только в возрасте 18 мес, в LD/DD она была ниже (рис. 1c). Значительные нарушения возрастной динамики изменения амилолитической активности выявлены в условиях DD/DD – у 6- и 24-месячных крыс этой группы активность фермента была выше, а у 12- и 18-месячных ниже, чем у контрольных животных тех же возрастов (рис. 1c). Изменение большинства показателей указывает на значительные метаболические перестройки у крыс, находившихся в темноте с момента внутриутробного развития (DD/DD), что подтверждают результаты корреляционного анализа – в DD/DD режиме часть корреляционных связей отсутствовала (табл. 2). Увеличение массы тела при уменьшении потребления пищи может являться результатом нарушения обмена углеводов. В исследовании Kang и соавт. [17] было обнаружено, что при содержании крыс в режиме DD (120 дней) наблюдаются снижение уровня инсулина и увеличение содержания глюкозы в крови по сравнению с LD. В условиях гипергликемии печень начинает активно синтезировать жирные кислоты и триглицериды, параллельно активируется липогенез в жировой ткани, что приводит к увеличению массы тела.

Обмен липидов, как и многие процессы, протекающие в организме, координируется циркадными часами, синхронизирующими функцию адипоцитов, которые, в свою очередь, способствуют липолизу в течение биологической ночи и липогенезу в течение биологического дня, таким образом, поддерживается баланс между окислением липидов и углеводов и накоплением глюкозы [18]. Нарушение работы этих часов может приводить к изменениям экспрессии ферментов, участвующих в метаболизме липидов, а также оказывать негативное воздействие на гомеостаз жирных кислот и регуляцию абсорбции липидов в течение суток [19, 20]. В нашем эксперименте возрастные изменения липолитической активности в поджелудочной железе у животных во всех экспериментальных группах носили схожий характер. Тем не менее у крыс, содержавшихся в темноте независимо от момента начала ее воздействия, активность липазы в 18 мес была достоверно ниже, чем у животных того же возраста в режиме LD (рис. 1d). Необходимо отметить, что у взрослых грызунов длительная световая депривация оказывает влияние только на период и амплитуду при сохранении ритмичности колебаний экспрессии часовых генов и генов метаболизма липидов [1, 20].

Согласно данным литературы, эффекты влияния DD на незрелую циркадную систему грызунов обширны [1]. Большинство исследований по данной тематике посвящено изучению развития структур головного мозга и физиологии поведения [21–24]. Доказано, что воздействие DD как во время эмбрионального развития, так и с момента рождения приводит к снижению нейрогенеза и числа нейронов, ответственных за связь между осцилляторами СХЯ, с последующей десинхронизацией ритмов синтеза ряда гормонов (нейропептиды и кортикостерон), развитием депрессивно-подобного поведения и снижением пространственной памяти [1, 3, 21, 22]. В результате оценки психоэмоционального состояния крыс из нашего эксперимента [25] выявлено, что световая депривация (группы LD/DD и DD/DD) вызывала увеличение уровня тревожности по сравнению с контрольными животными, при этом крысы, матери которых содержались в условиях темноты в период беременности (группа DD/DD), чувствовали себя комфортнее, и уровень их тревожности был ниже, чем у крыс в LD/DD условиях освещения. Об этом свидетельствуют более низкие значения количества реакций фризинга и актов дефекаций у крыс в DD/DD группе по сравнению с LD/DD. Вероятно, отмеченные эффекты DD/DD на поведение крыс связаны с более длительным воздействием темноты и развитием компенсаторных реакций [25]. Опираясь на эти данные, можно предположить, что крысы в LD/DD условиях были более стрессочувствительны. Ранее показано, что воздействие DD на мышей (C57BL/6J) на ранних этапах постнатального онтогенеза (10 дней) приводило к повышению экспрессии глюкокортикоидного рецептора в паравентрикулярном ядре гипоталамуса, что, в свою очередь, вызывало рост уровня активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы [26], которая является ключевым регулятором стрессовой реакции. Авторы предполагают, что световые условия, которым мышь подвергается в течение первых трех постнатальных недель (критических), оказывают долгосрочное влияние на циркадные ритмы гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы [24, 26], так как у мышей, выращенных в DD режиме (до 21 дня, потом переместили в режим LD), наблюдались повышенная концентрация кортикостерона в плазме и высокий уровень тревожности на более поздних этапах онтогенеза. Схожие данные были получены на взрослых крысах – содержание животных в условиях DD приводило к росту уровня кортикостерона в крови [3]. Длительное воздействие глюкокортикоидов вызывает различные метаболические нарушения обмена веществ [27]. Так, например, острые психогенные или системные стрессоры приводят к быстрому снижению потребления пищи и последующему истощению запасов питательных веществ у крыс [28, 29]. При этом животные теряют массу тела за счет использования питательных веществ не из жировой ткани, а из других органов [29]. Метаболически у этих крыс нарушена регуляция обмена углеводов, что является ранним признаком резистентности к инсулину [27]. Возможно, именно поэтому в нашем исследовании мы обнаружили различия между группами LD/DD и DD/DD по массе тела и потреблению корма (рис. 1, табл. 1).

Таким образом, содержание крыс в условиях световой депривации как в период эмбрионального развития, так и с момента рождения приводило к изменению изученных показателей. У крыс в LD/DD режиме отмечены более низкие значения массы тела (возраст 3, 18 мес), потребления корма и воды (12 мес), активности амилазы и липазы (18 мес) и более высокая активность протеаз после окончания стадии стабильного роста (12, 18 и 24 мес) по сравнению с контрольными животными. В DD/DD условиях у животных выявлены минимальные значения потребления корма и воды и увеличенная масса тела в возрасте 12 и 18 мес, а также максимальная активность амилазы (1 и 6 мес) и более высокая общая протеолитическая активность в период стабильного роста (6 и 12 мес) по сравнению с LD. Полученные результаты свидетельствуют о значительных метаболических перестройках у животных в условиях световой депривации и дополняют имеющиеся сведения о том, что нарушение циркадного ритма секреции мелатонина в период беременности и в раннем постнатальном онтогенезе может привести к негативным последствиям и проявиться на более поздних сроках развития [9, 10].