Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 498, № 1, стр. 279-282

ВВЕДЕНИЕ

Белок PRAME может быть мишенью для терапевтических моноклональных антител, так как экспрессируется примерно у половины больных солидными опухолями и онкогематологическими заболеваниями [1]. Кроме того, белок способен вызывать Т-клеточный иммунный ответ у пациентов [2]. Высокий уровень экспрессии PRAME в злокачественных новообразованиях позитивно коррелирует с уровнем метастазирования, негативно с общей и безрецидивной выживаемостью, и в целом связан с плохим прогнозом для пациента. [3], [4]. Следовательно, разработка иммунотерапевтических препаратов против этого антигена может быть весьма перспективной.

В настоящее время ведется или уже проведен ряд клинических исследований по таргетированию белка PRAME, в основном это либо вакцины на основе рекомбинантного белка или адаптивная терапия Т-лимфоцитами [5].

Целью данной работы было исследовать противоопухолевый эффект введения двух вариантов моноклональных антител против PRAME на модели PRAME-экспрессирующей опухоли.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В эксперименте использовали мышей линии C57BL/6, самок весом 18–20 г, возраста 7–8 нед, по 5 голов в каждой группе. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Комиссии по контролю за содержанием и использованием животных ФИБХ РАН (Протокол заседания № 117 от 18.02.2020 г.). Животным подкожно вводили клетки мышиной меланомы линии B16F10, трансфицированные плазмидой с геном PRAME и экспрессирующие соответствующий белок, либо плазмидой без гена PRAME, в дозе 5 × 10⁴ клеток на мышь (день 0). При этом за 3 дня до введения опухолевых клеток, а также на 4, 7, 14, 21-й день после введения клеток меланомы, животным внутрибрюшинно вводили в физрастворе по 300 мкг мышиных моноклональных антител против PRAME, клоны 6H8 и 5D3 [6], либо раствор без антител (рис. 1).

Рис. 1.

Схема введения антител (дни от введения опухолевых клеток). mAb – введение антител; B16F10 – введение трансфицированных клеток мышиной меланомы.

В качестве контрольного вектора использовали плазмиду pCEP4 (#V04450, Invitrogen). Плазмиду pCEP4-PRAME получали, клонируя кодирующую последовательность человеческого гена PRAME (NM_001291715.2) по сайту рестрикции NotI в плазмиду pCEP4 для высокого уровня экспрессии гена под CMV промотором. Обе плазмиды содержали ген устойчивости к гигромицину для селекции трансфицированных клеток.

Противоопухолевый эффект оценивали по измерениям размеров опухоли во всех группах. Размеры опухолей измерялись на 14, 18 и 21-й день после введения клеток. Пальпируемые узлы измеряли и рассчитывали объем по формуле [7]. В сыворотках крови определяли титр анти-PRAME антител методом непрямого ИФА в день введения клеток опухоли и на 21-й день. Для статистического анализа использовали критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн эксперимента был разработан таким образом, чтобы транзиентная экспрессия PRAME оставалась в достаточно большом проценте опухолевых клеток на весь период проведения опыта. По этой причине имплантацию опухоли проводили на фоне достаточно высокого содержания антител против PRAME в крови, которое контролировали при помощи ИФА. Средние значения титров антител в опытных группах показаны на рис. 2. Различия в фармакокинетике двух антител могут быть обусловлены их субизотипами, IgG2a для антитела 5D3 и IgG1 для антитела 6H8. Известно, что мышиный субизотип IgG2a характеризуется слабым связыванием с неонатальным Fc рецептором, ответственным за рециркуляцию антител в организме [8].

Рис. 2.

Средние значения титров антител в группах мышей, получавших терапию антителами. 5D3- и 6H8-группы мышей, привитых опухолью без экспрессии PRAME; 5D3+ и 6H8+ группы мышей, привитых опухолью с экспрессией PRAME.

Экспрессия человеческого белка PRAME в трансфицированных клетках B16F10 перед прививанием мышам была подтверждена методами иммуноблота и проточной цитометрии (данные не приведены).

Измерение размеров опухолей показало, что на 21-й день объемы опухоли, экспрессирующей человеческий белок PRAME, у мышей статистически значимо снижены при введении обоих вариантов мышиных антител к PRAME (5D3 и 6H8), р = 0.0199 по сравнению с контрольной группой без антител (рис. 3), тогда как в группах с меланомой без экспрессии человеческого PRAME введение антител не привело к подавлению роста опухоли (рис. 4).

Рис. 3.

Размер опухолевых узлов меланомы B16F10-PRAME. Контроль – без антител; 5D3, 6H8 – моноклональные антитела против PRAME.

Рис. 4.

Размер опухолевых узлов меланомы B16F10 без экспрессии PRAME. Контроль – без антител; 5D3, 6H8 – моноклональные антитела против PRAME.

Следует отметить, что скорость пролиферации линии B16F10, экспрессирующей PRAME, существенно выше скорости пролиферации той же линии, трансфицированной “пустым” вектором, не содержащим гена PRAME. Это различие наблюдается как в культивировании in vitro (данные не приведены), так и при трансплантации животным, что хорошо видно на рис. 3 и 4.

Тем не менее оба антитела оказались способными сдерживать более агрессивную PRAME- содержащую меланому B16F10. Ранее было показано [9], что антитела 6H8 и 5D3 направлены к разным неперекрывающимся участкам белка PRAME, но тем не менее каждое по отдельности способно подавлять рост опухолевых узлов. Это наблюдение придает большую привлекательность использования PRAME в качестве мишени при терапии онкологических заболеваний, поскольку уход опухоли от действия препаратов при помощи мутаций в данном случае будет затруднен.

При сравнении противоопухолевой активности двух антител необходимо учитывать разный характер их взаимодействия с FcRn в силу различий субизотипов. На мышиной модели мы видим, что антитело 6H8 более выраженно подавляет опухолевый рост по сравнению с антителом 5D3, однако это происходит на фоне большего содержания антитела 6H8 в кровотоке животных во время эксперимента. При использовании гуманизированных аналогов этих антител с одинаковыми субизотипами эти различия могут быть нивелированы. Таким образом, оба антитела являются перспективными с точки зрения разработки терапевтического препарата для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих белок PRAME.