Цитология, 2023, T. 65, № 2, стр. 131-145

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клеточные линии. Клетки глиобластомы линии A172 были получены из коллекции клеточных культур Научно-исследовательского института гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава РФ (Санкт-Петербург). Клеточная линия R1 была выделена из операционного материала пациента в Петербургском институте ядерной физики им. Б.П. Константинова национального исследовательского центра “Курчатовский институт” (Санкт-Петербург). Обе линии были охарактеризованы ранее (Киселева и др., 2016, 2017, 2018).

Культивирование клеточных линий. Клетки культивировали в вентилируемых пластиковых флаконах площадью 12.5 см², а также в 12-, 24- и 96-луночных планшетах (Jet Biofil, Китай; Sarstedt, Германия) в среде αMEM (БиолоТ, Россия), содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и 0.5% гентамицина (БиолоТ, Россия) при 37°С и 6% CO₂. Пересев клеток проводили с помощью 0.25%-ного раствора трипсина с версеном (БиолоТ, Россия).

Морфологические исследования. Клетки фиксировали ледяным карбинолом, окрашивали по Май-Грюнвальду−Гимзе и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа Nikon Diaphot, оборудованного камерами Nikon D60 и Nikon D5600 (Nikon, Япония).

Обработка клеточных линий темозоломидом. Для обработки клеток глиобластом использовали водорастворимый препарат Темодал® (Бакстер Онкология ГмбХ, Германия), действующим веществом которого является темозоломид. Непосредственно перед внесением в клеточные культуры Темодал® растворяли в деионизированной воде и стерилизовали фильтрованием. Клетки глиобластом в логарифмической фазе роста культивировали в ростовой среде, содержащей 0.1–3 мМ темозоломида, в 24-луночных планшетах в течение 24 ч, после чего дважды отмывали ростовой средой. После отмывания клетки из каждой лунки 24-луночного планшета пересевали в 12 лунок 96-луночных планшетов, считая число клеток и посевную дозу на кондуктометрическом счетчике Z1 Coulter Counter (Beckman Coulter, США). Каждые 3–4 сут после удаления препарата и пересева проводили замену 1/2 ростовой среды в каждой лунке. В течение первых 14 сут культивирования считали число клеток каждые 4–5 сут и впоследствии каждые 7 сут вплоть до 28 сут. Клетки, продолжившие или возобновившие пролиферацию после обработки препаратом, на 28 сут культивирования последовательно пересевали в лунки 24-, 12‑луночных планшетов и флаконы площадью 12.5 см². Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Время удвоения численности популяций резистентных клеток (td) рассчитывали по формуле: td = = ln2 × N0/(dN/dt), где N0 – исходное число клеток (посевная доза), dN – прирост числа клеток, а dt – время (ч) от посева до снятия культуры (Гриффитс, 1989).

Иммуноцитохимическое выявление MGMT. Клетки культивировали в камерах для клеток на стекле BD Falcon CultureSlides (BD Biosciences, США) и фиксировали 4%-ным забуференным формальдегидом в течение 10 мин. Демаскирование антигена проводили путем термической инкубации при 95–99°С в 0.01М цитратном буфере (рН 6.0) в течение 20 мин. Клетки последовательно инкубировали с первичными антителами против MGMT (О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы) и мечеными антителами Dako EnVision+ System-HRP Labelled polymer (Dako, Дания) по 30 мин во влажной камере при комнатной температуре. Ферментную метку визуализировали с помощью хромогена EnVisionTM FLEX DAB+ (Dako, Дания) и субстратного буфера EnVisionTM FLEX. Контрастное окрашивание ядер проводили в гематоксилине Майера (БиоВитрум, Россия) в течение 2 мин. Изображения получали при помощи сканера Leica SCN 400 (Leica Microsystems, Германия) с использованием программы Aperio Im-age Scope (Leica Microsystems, Германия) и микроскопа Axio Imager A2, оборудованного камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).

Исследование активности генов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. РНК выделяли с помощью TRIzol Reagent согласно рекомендациям производителя (Thermo Fisher Scientific, США). В реакции обратной транскрипции использовали 500 нг РНК. Этапы выполнения анализа описаны нами ранее (Киселева и др., 2016). Последовательности праймеров представлены в табл. 1. Праймеры синтезированы фирмой Люмипроб РУС (Россия).

Уровень экспрессии генов представляли в виде разницы между пороговым циклом исследуемого гена и гена сравнения GAPDH (ΔCt, где Ct – пороговый цикл, соответствующий числу циклов амплификации, необходимых для достижения порогового значения флуоресценции). Для сравнения уровня экспрессии генов в клетках до и после воздействия темозоломида использовали метод относительного количественного определения генов (метод 2^–ΔΔCt); 2^–ΔΔCT представляет собой кратность разницы между экспрессией гена в интактных и резистентных к темозоломиду клетках (Livak, Schmittgen, 2001).

Определение статуса метилирования гена MGMT. В качестве метода анализа статуса метилирования CpG-островков промоторных участков гена MGMT была использована метил-специфическая полимеразная цепная реакция (MSP) (Herman et al., 1996; Kristensen, Hansen, 2009). Выделение ДНК проводили с помощью набора для выделения геномной ДНК из клеток, тканей и крови производства ООО Биолабмикс (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Для проведения бисульфитной конверсии проб ДНК использовали набор EZ DNA Methylation-Gold® (Zymo Research, США). После получения конвертированной и очищенной ДНК проводили амплификацию с праймерами, специфичными для метилированных и неметилированных участков ДНК промоторных областей гена MGMT (Christians et al., 2012): 5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3' (прямой праймер) и 5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3' (обратный праймер) для обнаружения метилированных матриц (длина продукта 81 п.н.); 5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3' (прямой праймер) и 5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAACA-3' (обратный праймер) для обнаружения неметилированных матриц (длина продукта 93 п.н.).

ПЦР проводили в общем объеме 12 мкл, содержащем ПЦР-буфер, 1.1 мМ MgCl₂, 0.2 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, по 10 пмоль соответствующего прямого и обратного праймера, 1 ед. Taq-полимеразы и 2 мкл ДНК-матрицы, обработанной бисульфитом. Программа ПЦР составляла 95°C в течение 3 мин, затем 40 циклов 95°C по 50 с, 60°C – 50 с, 72°C – 50 с и заключительный этап: 72°C в течение 3 мин. После проведения 40 циклов ПЦР полученный амплификат анализировали с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле. Фрагменты ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл. Наличие амплификата, полученного при проведении ПЦР с праймерами для метилированных участков ДНК, свидетельствовало о наличии аберрантного метилирования. Наличие ПЦР-продукта, полученного при проведении ПЦР с праймерами для неметилированных участков ДНК, и отсутствие амплификата с праймерами для метилированных участков ДНК свидетельствовало об отсутствии аберрантного метилирования.

Концентрацию интерлейкинов IL-6 и IL-8 в среде культивирования клеток определяли с помощью наборов Интерлейкин-6-ИФА-БЕСТ и Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ (ООО Вектор-Бест, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Статистический анализ выполняли при помощи программного обеспечения Microsoft Excel и IBM SPSS Statistics 22.

Использованные реактивы: среда αMEM, гентамицин, раствор 0.25%-ного трипсина с версеном, деионизированная вода, фосфатно-солевой буферный раствор (БиолоТ, Россия), эмбриональная телячья сыворотка (HyClone, США), Темодал® (Бакстер Онкология ГмбХ, Германия), формальдегид, гематоксилин Майера (БиоВитрум, Россия), поликлональные кроличьи антитела к MGMT (Abcam, Великобритания), антитела Dako EnVision+ System-HRP Labelled poly-mer, хромоген EnVisionTM FLEX DAB+, субстратный буфер EnVisionTM FLEX (Dako, Дания), TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific, США), Taq- полимераза, 10× ПЦР-буфер, MgCl₂ (Силекс, Россия), праймеры (НПК, Россия; Синтол, Россия), трифосфаты (SibEnzyme, Россия), акриламид, бисакриламид, ТЕМЕД (AppliChem, Германия), персульфат аммония (Panreac, Испания).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клеточные линии глиобластом А172 и R1 были представлены фибробластоподобными отростчатыми клетками (рис. 1). Подробная морфологическая характеристика интактных культур A172 и R1 была проведена ранее (Киселева и др., 2016; 2017).

Рис. 1.

Интактные клетки линий A172 (а) и R1 (б). Окраска по Май-Грюнвальду–Гимзе. Масштабные отрезки: 100 мкм.

Воздействие темозоломида на клетки линии А172. Для обработки клеток глиобластомы линии A172 темозоломидом был выбран диапазон концентраций 0.1–1 мМ (рис. 2). В течение 4 сут после воздействия препарата клетки продолжали пролиферировать. После 4-суточного культивирования, за счет гибели клеток их количество стало уменьшаться. К 14 сут во всех культурах A172, подвергнутых действию темозоломида, число живых клеток не превышало 6% от исходной посевной дозы. Наконец, к 21 сут в культурах A172, обработанных 0.25–1 мМ темозоломида не было выявлено живых клеток. В течение следующих 7 сут жизнеспособные клетки в этих культурах обнаружены не были. Таким образом, концентрация темозоломида свыше 0.25 мМ оказалась летальной для клеток линии А172. В то же время, в культуре А172, испытавшей воздействие темозоломида в дозе 0.1 мМ, к 14 сут оставались одиночные клетки, численность которых составляла 3.8% от исходной посевной дозы. За следующую неделю (14–21 сут культивирования) количество клеток увеличилось вдвое, а к 28 сут за счет пролиферации клеток произошло восстановление численности популяции до исходных значений. Одиночные клетки, восстановившие способность к пролиферации, представляют собой резистентные к темозоломиду клетки линии А172. Время удвоения таких резистентных клеток между 14 и 21 сут культивирования увеличивалось в 4 раза, а между 21 и 28 сут уменьшалось в 3.5 раза по сравнению с интактной культурой (рис. 3).

Рис. 2.

Изменения численности клеток линии A172 на ранних (а) и поздних (б) сроках после обработки темозоломидом в разных концентрациях.

Рис. 3.

Время удвоения интактных и обработанных темозоломидом клеток глиобластом линий A172 и R1. Указано время (сут) после обработки темозоломидом.

Воздействие темозоломида на клетки линии R1. Чувствительность линии R1 к воздействию темозоломида ранее изучена не была, поэтому для обработки клеток был выбран более широкий диапазон (0.25–3 мМ) концентраций препарата (рис. 4). В отличие от клеток А172, в культурах R1 непосредственно после удаления темозоломида не происходило роста численности клеточной популяции. Вплоть до 9-х сут культивирования число клеток R1 продолжало уменьшаться; количество сохранившихся клеток находилось в обратной зависимости от использованной дозы препарата. Дальнейшая динамика гибели и восстановления клеток линии R1 также определялась концентрацией темозоломида. Начиная с 9 сут, клетки R1, обработанные 0.25 и 0.5 мМ препарата, возобновляли пролиферацию, и до конца культивирования их количество увеличивалось в 8–10 раз по сравнению с исходной посевной дозой. После использования темозоломида в концентрации 1 мМ пролиферация и рост численности клеток R1 начался с 14-х сут культивирования. Клетки R1, обработанные 2 мМ темозоломида, возобновили пролиферацию к 21-м сут, и за 1 нед. их численность достигла значений посевной дозы; в течение следующей недели была отмечена массовая гибель этих клеток, что привело к гибели культуры к 28-м сут. Наконец, в культурах R1, обработанных 3 мМ темозоломида, к 14-м сут не оставалось живых клеток и при дальнейшем наблюдении не было признаков пролиферации.

Рис. 4.

Изменения численности клеток линии R1 на ранних (а) и поздних (б) сроках после обработки темозоломидом в разных концентрациях.

Таким образом, резистентные к темозоломиду клетки, возобновившие устойчивую пролиферацию, были получены при обработке глиобластомы R1 препаратом в концентрации 1 мМ. Наименьшее время удвоения эти клетки демонстрировали между 14 и 21 сут культивирования (рис. 3), однако оно превышало таковое у интактных клеток в 4 раза. Между 21 и 28 сут культивирования происходило дальнейшее замедление пролиферации таких резистентных клеток почти в 9 раз по сравнению с интактной культурой.

Уровень экспрессии генов в клетках А172 и R1. В интактных и резистентных к темозоломиду клетках А172 и R1 исследовали экспрессию генов, опосредующих различные механизмы резистентности опухолей к лекарственной терапии. Определяли статус метилирования промотора гена MGMT, а также уровень экспрессии этого гена. В клетках А172 было показано наличие метилирования промотора гена MGMT. Статус метилирования промотора гена M-GMT в клетках линии R1 ранее не был определен.

По нашим данным в популяции клеток R1 присутствуют клетки как с метилированным, так и с неметилированным промотором гена MGMT (рис. 5а). Определение активности гена MGMT подтвердило полученные результаты, показав практически полное отсутствие экспрессии MGMT в клетках А172 и лишь незначительную экспрессию этого гена в клетках R1. При этом в резистентных клетках обеих линий экспрессия MGMT существенно возрастала. В клетках А172 она увеличилась примерно в 50 раз, а в клетках R1 увеличилась незначительно (рис. 5б). Усиление экспрессии сопровождалось снижением числа клеток, несущих метилированный промотор гена MGMT (рис. 5а). Иммуноцитохимическое исследование интактных клеток показало, что популяция клеток линии R1 была неоднородной по наличию MGMT, в то время как в клетках линии A172 фермент обнаружен не был (рис. 5в, г).

Рис. 5.

Анализ метилирования CpG-островков промоторных областей гена MGMT в интактных и резистентных к темозоломиду клетках A172 и R1. а: дорожки Н и М – амплификат, полученный с праймерами для неметилированных и метилированных участков ДНК соответственно. б – Относительный уровень экспрессии гена MGMT в интактных клетках линий A172 и R1; по горизонтали – ΔCT (разница между пороговым циклом исследуемого гена и гена сравнения GAPDH); горизонтальные отрезки – стандартное отклонение. в – Изменение экспрессии гена MGMT в резистентных к темозоломиду клетках A172 и R1; по вертикали – 2^–ΔΔCT (кратность разницы между экспрессией гена в резистентных и интактных клетках); за 1 ед. принят уровень активности гена MGMT в интактных клетках; вертикальные отрезки – стандартное отклонение. г, д – Иммуноцитохимическое определение наличия белка MGMT в интактных клетках A172 и R1 соответственно; масштабные отрезки: 100 мкм.

В клетках линий А172 и R1 исследовали активность генов множественной лекарственной устойчивости: ABCB1 (MDR1), ABCC1 (MRP1) и ABCG2 (BCRP). Более всего в обеих линиях была выражена экспрессия гена ABCC1 (BCRP), в резистентных клетках она практически не изменялась. Активность генов ABCB1 (MDR1) и ABCG2 (BCRP) в клетках А172 и R1 была выражена слабо, однако в резистентных клетках А172 экспрессия этих генов возрастала более чем в 10 раз, а в резистентных клетках R1, напротив, еще более снижалась (рис. 6).

Рис. 6.

Относительный уровень экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в интактных клетках линий A172 и R1. а – Значения ΔCT; горизонтальные отрезки – стандартное отклонение. б – Изменение экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в резистентных к темозоломиду клетках A172 и R1; по вертикали – значение 2^–ΔΔCT. Другие объяснения см. в подписи к рис. 5.

Рис. 7.

Относительный уровень экспрессии генов интерлейкинов (IL-6, IL-8) в интактных клетках линий A172 и R1. а – Значения ΔCT; горизонтальные отрезки – стандартное отклонение. б – Изменение экспрессии генов интерлейкинов в резистентных к темозоломиду клетках A172 и R1; по вертикали – значение 2^–ΔΔCT. Другие объяснения см. в подписи к рис. 5.

По экспрессии генов IL-6 и IL-8 клетки линий А172 и R1 существенно различались. Клетки А172 характеризовались умеренной активностью этих генов, тогда как клеткам R1 была свойственна чрезвычайно высокая экспрессия IL-6 и, особенно, IL-8. В резистентных к темозоломиду клетках этих линий мы наблюдали выраженное, но разнонаправленное, изменение активности обоих этих генов, которое проявлялось в усилении экспрессии генов IL-6 и IL‑8 в клетках А172 и ослаблении их активности в клетках линии R1 (рис. 7).

Количественное определение цитокинов IL-6 и IL-8 было проведено в среде культивирования интактных и резистентных клеток А172 и R1. Полученные результаты согласуются с данными по экспрессии соответствующих генов, подтверждая высокую продукцию IL-6 и IL-8 интактными клетками R1 и снижение ее в резистентных клетках. В клетках А172 отмечена обратная ситуация (рис. 8).

Рис. 8.

Концентрация цитокинов IL-6, IL-8 в среде культивирования интактных и резистентных к темозоломиду клеток линий глиобластом человека A172 и R1. Вертикальные отрезки – стандартное отклонение.

Клетки А172 и R1 характеризовались близкими значениями экспрессии гена VEGF. В резистентной популяции клеток линии А172 активность этого гена десятикратно возрастала, в резистентных клетках R1 оставалась неизменной (рис. 9). Ген HGF практически не экспрессировался в интактных клетках А172 и проявлял низкую активность в интактных клетках R1. В резистентных клетках А172 экспрессия гена HGF возрастала, а в клетках R1, напротив, существенно снижалась (рис. 9). В табл. 2 представлены обобщенные результаты изучения экспрессии генов в исследованных линиях глиобластом, а также в высоко резистентной к темозоломиду линии T98G, подробная характеристика которой была дана нами ранее (Пиневич и др., 2022).

Рис. 9.

Относительный уровень экспрессии генов ростовых факторов в интактных клетках линий A172 и R1. а – Значение ΔCT; горизонтальные отрезки – стандартное отклонение. б – Изменение экспрессии генов ростовых факторов в резистентных к темозоломиду клетках A172 и R1; по вертикали – значение 2^–ΔΔCT. Другие объяснения см. в подписи к рис. 5.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время приведены убедительные доказательства того, что первичная и рецидивирующая глиобластомы существенно различаются между собой как морфологически, так и молекулярно-генетически (Kim et al., 2015; Marucci et al., 2015; Campos et al., 2016). Клетки глиобластом, избегающие гибели под воздействием лучевой и лекарственной терапии, эволюционируют и приобретают свойства, определяющие их устойчивость к дальнейшему лечению.

Феномен формирования резистентности глиобластом к терапии и механизмы, задействованные в этом процессе, изучаются очень активно (Daniel et al., 2019; Xia et al., 2021). В качестве клеточных моделей в подобных исследованиях принято использовать клеточные линии глиобластом, различающиеся между собой по ряду определенных параметров. Считается, что разнообразие клеточных линий в какой-то мере отражает чрезвычайно высокое разнообразие вариантов этого заболевания (Li et al., 2022; Zhu et al., 2022) и позволяет получить более достоверные результаты.

В лабораторной практике используется целый спектр линий глиобластом человека, как высоко резистентных к темозоломиду (LN-18 и Т98G), так и более чувствительных к этому препарату (А172, U87, U251 и U373) (Lee, 2016; Kinashi et al., 2020; Soni et al., 2022). Кроме того, пытаясь приблизить клеточные модели к реальной опухоли, исследователи используют первичные клеточные линии, выделенные из операционного материала пациентов, а также резистентные варианты постоянных линий, получаемые при воздействии на них химиопрепаратами или облучением. Подобные модели представляют особый интерес для изучения приобретенной резистентности и тестирования препаратов, предназначенных для лечения рецидивов заболевания. Так, известные линии, чувствительные к действию темозоломида (например, A172, SNB-19, U87, U251 и U373) используют для генерации клеток с резистентностью, приобретенной в результате повторных воздействий этого препарата. Однако результаты, полученные в разных лабораториях, существенно различаются между собой (Lee, 2016).

В настоящей работе мы обратились к изучению потомства наиболее резистентных к темозоломиду клеток, присутствующих в исходных линиях глиобластом A172 и R1. Линия глиобластомы A172 широко известна, тогда как линия, R1, напротив, получена недавно, мало известна и в отношении действия темозоломида ранее не была исследована. Клетки линий А172 и R1 были однократно обработаны темозоломидом в широком диапазоне доз. В качестве источника темозоломида был использован препарат Темодал® в лекарственной форме лиофилизата для приготовления инфузионного раствора. Преимущества такого подхода описаны нами ранее (Пиневич и др., 2022).

Как и ожидалось, клетки А172 оказались высоко чувствительны к действию темозоломида. Летальная доза препарата составила для них 0.25 мМ. Однако при воздействии 0.1 мМ препарата отдельные устойчивые клетки линии смогли избежать гибели и восстановили способность к пролиферации, сформировав популяцию потомков наиболее резистентных клеток. Клетки линии R1 показали более высокую устойчивость к этому препарату. Летальная доза для них составила 2 мМ. Резистентные клетки, устойчиво возобновившие пролиферацию после действия препарата, были получены при обработке глиобластомы R1 темозоломидом в дозе 1 мМ.

Популяции, сформировавшиеся из единичных клеток, выживших после воздействия темозоломида, были определены нами как резистентные. Морфологически резистентные клетки обеих линий мало отличались от исходных клеток. При этом пролиферативная активность резистентных клеток А172 была выше, чем интактных, а у резистентных клеток R1, напротив, была снижена. Резистентные и интактные клетки А172 и R1 были исследованы нами в отношении экспрессии в них ряда генов, активность которых сопряжена с лекарственной устойчивостью и прогрессированием опухолей.

Одной из основных характеристик, определяющих чувствительность опухолевых клеток к темозоломиду, является статус фермента MGMT. Активность этого фермента определяет потенциальную возможность репарации индуцированных темозоломидом повреждений ДНК (Pegg, Byers, 1992). Кроме того, общепринятой считается значимость белка р53, супрессора образования злокачественных опухолей (Lee, 2016; Tiek et al., 2018; Rabe et al., 2020). Так, для резистентных линий LN-18 и Т98G характерна высокая экспрессия MGMT, а ген, кодирующий белок р53, несет мутации. В клетках более чувствительной к темозоломиду линии А172 экспрессия гена MGMT практически отсутствует, а промотор этого гена метилирован, при этом клетки характеризуются наличием р53 дикого типа (Hermisson et al., 2006; Perazzoli et al., 2015; Lee, 2016; Kinashi et al., 2020; Soni et al., 2022).

Мы подтвердили статус промотора гена MGMT в клетках А172 как метилированного, а также почти полное отсутствие экспрессии соответствующего гена. В линии R1 таким статусом обладает лишь часть клеток, что позволяет гену MGMT экспрессироваться. В резистентных вариантах обеих изучаемых линий отмечены значимые изменения этих показателей. Уровень метилирования в них снижался, а экспрессия MGMT, напротив, возрастала, особенно в резистентных клетках А172. Подобные изменения функционирования гена MGMT были описаны в ряде работ (Feldheim et al., 2022). Однако некоторым исследователям не удалось наблюдать изменения со стороны этого гена под воздействием химиопрепаратов (Lee, 2016).

MGMT признан основным и пока единственным предиктивным маркером в лечении пациентов с глиобластомой (Louis et al., 2016; Мацко и др., 2019). С низкой экспрессией гена MGMT в клетках опухоли ассоциируется более длительная продолжительность жизни больных с первичной глиобластомой, при условии проведения стандартной химиотерапии (Hegi et al., 2005; Matsko, Imaynitov, 2015). Показано, что уровень мРНК этого фермента в целом ниже у пациентов с высокой продолжительностью жизни (Мацко и др., 2019).

Один из важнейших молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования резистентности опухоли, связан с функционированием транспортных белков – АВС-транспортеров, осуществляющих выброс химиопрепаратов из клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ, что приводит к быстрому уменьшению внутриклеточного уровня препаратов ниже терапевтической концентрации (Borst et al., 2000; Kathawala et al., 2015).

Семейство АВС-транспортеров включает в себя 49 различных белков, однако значимость в развитии резистентности глубоко изучена только для трех из них: белка множественной лекарственной резистентности 1 (MDR1, также известного как Р-гликопротеин или АВСВ1), MDR-ассоциированного белка 1 (MRP1, АВСС1) и белка резистентности рака молочной железы (BCRP, ABCG2) (Gottesman et al., 2002). Эти белки экспрессируются в опухолевых и стволовых опухолевых клетках и усиливают их резистентность к химиопрепаратам, в том числе темозоломиду (Peignan et al., 2011; Coyle et al., 2015; de Gooijer et al., 2018; Wang et al., 2019).

В наших исследованиях в отношении одного из генов – ABCC1 (MRP1) – изменения экспрессии в резистентных клетках не отмечено, тогда как в отношении экспрессии двух других генов были получены противоположные результаты. В резистентных клетках А172 было отмечено существенное повышение активности ABCB1 (MDR1) и ABCG2 (BCRP), а в резистентных клетках R1, напротив, – выраженное снижение по сравнению с интактными клетками.

Важная роль в процессе канцерогенеза, в том числе глиомагенеза, отводится IL, в том числе IL-6 и IL-8 (Christofides et al., 2015; Goutnik, Lucke-Wold, 2022). Иммуногистохимические исследования показали, что клетки глиобластом могут экспрессировать оба этих цитокина (Christofides et al., 2015; Shan et al., 2015; Sharma et al., 2018). Уже давно проводится параллель между уровнем экспрессии IL-6 и IL-8 и степенью злокачественности глиомы (Rolhion et al., 2001; Brat et al., 2005; Samaras et al., 2009), однако многие вопросы до сих пор остаются не выясненными. IL-6 играет важную роль в процессах регулирования клеточного цикла (Xu et al., 2014). Он способствует пролиферации опухолевых клеток по пути JAK/STAT (Mostofa et al., 2017), активируя белок STAT3, ответственный за рост, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Выявлена корреляция между уровнем мРНК IL-6 и степенью злокачественности глиомы (Wang et al., 2009). Повышенный уровень сывороточного IL-6 наблюдается у значительного числа пациентов и коррелирует с плохим прогнозом и повышенной агрессивностью заболевания (Tchirkov et al., 2007; Christofides et al., 2015).

Высокая экспрессия IL-8 ассоциирована с плохим прогнозом при раке поджелудочной железы, молочной железы, яичников, легкого, простаты и мочевого пузыря (Ha et al., 2017). При глиобластоме наблюдается аналогичная тенденция (Sharma et al., 2017). Показано, что IL-8 усиливает пролиферацию и инвазию опухолевых клеток, кроме того он является мощным ангиогенным фактором (Sharma et al., 2018). Zhang с соавторами (2015) наблюдали высокую экспрессию IL-8 примерно в 80% образцов ткани опухоли. При этом было показано, что IL-8 усиливает рост глиомы, связываясь аутокринным способом с рецептором CXCR1 на поверхности клеток (Sharma et al., 2017). В настоящее время IL-6 и IL-8 рассматривают в качестве возможных прогностических маркеров течения заболевания (Shan et al., 2015; Bunevicius et al., 2018; Shrivastava et al., 2022).

Мы показали, что клетки А172 обладают невысоким уровнем секреции IL-6 и IL-8, что согласуется с данными других исследователей (Yuhas et al, 2015). Однако в клетках R1, ранее не изученных в этом отношении, был выявлен чрезвычайно высокий уровень экспрессии как генов, так и белков IL-6 и IL-8. Нам не известны работы, в которых клеточные линии глиобластом демонстрировали бы подобный высокий уровень IL-6 и IL-8. При этом в резистентных клетках R1 он был существенно ниже, чем в интактных. В клетках линии А172 с изначально более низким уровнем экспрессии как генов, так и белков IL-6 и IL-8, эти показатели, напротив, значимо возрастали. Таким образом, в клетках линий А172 и R1, восстановивших пролиферацию после обработки темозоломидом, нами были выявлены разнонаправленные изменения продукции IL-6 и IL-8 и экспрессии кодирующих их генов.

Аналогичная тенденция прослеживалась и в отношении экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), роль которого в стимулировании роста опухолей хорошо документирована (Vimalraj, 2022), а также гена гепатоцитарного ростового фактора (HGF), участвующего в процессах регуляции клеточного цикла, дифференцировки, морфогенеза и апоптоза (Phan et al., 2015; Barzaman et al., 2022).

Таким образом, в потомстве наиболее резистентных к темозоломиду клеток линий А172 и R1 мы наблюдали увеличенную экспрессию гена MGMT, что может служить причиной более высокой устойчивости этих клеток к препарату. Однако в отношении прочих исследованных генов в клетках линий А172 и R1 были отмечены разнонаправленные тенденции. В резистентных клетках А172 экспрессия большинства исследованных генов, связанных с устойчивостью к химиотерапии и более агрессивным течением заболевания, ожидаемо увеличивалась, а в резистентных клетках R1, напротив, снижалась.

Полученные нами результаты подтверждают значимость MGMT в формировании резистентности к темозоломиду. Однако прогностическая ценность прочих обсуждаемых показателей представляется неоднозначной. Ранее было показано, что разработанные специфические ингибиторы MDR1 (АВСВ1), зосуковидар и тариквидар, не дали преимущества в терапии рака молочной железы в комбинации с антрациклинами и таксанами (Pusztai et al., 2005; Ruff et al., 2009). Неудачу этого подхода, по мнению Волкова (2021), можно объяснить тем, что выброс химиопрепаратов АВС-переносчиками не играет определяющей роли, а также возможностью компенсировать блокировку одного белка-транспортера активностью других. Ценность предиктивной значимости экспрессии IL-6 и IL-8 также остается неоднозначной. Для уточнения этого вопроса несомненна ценность клеточной линии R1, клетки которой на высоком уровне экспрессируют IL-6 и IL-8.

Итак, нами проведено сравнительное изучение действия темозоломида на хорошо известную линию глиобластомы А172 и на новую линию R1. Исследование клеточных популяций, которые явились потомками наиболее резистентных к темозоломиду клеток, показало, что они обладают молекулярным профилем, существенно отличающимся от молекулярного профиля исходных линии глиобластом A172 и R1.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в рамках Госзадания “Изучение резистентных опухолевых клеток на культурах глиобластом при моделировании стереотаксической радиохирургии рецидивирующей глиобластомы” ФГБУ “РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова” (Санкт-Петербург, Россия).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Процедуры проводили в соответствии с нормативными требованиями научно-исследовательского этического комитета Российского научного центра радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы декларируют, что у них нет конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.А Пиневич, Н.Л. Вартанян, А.В. Карташев, М.П. Самойлович: идея работы, ее планирование. А.А. Пиневич, М.П. Самойлович: культивирование клеток. Н.Л. Вартанян: выделение РНК, проведение ПЦР. Л.Н. Киселева: иммуноцитохимия. Ж.Ю. Сидорова, С.П. Свитина: определение статуса метилирования гена MGMT. И.В. Смирнов: иммуноферментный анализ. А.А. Пиневич, Н.Л. Вартанян, М.П. Самойлович: обработка результатов, написание текста, подготовка иллюстраций. Все авторы принимали участие в обсуждении результатов.