Цитология, 2022, T. 64, № 6, стр. 581-590

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Выделение митохондрий из клеточной линии глиомы С6. Клеточные линии глиомы С6 (дикого типа и с нокдауном по TSPO) подарены д-ром М. Gavish (Технион, Израиль). Митохондрии изолировали из клеток глиомы С6 дикого типа (МГ дикого типа) и из клеток глиомы С6 с нокдауном по TSPO (МГ с нокдауном). Выделение митохондрий из клеток проводили при 4°С по опубликованной методике (Leissring et al., 2004). Монослои клеток глиомы С6 соскребали скребком, промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), осаждали при 500 g в течение 3 мин. Осадок растворяли в буфере, содержащем 0.32 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 0.02% бычьего сывороточного альбумина (фракция V), 10 мМ Трис-HCl (pH 7.4). Клеточные мембраны разрушали при помощи механического гомогенизатора Dounce (Великобритания) (40 пасов при 10 000 об./мин) и осаждали при 500 g в течение 5 мин. Осадок повторно суспендировали в том же ледяном буфере и разрушали с помощью гомогенизатора Dounce. Супернатанты после двух центрифугирований осаждали при 3000 g в течение 4 мин для удаления неразрушенных клеток и ядер. Полученный супернатант центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин. Осадок митохондрий суспендировали в ледяной среде, содержащей 0.32 М сахарозы и 10 мМ трис-HCl (рН 7.4), и центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин. Выделенные митохондрии ресуспендировали в том же растворе. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (Bio-Rad Protein assay; Bio-Rad, Германия).

Оценка митохондриальных функций. Все параметры измеряли, как описано ранее (Azarashvili et al., 2007). Митохондрии (1 мг/мл) инкубировали в мультифункциональной ячейке со встроенными селективными электродами (тетрафенилфосфониевым (ТРР⁺), Са²⁺-селективным и кислородным Clarck-type О₂) в 1 мл в среды, содержащей 125 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, 0.4 мМ K₂HPO₄, 5 мМ сукцината калия и 5 мкМ ротенона, рН 7 при 25°С. Скорость потребления кислорода измеряли с помощью О₂-электрода (Clark-type, Россия), рассчитывали в нг-атомах O за 1 мин на 1 мг белка и измеряли в закрытой ячейке. Mитохондриальный мембранный потенциал (ΔΨ) оценивали, измеряя распределение ТРР⁺ между митохондриальным матриксом и инкубационной средой с помощью ТРР⁺-селективного электрода (Нико Аналит, Россия). Са²⁺-индуцированную диссипацию мембранного потенциала выражали в виде скорости входа ТРР⁺ после первой и второй добавок Са²⁺ (ТРР⁺, нмоль за 1 мин на 1 мг белка). Транспорт Са²⁺$\left( {{{{\text{V}}}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}}} \right)$ измеряли с помощью Са²⁺-чувствительного электрода (Нико Аналит, Россия) и оценивали, как скорость входа Са²⁺ после первой и второй добавок и рассчитывали, как количество нмоль ${\text{Са}}_{{{\text{in}}}}^{{{\text{2 + }}}}$ за 1 мин на 1 мг белка. Изменение потоков ТРР⁺ и Са²⁺ измеряли в открытой ячейке.

Электрофорез и Вестерн-блот-анализ. Аликвоту клеточного и митохондриального белка (15 мкг) солюбилизировали в буфере Лэммли, кипятили в течение 3 мин. Для иммуноблотинга полученные лизаты разделяли в денатурирующих условиях (12.5% SDS-PAGE) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0.2 мкм). Поликлональные антитела к TSPO получены от Abcam (Cambridge, Великобритания). Активность пероксидазы определяли с помощью хемилюминесцентных реагентов ECL (Pierce, Rockford, IL США). Количественную оценку плотности полос иммуноблотов проводили с использованием денситометра (GS-100 Calibrated Densitometer Bio-Rad, США) и рассчитывали с помощью программного обеспечения Gell Pro Software (Bio-Rad США).

Оценка фосфорилирования белков. Для оценки степени фосфорилирования белков аликвоты митохондриальной суспензии (15 мкг белка) добавляли олигомицин (1.5 мкМ) для предотвращения гидролиза АТФ. Затем в образец добавляли смесь меченой [γ^–32P]АТФ и немеченый Mg²⁺-АТФ для достижения конечных концентраций 2 мМ Mg²⁺, 400 мкМ АТФ и 185000 Бк [γ^–32P]АТФ. Образцы митохондрий инкубировали 3 мин при комнатной температуре, реакцию останавливали добавлением буфера Лэммли, далее образцы нагревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин (Azarashvili et al., 2003). Солюбилизированные митохондрии, содержащие 15 мкг белка, разделяли методом электрофореза в денатурирующих условиях (15% SDS-PAGE). Радиоактивные полосы в полиакриламидных гелях визуализировали путем экспонирования на пленке Kodak X-Omat AR-5 при –80°C. Через 1 сут пленку проявляли с помощью проявителя и закрепителя. Для оценки уровня фосфорилирования белка пленки сканировали с помощью денситометра (Bio-Rad, США).

Статистический анализ. Значения измеренных параметров выражали средними значениями и их среднестатистическими отклонениями из 3–4 экспериментов. Достоверности различий оценивали с использованием тестов t-критерия Стьюдента при Р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сначала мы проверили содержание TSPO в клеточных и митохондриальных лизатах, приготовленных из клеток глиомы С6 дикого типа и с нокдауном по TSPO. На рис. 1а показано распределение TSPO в клеточных лизатах. В контрольных клеточных лизатах (клетки глиомы С6 дикого типа) антитела к TSPO распознавали интенсивно окрашенные белки с молекулярной массой 36 кДа и 18 кДа, которые соответствуют димерной и мономерной формам. В клетках глиомы С6 со сниженной экспрессией TSPO полосы мономера и димера имели одинаковую интенсивность. На рис. 1а' показаны усредненные количественные значения уровней TSPO в клетках глиомы C6. Оказалось, что мономерная форма TSPO (18 кДа) в клетках глиомы С6 с нокдауном по TSPO снижалась на 40% по сравнению с контрольными клетками (дикого ипа) глиомы С6. Снижение уровня белка с молекулярной массой 36 кДа почти в 2.5 раза обнаруживалось в клетках глиомы С6 со сниженной экспрессией TSPO.

Рис. 1.

Уровень TSPO в клеточных (а, а') и митохондриальных (б, б') лизатах клеток глиомы С6 (МГ) дикого типа и с нокдауном по TSPO. а, б – Иммуноблоты TSPO; а', б' – результаты денситометрии белковых полос, показанных соответственно на а и б. * Различия с соответствующим контролем достоверны при P < 0.05.

На рис. 1б показано изменение уровня TSPO в митохондриях, изолированных из исследуемых клеток глиомы С6, а ниже (рис. 1б') представлен количественный анализ содержания TSPO в изолированных митохондриях. На рисунке видно, что в митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа присутствует и мономерная, и димерная формы белка (18 и 36 кДа), в то время как в митохондриях, изолированных из клеток глиогмы С6 с нокдауном по TSPO белковые полосы не обнаружены.

Ранее было показано существование TSPO с мол. массой 36 кДа, способного связывать меченный радиоактивным изотопом PK14105 ([N-methyl-N-(1-methyl-propyl)-1(2-fluoro-5-nitrophenyl)isoquinoline-3-carboxamide]) в экстрактах митохондриий клеток CHO (Riond et al., 1989). Олигомеры TSPO также были обнаружены и другими авторами (Delavoie et al., 2003). В клетках Jurkat и лимфоцитах был обнаружен белок с мол. массой 36 кДа, что свидетельствует о наличии в этих клетках димера TSPO (Costa et al., 2006). Димерные и олигомерные формы могут образовываться в ответ на окислительный стресс в присутствии АФК. Сообщали, что, вероятно, из-за высокого уровня эндогенных свободных радикалов клетки агрессивного рака молочной железы человека содержат в основном димерную форму TSPO (Hardwick et al., 1999). Позже было сделано предположение, что АФК-индуцированное перекрестное связывание TSPO включает образование дитирозина, и TSPO может быть мишенью для АФК (Delavoie et al., 2003). В настоящем исследовании мономер и димер TSPO были обнаружены в клетках глиомы С6 дикого типа и с нокдауном по TSPO, но содержание TSPO в клетках с нокдауном было ниже. Можно предположить, что TSPO принимает участие в развитии опухолей.

Далее мы исследовали функциональное состояние митохондрий, изолированных из клеток обоих типов, измеряя скорость потребления кислорода в изолированных митохондриях в присутствии сукцината в качестве дыхательного субстрата. На рис. 2а показаны кривые дыхательной активности в состоянии 2, 3 и 4. Рис. 2б отражает количественные характеристики скоростей дыхания. На рисунке видно, что скорости потребления О₂ (V₂-субстрат-зависимое дыхание не отличались в митохондриях, изолированных из клеток обоих типов, тогда как скорость потребления кислорода митохондриями в фосфорилирующем состоянии (V₃) снижалась в митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6 с нокдауном по TSPO на 30% по сравнению со значением V₃ в митохондриях клеток глиомы С6 дикого типа. Скорости потребления кислорода в состоянии 4, т.е. в восстановленном состоянии после исчерпания избытка АДФ (V₄) в митохондриях значимо не отличались. Дыхательный контроль (ДК) митохондрий, изолированных из клеток глиомы С6 с нокдауном по TSPO, снижался на 15% по сравнению с ДК в митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа и составлял 3.43 и 4.01 соответственно.

Рис. 2.

Влияние TSPO на дыхательную активность в митохондриях клеток глиомы С6 дикого типа (МГ дикого типа) и с нокдауном по TSPO. а – Кривые изменения потребления кислорода митохондриями. Стрелами отмечены места добавления митохондрий, АДФ и FCCP (разобщителя митохондриального фосфорилирования). б – Показатели потребления кислорода в состоянии 2 (V₂), 3 (V₃) и 4 (V₄); потребление О₂ выражено в нг-атом О₂ за 1 мин на 1 мг белка. в – Дыхательный контроль (отношение V₃ к V₄); показаны средние значения и их стандартные отклонения из трех независимых экспериментов; * различие с контролем (дикий тип) достоверно при P ˂ 0.05).

В литературе есть данные о том, что в микроглии животных с нокдауном по TSPO наблюдается более низкий синтез АТP и скорость потребления кислорода, чем в клетках дикого типа, что позволило авторам предположить, что дефицит TSPO может приводить к изменениям метаболической активности микроглии (Banati et al., 2014). Исследование функционального состояния митохондрий, выделенных из обоих типов клеток глиомы С6, показало, что снижение уровня TSPO в клетках глиомы С6 сопровождается подавлением дыхательной способности митохондрий в состоянии 3 и снижением ДК, которое могло происходить из-за нарушения работы переносчиков электронов. Кроме того, снижение TSPO в лизатах и отсутствие белка в митохондриях из клеток глиомы С6 с нокдауном по TSPO могло привести к нарушению проницаемости мембраны.

Поэтому следующий этап нашей работы заключался в изучении изменения транспорта Са²⁺, пороговой концентрации Са²⁺ (т.е. концентрации при которой происходит открытие мРТР) и мембранного потенциала при Са²⁺-индуцированном открытии мРТР в митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6. При этом выясняли влияние снижения экспрессии TSPO в клетках глиомы C6 на функционирование мPTP в митохондриях и действие PPIX на индукцию мPTP в митохондриях, изолированных из обоих типов клеток глиомы C6.

Ранее мы сообщали, что PPIX индуцировал открытие мРТР в митохондриях, изолированных из мозга крыс (Krestinina et al., 2018).

На рис. 3а показаны кривые изменения транспорта Са²⁺ при Са²⁺-индуцированном открытии мРТР в присутствии 1 мкМ PPIX в обоих типах клеток. Как видно на рисунке, первое добавление Са²⁺ (50 нмоль на 1 мг белка) во всех случаях приводило к устойчивому накоплению Са²⁺ в митохондриях с последующим восстановлением. Однако после 5-ой добавки Са²⁺ или после 4-ой в присутствии PPIX к МГ дикого типа происходил выход Са²⁺ из митохондрий. В МГ с нокдауном выход Са²⁺ из митохондрий наблюдали после 4-ой добавки Са²⁺, а в присутствии PPIX – после 3-ей.

Рис. 3.

Влияние нокдауна по TSPO на изменение мембранного потенциала в митохондриях (МГ), изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа и с нокдауна по TSPO, в присутствии PPIX. а – Кривые распределения ТРР⁺ при Са²⁺-индуцированном открытии мРТР в митохондриях, изолированных из клеток обоих типов; б – скорость входа иона ТРР⁺ в присутствии PPIX после 1-ой $\left( {{\text{V}}_{{\text{1}}}^{{{\text{ТРР + }}}}} \right)$ и 2-ой $\left( {{\text{V}}_{{\text{2}}}^{{{\text{ТРР + }}}}} \right)$ добавок Са²⁺. Различия с соответствующим контролем (* дикий тип без добавок или ^#соответствующее значение митохондриального параметра в клетках глиомы С6 с нокдауном по TSPO), достоверно при P < 0.05.

На рис. 3б, в показаны количественные изменение скорости входа Са²⁺ после 1-ой $\left( {{\text{V}}_{1}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}} \right)$ и 2-ой $\left( {{\text{V}}_{2}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}} \right)$ добавок Са²⁺ и изменение пороговой концентрации Са²⁺ соответственно. В присутствии PPIX в МГ дикого типа, значение V^Ca2+₁ снижалось на 40%, а ${\text{V}}_{2}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}$ существенно не изменялось по сравнению с соответствующим контролем (МГ дикого типа). В МГ с_с нокдауном значение ${\text{V}}_{1}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}$ снижалось на 35%, а ${\text{V}}_{2}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}$ существенно не изменялось по сравнению с контролем (МГ дикого типа). Добавление Са²⁺ к МГ с нокдауном в присутствии PPIX приводило к снижению ${\text{V}}_{1}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}$ на 25%, а ${\text{V}}_{2}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}$ – на 40% по сравнению с соответствующим контролем (МГ с нокдауном).

Пороговая концентрация Са²⁺ в МГ с нокдауном снижалась на 50% по сравнению с МГ дикого типа. При добавлении PPIX к МГ дикого типа пороговая [Са²⁺] снижалась на 35% по сравнению с этим параметром в МГ дикого типа, в то время как в МГ с нокдауном PPIX снижал этот параметр на 10% по сравнению с соответствующим контролем (МГ с нокдауном). PPIX индуцировал открытие мРТР в обеих клеточных линиях, однако в МГ с нокдауном по TSPO – в более низкой степени.

Параллельно с транспортом Са²⁺ мы изучили изменение мембранного потенциала в тех же экспериментальных условиях. Рис. 4а отражает кривые распределения иона ТРР⁺ между митохондриальным матриксом и цитозолем при Са²⁺-индуцированном открытии мРТР. Количественные изменения в скорости входа ТРР⁺ в митохондрии после 1-ой $\left( {{\text{V}}_{{\text{1}}}^{{{\text{ТРР + }}}}} \right)$ и 2-ой $\left( {{\text{V}}_{{\text{2}}}^{{{\text{ТРР + }}}}} \right)$ добавок Са²⁺ показаны на рис. 4б. В присутствии PPIX, в МГ дикого типа, значение ${\text{V}}_{{\text{1}}}^{{{\text{ТРР + }}}}$ снижалось на 23%, а ${\text{V}}_{{\text{2}}}^{{{\text{ТРР + }}}}$ на 20% по сравнению с соответствующим контролем (МГ дикого типа). В МГ нокдаун, значение ${\text{V}}_{{\text{1}}}^{{{\text{ТРР + }}}}$ снижалось на 60%, а ${\text{V}}_{{\text{2}}}^{{{\text{ТРР + }}}}$ – на 50% по сравнению с контролем (МГ дикого типа). PPIX не изменял значения ${\text{V}}_{{\text{1}}}^{{{\text{ТРР + }}}}$ в МГ с нокдауном, однако значение ${\text{V}}_{{\text{2}}}^{{{\text{ТРР + }}}}$ снижалось на 20% по сравнению с соответствующим контролем (МГ с нокдауном).

Рис. 4.

Влияние нокдауна по TSPO в клетках глиомы С6 на изменение транспорта Са²⁺ в митохондриях (МГ), изолированных из клеток дикого типа и с нокдауном по TSPO, в присутствии PPIX. а – Кривые транпорта Са²⁺ в изолированных митохондриях; б – влияние PPIX на скорость входа Са²⁺ в митохондрии в присутствии PPIX после 1- и 2-ой добавки Са²⁺ к митохондриям (${\text{V}}_{{\text{1}}}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}},$ ${\text{V}}_{{\text{2}}}^{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}$ соответственно); в – изменение пороговой концентрации Са²⁺ в митохондриях. клетки глиомы С6 дикого типа являются контролем; показаны средние значения и их стандартные отклонения из трех независимых экспериментов; различие с контролем (* дикий тип без добавок или ^#соответсвующеее значением митохондриального параметра в клетках глиомы С6 с нокдауном по TSPO), достоверно при P < 0.05.

Полученные результаты указывают на то, что подавление экспрессии гена TSPO связано со снижением емкости Ca²⁺ и скорости входа Са²⁺ и ТРР⁺ в МГ с нокдауном, которое привело к индукции открытия мPTP. Добавление PPIX к митохондриям, изолированных из глиомы С6 обоих типов, индуцировало открытие мPTP. Следует отметить, что стимулирующее действие PPIX на МГ дикого типа было сильнее, чем на МГ с нокдауном. Левин и соавторы (Levin et al., 2005) показали, что митохондриальные экстракты, полученные из клеток глиомы С6 с нокдауном по TSPO, более чем в 2 раза снижали способность связывать PK11195, экзогенный лиганд TSPO, по сравнению с клетками глиомы С6 дикого типа. В наших экспериментах мы наблюдали, что такая способность связывания эндогенного лиганда PPIX с TSPO также могла нарушаться из-за отсутствия TSPO в митохондриях, поэтому стимулирующее действие PPIX на МГ с нокдауном было более выраженным.

Белковое фосфорилирование (дефосфорилирование) считается одной из ключевых регуляторных сигнальных систем, контролирующих многие аспекты клеточных функций (Lim et al., 2016). Ранее в митохондриях мозга крысы мы обнаружили белки, которые при функционировании мРТР изменяли уровень фосфорилирования: кальпаин с молекулярной массой 67 кДа (Baburina et al., 2021), фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов (46 кДа) (Azarashvili et al., 2014), изоформы миелинового основного белка (17 и 14.4 кДа) (Крестинина et al., 2013), субъединицу F_oF₁-АТФ-азы (3.5 кДа) (Azarashvili et al., 2002). Мы обнаружили, что открытие мРТР коррелировало с изменением степени фосфорилирования белков. В настоящей работе было изучено изменение уровней фосфорилирования мажорных белков с молекулярной массой 46, 14.4 и 3.5 кДа в митохондриях, изолированных из исследуемых типов клеток в присутствии и отсутствие PPIX.

На рис. 5а, б показана авторадиограмма с включенной меченой [γ^–32P]АТФ в митохондриальные белки клеток глиомы С6 дикого типа, и в митохондриальные белки МГ с нокдауном. На этом же рисунке (а', б') показаны результаты денситометрии, отражающие количественные изменения уровней фосфорилирования белков. На рис. 5а показано, что уровень фосфорилирования белка с молекулярной массой 46 кДа в МГ дикого типа увеличивался при Са²⁺-индуцированном открытии мРТР на 60%, уровень белка с молекулярной массой 14.4 кДа не изменялся, а с молекулярной массой 3.5 кДа снижался на 45% по сравнению с контролем (без Са²⁺-индукции). PPIX усиливал степень включения [γ^–32P]АТФ в белок 46 кДа в 4 раза, в белок 14.4 кДа – на 50%, но снижал уровень фосфорилирования белка 3.5 кДа на 50% по сравнению с контролем (без Са²⁺-индукции). Добавление Са²⁺ к митохондриям, инкубированным с PPIX (МГ дикого типа), снижало уровень фосфорилирования белков 46 и 3.5 кДа на 50%, но существенно не изменяло уровень фосфорилирования белка 14.4 кДа по сравнению с действием только PPIX (без Са²⁺).

Рис. 5.

Влияние PPIX на изменение степени включения [γ^–32Р]АТФ в белки с молекулярной массой 46, 14.4 и 3.5 кДа митохондрий (МГ) из клеток глиомы С6 дикого типа (а, а') и с нокдауном по TSPO (б, б') при открытии мРТР. Пороговая концентрация Са²⁺ ([Ca²⁺]) – это та концентрация, при которой происходит открытие мРТР. а, б – Авторадиограмма включения меченной [γ^–32Р]АТФ. а', б' – Диаграмма, отражающая уровень фосфорилирования белков в митохондриях, изолированных их клеток глиомы С6 дикого типа и с нокдауном по TSPO соответственно; изменение достоверно по сравнению с (*) соответствующим значением в митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа и с нокдауом по TSPO, или по сравнению с (#) соответствующим значением в митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа и с нокдауном по TSPO в присутствии PPIX) при P < 0.05.

На рис. 5б показано, что в МГ с нокдауном при Са²⁺-индуцированном открытии мРТР уровень фосфорилирования белка 46 кДа не изменялся, тогда как уровень белка 14.4 кДа в этих условиях повышался на 20%, а белка 3.5 кДа снижался на 45% по сравнению с контролем (без Са²⁺). Добавление PPIX привело к повышению уровня фосфорилирования белка 46 кДа в 2 раза и снижению степени включения [γ^–32P]АТФ в белок 14.4 кДа на 25%, а в белок 3.5 кДа – на 40% по сравнению с контролем (без Са²⁺). В присутствии PPIX при Са²⁺-индуцированном открытии мРТР степень включения [γ^-32P]АТФ в белок 46 кДа не изменялась, в белок 14.4 кДа – повышалась на 40% и снижалась на 20% в случае белка 3.5 кДа по сравнению с действием одного PPIX (без Са²⁺).

Несмотря на то, что TSPO участвует в различных биологических функциях, регуляторные пути, связанные с ним, а также первичные механизмы действия TSPO мало изучены. Ранее мы наблюдали, что некоторые мембранно-связанные белки в митохондриях мозга и печени крыс подвергались фосфорилированию, регулируемому Са²⁺, как вторичным мессенджером (Azarashvili et al., 2002). Более того, было установлено, что уровень фосфорилирования сильно изменялся при Ca²⁺-индуцированном открытии мРТР. В настоящей работе мы предположили, что поскольку PPIX при функционировании мРТР может модулировать фосфорилирование белков, то TSPO можно считать важным участником в регуляции клеточного выживания. На основании полученных результатов, мы предполагаем, что TSPO может выполнять дополнительную роль в качестве модулятора фосфорилирования митохондриальных белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, мы изучили участие TSPO в функционировании мРТР. Объектом исследования были митохондрии, изолированные из клеток глиомы С6 дикого типа и с нокдаун по TSPO. В клеточных лизатах обоих типов клеток обнаружены мономер и димер TSPO. Поскольку в клетках глиомы С6 со сниженной экспрессией TSPO уровень как мономерного, так и димерного белка снижался, мы предположили, что TSPO способен участвовать в развитии опухолей. Дыхательный контроль в митохондриях, изолированных из клеток со сниженной экспрессией TSPO был ниже, чем в митохондриях, изолированных из клеток глиомы С6 дикого типа. Кроме того, пороговая концентрация Са²⁺ в митохондриях, изолированных из клеток с нокдауном по TSPO снижалась, что ускоряло открытие мРТР, а PPIX (лиганд TSPO) стимулировал открытие мРТР. Изменение мембранного потенциала коррелировало с изменением пороговой [Ca²⁺]. При функционировании мРТР, PPIX был способен модулировать фосфорилирование белков, и мы предположили, что TSPO можно считать важным регулятором клеточного выживания. На основании полученных результатов, мы предполагаем, что TSPO является важным белком в развитии и выживании клетки и может участвовать в функционировании мРТР.