Журнал аналитической химии, 2020, T. 75, № 4, стр. 291-315

ОСОБЕННОСТИ ПОРИСТОГО ГРАФИТИРОВАННОГО УГЛЕРОДА

Получение сорбента. Описаны многочисленные способы получения ПГУ и отмечено, что все они приводят к получению материалов с разными характеристиками [23]. Все способы включают четыре основные стадии: гомогенизацию, карбонизацию, удаление неорганических примесей и графитизацию.

Для получения углеродной фазы используют кремнезем (силикагель), пропитанный гомогенной смесью фенола и гексамина. Полученный продукт нагревают до 80–160°С для быстрой полимеризации [23]. Выбором кремнеземной матрицы (ее порами и морфологией) определяется размер и пористость получаемых частиц углерода. Затем полимер подвергают пиролизу в инертной атмосфере азота или аргона при 1000°С. Таким образом получается высокопористый аморфный углерод, который называют “сажей” (рис. 1a). Силикагелевую матрицу удаляют растворением в горячем водном растворе гидроксида калия. Данную стадию назвали гомогенизацией – она включает операции, обеспечивающие однородность структуры углеродного материала.

Рис. 1.

Электронные микрофотографии высокого разрешения аморфного углерода, полученного при 1000°С (a) и пористого графитированного углерода после графитизации при 2340°С (б) [24].

Полученный материал выдерживают при 1000°С и инертный газ заменяют на водород. Это приводит к реакции между водородом и свободными радикалами, которые могут присутствовать на углеродной поверхности при высоких температурах. В результате получается пористый графитированный углерод (рис. 1б). Данную стадию назвали карбонизацией – она включает ряд процессов, в том числе обугливание. Карбонизация также способствует образованию пор.

Полученный продукт характеризуется высокой сорбционной способностью, однако он может содержать неорганические примеси, такие как сера и кремнезем. Их удаляют нагревом при 1500–2000°С. Этот процесс сопровождается образованием большого количества дефектов, разупорядочением углеродных слоев и образованием микропор.

На заключительной стадии проводят графитизацию нагревом материала при 2000–3500°С в атмосфере аргона. Графитизация приводит к удалению дефектов и формированию трехмерной упорядоченной графитированной структуры [23], а также способствует запайке микропор.

В табл. 1 приведены сведения о коммерчески доступных пористых графитированных углеродных сорбентах. Сообщается также о пористых углеродных сорбентах Carbonex со средним размером частиц 7 мкм (производитель Tonen), BTR carbon со средним размером частиц 3.5 мкм (BioTech Research) и TSKgel Carbon (Nippon Carbon/Tosoh), однако в открытых литературных источниках нет более подробной информации о физических и химических параметрах данных сорбентов.

Структура пористого графитированного углерода. ПГУ представляет собой проводящий кристаллический материал из переплетенных графитовых лент (рис. 1б). Графитированные листы состоят из sp ²-гибридизованных атомов углерода, находящихся в гексагональном расположении. В листах атомы углерода связаны ковалентной связью. Листы удерживаются вместе с помощью Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Такая структура придает ПГУ механическую стабильность [24]. Пористый графитированный углерод отличается от трехмерного графита (рис. 2а), поскольку его слои не ориентированы регулярно (рис. 2б). Таким образом, он является “двумерным” графитом.

Рис. 2.

Кристаллические структуры графита: (а) – трехмерный графит со структурой Берналя, (б) – двумерный графит со структурой Уоррена [24].

Пористый графитированный углерод хорошо извлекает полярные соединения из водных растворов. Существовало несколько версий, объясняющих это явление. Первая предполагала, что, несмотря на специфический способ получения материала, на поверхности графита остаются гетероатомные функциональные группы. Вторая версия заключалась в том, что растворенные вещества могут взаимодействовать как с поверхностью, так и со сторонами графитовых лент, где, возможно, остаются активные центры [25, 26]. Также предполагалось, что атомы углерода, расположенные по краям листов, взаимодействуют с кислородом (на воздухе или в растворе), образуя различные функциональные группы. Однако спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии показали, что в ПГУ очень низкое содержание поверхностного кислорода (0.14 ат. %). При этом кислород в основном распределен по фенольным, карбонильным, лактоновым и хиноидным группам [8]. Однако, по мнению большинства исследователей, термическая обработка обеспечивает высокую однородность поверхности, сводя к минимуму наличие кислородсодержащих дефектов [27].

Свойства пористого графитированного углерода. Механизмы сорбции. Дисперсионные взаимодействия. Обнаружено изменение коэффициентов удерживания в зависимости от состава подвижной фазы и увеличение удерживания соединений с удлинением содержащихся в них углеводородных цепей. Это свидетельствуют о поведении сорбента как обращенной фазы, аналогичной неполярным фазам [28]. Независимо от состава водно-органической фазы наблюдали более высокую селективность ПГУ (сорбенты Hypercarb (Shandon Scientific, Великобритания) и Carbonex (Tonen, Япония)) к метиленовой группе в алкильном радикале молекулы аналита, чем октадецилсиликагеля (ОДС) [29–31]. Сила дисперсионных взаимодействий связана с поляризуемостью растворенного вещества и поверхности неподвижной фазы, а также с расстоянием между ними. Сделано предположение, что плоская поверхность ПГУ благоприятствует контакту с ней растворенного аналита, а поляризуемость поверхности ПГУ дополнительно усиливает дисперсионные взаимодействия.

Размер, геометрия и поляризуемость молекул растворителя также влияет на удерживание веществ на ПГУ [32]. Так, селективность ПГУ к метиленовой группе в алкильном радикале молекулы аналита зависит от элюирующей силы классических растворителей: воды, метанола, ацетонитрила, этилацетата, тетрагидрофурана, метиленхлорида и хлороформа [32]. Изучение удерживания серии гомологов метиловых эфиров жирных кислот или бензойной и фенольной кислот показало, что Hypercarb (5 мкм) является сильноудерживающим сорбентом, элюирование с которого может быть затруднено при использовании водно-органических подвижных фаз.

Полярные взаимодействия. Цель синтеза ПГУ – получение сорбента, состоящего из чистого углерода, абсолютно неполярного и лишенного остаточных силанольных групп, содержащихся в фазах ОДС. Таким образом, можно было ожидать, что хроматографическое разделение веществ на ПГУ будет аналогично разделению на ОДС с высоким содержанием углерода. Однако свойства ПГУ сильно отличаются от свойств классических неполярных фаз.

Тот факт, что при сорбции веществ на ПГУ реализуется несколько типов взаимодействий, впервые отмечен в работе [33]. Авторы указывают, что для объяснения удерживания веществ на ПГУ следует учитывать не только размер молекул аналита, но и электронодонорные свойства растворителя [33]. Они связали удерживание с параметрами, характеризующими полярность фрагментов молекул аналита, и выдвинули гипотезу о том, что за удерживание ответственны локализованные полярные сегменты аналитов.

В работе [30] сравненили удерживание ряда веществ на фазах ПГУ (сорбенты Hyprcarb и Carbonex) и ОДС [30]. Установлено, что любой дополнительный заместитель в структуре аналита, полярный или неполярный, вызывает увеличение удерживания вещества на ПГУ, в отличие от ОДС. Отмечено, что удерживание увеличивает поляризуемость аналита и возможность реализации плоской конформации аналита.

Данные по удерживанию на сорбенте Hypercarb (7 мкм) фенольных соединений [34–37], производных анилина [38], барбитуратов [39, 40], стероидов [41], ингибиторов моноаминооксидазы [42] и хлорфеноксиуксусной кислоты [43] также указывают на то, что поверхность графита чувствительна к электронной плотности аналитов, к электронодонорному или электроноакцепторному характеру функциональных групп аналитов, к их числу, положению и стерическим ограничениям в молекуле. Для описания таких закономерностей удерживания даже введен специальный термин “polar retention effect on graphite” (эффект полярного удерживания на графите) [8].

При объяснении механизма взаимодействия аналит–ПГУ обычно в первую очередь рассматривают делокализацию электронов на больших графитовых лентах, определяющую высокую поляризуемость поверхности [44–46]. Считают, что при приближении к поверхности ПГУ полярное вещество индуцирует поляризацию поверхности. Схематически это иллюстрирует рис. 3. Появление наведенного диполя на сорбенте зависит от поляризуемости поверхности, распределения заряда в аналите, расстояния между молекулой аналита и поверхностью. Сила взаимодействия также зависит от ориентации полярных функциональных групп аналита по отношению к поверхности графита.

Рис. 3.

Схематическое представление взаимодействия положительного (a) и отрицательного (б) зарядов на молекуле аналита с поверхностью графита [8].

Существуют и другие гипотезы, объясняющие взаимодействие веществ с поверхностью ПГУ. Сделано предположение [47], что электронная плотность перераспределяется на графитовых лентах ПГУ таким же образом, как в молекулах многоядерных ароматических углеводородов (рис. 4). Центральная часть графитовых лент, по мнению авторов, является электронно-дефицитной и имеет небольшой положительный заряд, близкий к нейтральному, тогда как на краях плоскостей имеется избыток электронов и, соответственно, отрицательный заряд (рис. 4). Благодаря этому молекулы неполярных веществ взаимодействуют с более или менее нейтральным центром графитовых лент, в то время как полярные молекулы взаимодействуют с краями тех же лент [48].

Рис. 4.

Распределение электронной плотности на краю многоядерного ароматического углеводорода. Приведен фрагмент молекулы вблизи ее края. Зона В (периферийная) представляют собой область с избытком электронов и, соответственно, имеет отрицательный заряд; зона Б – нейтральная область; зона А является электронодефицитной и имеет небольшой положительный заряд, близкий к нейтральному (адаптировано из [47]).

Уникальные хроматографические качества ПГУ делают его подходящей фазой для разделения как полярных, так и неполярных веществ. При разделении полярных веществ ПГУ показал себя идеальной альтернативой классическим малополярным фазам, которые часто не способны хорошо удерживать полярные аналиты с низкой липофильностью [49, 50].

Установлено, что на сорбенте Hypercarb (размер частиц 5 и 7 мкм) также могут удерживаться ионы (анионы [51–54] и катионы [55, 56]). В некоторых работах, например [57], считают, что поверхность ПГУ (или ее часть) положительно заряжена, что обеспечивает ПГУ свойства слабого анионобменника, тогда как катионообменная способность ПГУ незначительна. Однако в другой работе [58], посвященной использованию сорбента Hypercarb (5 мкм) в электрохроматографии, показано, что поверхность ПГУ отрицательно заряжена, поскольку частицы ПГУ притягиваются к положительно заряженному электроду. На этом, в частности, основан способ определения фенилмочевины методом капиллярной электрохроматографии с помощью ПГУ [59].

При разделении неорганических катионов или аминокислот методом ВЭЖХ на сорбенте Hypercarb (5 мкм) [60] в некоторых случаях вводили ион-парные реагенты [55, 61–63], а при разделении/определении ряда неорганических и небольших органических анионов [64–69] добавляли конкурирующие агенты – соли, такие как хлорид натрия, дигидрофосфат калия и др.

Из-за планарного характера лент ПГУ геометрическая форма молекулы аналита, в частности, его способность принимать плоскую конформацию, может существенно влиять на удерживание. Изучение термодинамики сорбции [70] и применение расчетных методов [71] подтвердили это предположение. При этом влиянием возможной “кривизны” графитовых лент обычно пренебрегали, поскольку считали, что на молекулярном уровне эту кривизну можно не учитывать.

В том случае, если аналит содержит алкильные заместители, их расположение на поверхности ПГУ не всегда очевидно, особенно в случае коротких алкильных цепей. Будут ли они принимать “растянутую” конформацию и контактировать с максимально возможной площадью поверхности углерода или будут “свернуты”, что уменьшит возможную площадь контакта, неизвестно [72]. Как правило, при увеличении длины алкильного радикала увеличивается удерживание аналита на сорбенте. Этот эффект менее выражен в случае молекул аналитов с разветвленными заместителями [31]. Это свойство использовали для разделения изомеров нефлавоноидных полифенолов [73].

При сорбции плоских ароматических молекул естественно предположить, что они расположены параллельно поверхности, если это позволяет наличие и положение заместителей. Объемный заместитель (например, трет-бутильная группа), расположенный близко к ароматическому кольцу, будет нарушать тесный контакт между ароматическим кольцом аналита и поверхностью ПГУ [25]. Так, установлено, что порядок элюирования изомерных ксилолов с сорбента Hypercarb противоположен наблюдаемому в классической обращенно-фазовой ВЭЖХ, что можно объяснить только вариациями площади контакта между ароматическим кольцом и плоской поверхностью ПГУ: более низкое удерживание мета-ксилола связано с меньшим числом точек контакта между этим изомером и поверхностью (три точки контакта, в отличие от четырех для орто- и пара-изомеров) [25].

В молекулах бифенилов возможно вращение ароматических колец относительно друг друга. В этом случае возможна реализация конформаций, обеспечивающих тесный контакт с поверхностью ПГУ, особенно в том случае, когда энергия адсорбции больше энергии вращательной деформации [74]. Однако это взаимодействие резко ослабляется при наличии объемного заместителя в орто-положении. На этом основан способ разделения полихлорбифенилов на сорбенте Hypercarb (7 мкм) [74].

Удерживание полярных веществ на ПГУ связано с расположением полярной группы в молекуле и уменьшается при наличии стерических препятствий при контакте этой группы с поверхностью [27]. Так, при разделении соединений, относящихся к одному изомерному ряду, наблюдали, что снижение числа и объема заместителей вблизи полярной группы приводило к увеличению удерживания на сорбенте Hypercarb (7 мкм) [31, 67]. Таким образом, механизм удерживания веществ на ПГУ не может быть описан с помощью подхода Снайдера, разработанного для адсорбционной хроматографии с использованием нормальной фазы [43], поскольку этот подход предполагает удерживание полярных аналитов за счет вытеснения адсорбированных молекул элюента с поверхности сорбента полярной частью молекулы.

Устойчивость пористого графитированного углерода в экстремальных условиях. ПГУ более устойчив и химически стабилен по сравнению с сорбентами на основе диоксида кремния. Подтверждена его устойчивость в широком интервале кислотности (от 10 М растворов кислот до 10 М щелочных растворов) [75], хотя производители утверждают, что данный сорбент способен работать только в диапазоне pH от 1 до 14. Это свойство позволяет сорбировать и разделять вещества в нейтральной форме: основные – при высоких значениях рН [76] или кислые – при низких [75, 77].

Пористый графитированный углерод устойчив при высоких температурах, что обеспечивает его использование, например, в высокотемпературной жидкостной хроматографии (ВТ-ВЭЖХ), сорбции, хроматографии с применением субкритических жидкостей и сверхкритических флюидов. Исследования показали, что он является стабильным до 200–250°C [78–80]. При эксплуатации в этих условиях эффективность колонки со временем несколько снижалась, однако авторы работы [81] связали это с уплотнением сорбента Hypercarb (5 мкм) в колонке из-за различий в коэффициентах теплового расширения углеродного материала и материала корпуса колонки (нержавеющей стали) при многих циклах нагрев–охлаждение [82].

Окислительно-восстановительные свойства пористого графитированного углерода. На электронную структуру ПГУ могут влиять процессы окисления и восстановления. В исходном состоянии ПГУ обладает некоторой окислительной активностью, что согласуется с рассчитанным локальным электронным дефицитом [83]. Однако до конца неясно, являются ли некоторые наблюдаемые реакции окисления в присутствии ПГУ (например, окисление двухвалентного кобальта в трехвалентный) результатом только действия ПГУ, или же действием растворенного в подвижной фазе кислорода, тогда как ПГУ при этом выступает в роли катализатора [84]. По оценке [85] окислительно-восстановительный потенциал ПГУ (BTR carbon 3.5 мкм, Япония) варьируется в диапазоне приблизительно от –0.2 до 0.5 В, в то время как другое исследование показало, что потенциал суспензии частиц сорбента Hypercarb (5 мкм) составляет 0.35 В [83]. В обоих случаях использовали хлоридсеребряный электрод сравнения.

При обработке восстановителем (например, если восстанавливающий агент в виде сульфита натрия присутствует в подвижной фазе), ПГУ приобретает восстановительную активность [57, 84, 85]. После обработки ПГУ (сорбент BTR carbon 3.5 мкм, Япония) окислителем его исходные хроматографические свойства восстанавливаются. Это свойство ПГУ позволило разработать способ on-line дериватизации пирокатехина, тирозина, гидрохинона и резорцина. При хроматографическом разделении на колонку подают напряжение, что переводит соединения из молекулярной формы в ионизированное состояние. Этот прием позволяет увеличить времена удерживания некоторых аналитов и улучшить разделение [86, 87].

Следует отметить, что эффект окислительно-восстановительной обработки ПГУ не зависит от марки и производителя; аналогичную картину наблюдали для Hypercarb®, BRT Carbon® и TSK-gel Carbon 500®.

Электропроводящие свойства. Как и многие другие углеродные материалы, ПГУ обладает электропроводящими свойствами. Эти свойства ПГУ применяли в жидкостной хроматографии с электрическим модулированием (EMLC), где стационарную фазу используют не только для разделения веществ, но и в качестве рабочего электрода. Путем изменения приложенного потенциала к стационарной фазе можно регулировать потенциал ее поверхности и, следовательно, удерживание аналитов, причем не только ионов, но и нейтральных молекул. Такой способ применен для разделения неорганических анионов, ионов бензолсульфоната и стероидов на сорбенте Hypercarb (5 мкм) [88–90]. Также была продемонстрирована возможность разделения бензодиазепинов [91, 92].

Электропроводящие свойства могут быть и недостатком. Отмечено, что из-за проводящих свойств ПГУ при сочетании ВЭЖХ и масс-спектрометрии (МС) с электрораспылением необходимо заземление между хроматографической колонкой и входом в распылительную камеру. В противном случае возможно возникновение электрического потенциала на неподвижной фазе, что влияет на параметры разделения веществ [93]. Этот негативный эффект исчезает при наличии заземления.

Модифицирование поверхности пористого графитированного углерода. В ряде случаев с целью снижения удерживания некоторых аналитов или для повышения селективности их разделения или концентрирования проводят модификацию поверхности ПГУ, обычно нековалентную. Описана модификация поверхности ПГУ осаждением на его поверхности другой углеродной фазы – так называемого “стеклообразного углерода” [94]. Отмечено, что эта процедура снижает дисперсионные взаимодействия, но не влияет на разделение компонентов [95].

Ковалентная функционализация поверхности ПГУ долгое время считалась сложной задачей, поскольку традиционные приемы, используемые для модифицирования диоксида кремния, неприменимы для введения функциональных групп в состав углеродных материалов. При этом нековалентная иммобилизация реагентов возможна и достаточно широко применяется для получения новых сорбентов на основе ПГУ. Как и при нековалентной иммобилизации реагентов на других матрицах с целью получения хроматографических неподвижных фаз, необходимо, чтобы реагент-модификатор достаточно сильно удерживался на поверхности ПГУ в процессе эксплуатации, но при этом обеспечивались условия для периодической регенерации поверхности [96].

Установлено, что снизить способность ПГУ к удерживанию полярных веществ можно обработкой полиэтиленгликолем [97] или неионными поверхностно-активными веществами [98]. Обработкой поверхности ПГУ полимерами и ионными соединениями получали новые ионообменные стационарные фазы [99–101].

Наибольшее число работ по модификации ПГУ посвящено закреплению хиральных селекторов для разделения энантиомеров [98, 102–105]. Отмечено, что в качестве фрагмента молекулы хирального селектора, ответственного за взаимодействие с поверхностью углеродного материала, арильный фрагмент более эффективен, чем алкильный [102]. Неподвижные фазы, полученные таким путем, иногда более селективны, чем аналогичные фазы на основе кремнеземов, поскольку сам ПГУ может принимать участие в хиральном разделении. Для разделения веществ использовали как предварительно модифицированный Hypercarb (7 мкм) [102], так и исходный немодифицированный, вводя хиральный селектор в состав подвижной фазы [103]. В последнем случае хиральное распознавание может происходить как в подвижной, так и на неподвижной фазе после сорбции хирального селектора.

Описаны немногочисленные примеры ковалентной иммобилизации функциональных групп. Так, например, якорные группировки можно ввести на поверхность сорбента Hypercarb (7 мкм) путем электровосстановления или химического восстановления солей арендиазония [106, 107]. Этот способ часто используют для модификации поверхности угольных электродов [107], хотя он также применим для получения хроматографических стационарных фаз с ковалентно закрепленными группами. Такие фазы более устойчивы в агрессивных средах, чем аналогичные на основе кремнеземов.

Сравнение пористого графитированного углерода с другими сорбентами для разделения/концентрирования. Сорбционные свойства ПГУ существенно отличаются от свойств классических обращенно-фазовых сорбентов, особенно при концентрировании и разделении полярных веществ [37].

Сорбенты HILIC, полярные октадецилсиликагели. Поскольку ПГУ обладает способностью удерживать полярные соединения, его в первую очередь сравнивают с сорбентами, специально разработанными для решения аналогичных задач, например гидрофильными фазами HILIC [108], полярными сорбентами на основе ОДС [109] и стационарными фазами смешанного типа [110]. Показано, что некоторые аналиты, например нейротрансмиттеры, лучше удерживаются и делятся на сорбенте Hypercarb (5 мкм), чем на полярно-внедренных и содержащих полярные концевые группы ОДС [111]. Сравнение с HILIC не дало однозначного ответа: в некоторых работах предпочтение отдают HILIC (при определении тирозина, норадреналина, адреналина, серотонина, допамина) [112], в других показано, что полярные вещества лучше удерживаются на сорбенте Hypercarb (5 мкм) (при определении акриламида) [113]. Присутствие в пищевых продуктах акриламида широко обсуждалось в литературе [113]. В этом случае ПГУ, по-видимому, является единственным сорбентом, обеспечивающим достаточное удерживание этого полярного соединения для его количественного определения.

Помимо селективности разделения аналитов на ПГУ, важный вклад в общую эффективность анализа вносит сочетание разделения с последующим детектированием. Например, состав элюента может оказать сильное влияние на эффективность ионизации аналитов при использовании ВЭЖХ-МС с электрораспылением или с другими источниками ионизации при атмосферном давлении. Обычные подвижные фазы для обращенно-фазовой ВЭЖХ (смеси воды с ацетонитрилом или метанолом) подходят для масс-спектрометрического детектирования аналитов. В этом случае относительно большое (по сравнению с разделением на ОДС) содержание органического растворителя, необходимое для элюирования полярных соединений с колонки ПГУ, даже способствует увеличению чувствительности при использовании электрораспыления [114].

Другим преимуществом использования ПГУ для разделения в сочетании с МС-детектированием, является устойчивость при контакте с подвижными фазами, содержащими высокие концентрации муравьиной или трифторуксусной кислот [112].

Электронно-обогащенные стационарные фазы. Как уже упоминалось выше, ПГУ является материалом с делокализованными электронами, обеспечивающими электропроводящие свойства. Делокализованные электроны преимущественно находятся в приповерхностном слое, поэтому неподвижные фазы с такими характеристиками можно называть “электронно-обогащенными”. В этом плане интересно сравнить свойства ПГУ и сорбента, полученного термической обработкой глины [115]. Поверхность последнего состоит из слоя силоксановых и силанольных звеньев с адсорбированными катионами натрия и молекулами воды. Такая поверхность, как и поверхность ПГУ, обогащена электронами. Показано несомненное сходство этих двух сорбентов по отношению к сильно- и среднеполярным аналитам (фенолу, толуолу, пара-крезолу, нитробензолу и изомерам динитробензола, хлорбензолу и изомерам дихлорбензола); на термически обработанной глине так же, как и на ПГУ удерживание регулируется стерическими и электронными эффектами.

Диоксид циркония, покрытый углеродом. Производство ПГУ длительно и затратно, поэтому актуален интерес к аналогичным, но более дешевым материалам, таким как диоксид циркония, покрытый углеродом (carbon clad zirconia, CCZ). Его получают двумя способами: высокотемпературной графитизацией органических полимеров, покрывающих подложку из диоксида циркония [95], или химическим осаждением углерода из паровой фазы на диоксиде циркония. Последний метод более распространен и заключается в том, что летучие органические соединения пропускают над частицами диоксида циркония при высокой температуре (700°С) и при пониженном давлении [116]. Соединения разлагаются с образованием тонкого слоя атомов углерода на поверхности диоксида циркония. Установлено, что “химия” поверхностей CCZ и ПГУ сопоставима. Частицы CCZ также обладают высокими механической прочностью и химической стабильностью.

Показано, что, несмотря на различие в способах получения сорбентов, ПГУ и CCZ проявляют близкие хроматографические свойства [81, 95]. Это сходство может показаться удивительным, так как ПГУ характеризуется высокой степенью графитизации, в то время как на поверхности CCZ присутствует лишь монослой углерода, который, вероятно, не графитизирован, а может быть образован монокристаллическими структурами [117]. Установлено, что поверхность CCZ не является однородной, часть ее не покрыта углеродом. Доля поверхности с углеродным покрытием обычно составляет от 60 до 95% [118]. На остальной поверхности присутствуют остаточные группы диоксида циркония, проявляющие кислотные свойства (аналогично остаточным силанольным группам на поверхности модифицированных кремнеземов) [119]. Наличие таких участков, отсутствующих у ПГУ, может вызывать уширение хроматографических пиков и появление “хвостов”, а иногда и необратимую сорбцию аналитов. Этим объясняют различия, наблюдаемые при использовании соответствующих хроматографических колонок [120]. Кроме того, CCZ менее устойчив к высоким температурам, чем ПГУ [109, 117].

Ароматические стационарные фазы. Расстояние между соседними атомами углерода в одной и той же плоскости графита составляет 0.142 нм и примерно соответствует расстоянию между атомами углерода в полициклических ароматических углеводородах (ПАУ). В принципе, ПГУ можно рассматривать как ПАУ, состоящий из 10⁵ атомов углерода [121]. В некоторых исследованиях наблюдали подобное поведение при разделении веществ на ПГУ и кремнеземах с закрепленными фенильными, нафтильными или пиренилными группами [30]. Таким образом, специфичные свойства ПГУ могут быть связаны и с его “псевдоароматическим” строением.

Углеродные наноматериалы. Как уже обсуждалось, углеродные наноматериалы (нанотрубки, наноалмазы, фуллерены) используют для разделения и концентрирования веществ. Отмечено, что разделение веществ на ПГУ и наноалмазах сильно различается, так как последние содержат в своем составе функциональные группы – карбоксильные, гидроксильные, эфирные, нитрогруппы [122–124].

Установлено сходство в поведении полярных веществ при сорбции на ПГУ и фуллеренах [8]. При увеличении полярности аналитов их удерживание увеличивалось. В отличие от поверхности ПГУ, поверхность других углеродных материалов характеризуется локальной изогнутостью, поэтому предположили, что последние будут проявлять большее, чем у ПГУ, сродство к непланарным конформациям молекул [8].

Для улучшения механических свойств УНТ включали в монолитную стационарную фазу органического полимера или наносили на внешнюю поверхность частиц диоксида кремния [8]. Характеристики удерживания полученной стационарной фазы близки к характеристикам ПГУ.

ПРИМЕНЕНИЕ ПОРИСТОГО ГРАФИТИРОВАННОГО УГЛЕРОДА В ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

Сочетание хороших механических свойств и высокого сродства к полярным веществам обеспечивает ПГУ широкое применение в химическом анализе как для разделения, так и для концентрирования аналитов.

Разделение веществ с использованием пористого графитированного углерода. Обращенно-фазовые сорбенты обычно не обеспечивают достаточного удерживания полярных веществ. Чтобы повысить их удерживание, используют различные приемы: в подвижную фазу добавляют ион-парные реагенты, повышают гидрофильность неподвижной фазы выбором соответствующих сорбентов (например, HILIC) или вообще переходят от обращенно-фазовой к ионообменной хроматографии (для тех задач, где это возможно). Подвижные фазы, применяемые в ионообменной и ион-парной хроматографии, часто несовместимы с такими методами детектирования, как МС и ELSD (детектирование по светорассеянию). Пористый графитированный углерод в наибольшей степени подходит для решения таких задач. Использованию таких сорбентов в ВЭЖХ посвящено большое число оригинальных статей и обзоров, например [8, 125], особое внимание уделяли разделению/определению нуклеотидов и нуклеозидов, аминокислот и пептидов, углеводов, маркеров применения химического оружия и взрывчатых веществ, а также разделению изомеров, включая диастереомеры.

Разделение полярных ароматических соединений. Исследовано поведение шести групп ароматических кислот на сорбенте Hypercarb (7 мкм) [126]. Установлено, что порядок элюирования варьируется в зависимости от типа заместителей, однако не может быть предсказан на основании структур изомеров. Значения рН подвижной фазы изменяли от 2 до 9.4, и удерживание веществ коррелировало со степенью их диссоциации, причем хуже всего удерживались наиболее диссоциированные вещества. Отмечено, что важно учитывать ориентацию полярных молекул относительно плоской поверхности графита. Сравнительное исследование удерживания изомеров ароматических молекул на ПГУ и октадецилсиликагеле [127] показало, что ПГУ проявляет более высокую селективность по отношению к позиционным изомерам, чем ОДС, что можно объяснить большей дискриминирующей способностью, обусловленной плоской поверхностью ПГУ.

Hyprcarb (3 мкм) применяли для разделения изомеров метаболитов крезола в образцах мочи [128] (рис. 5).

Рис. 5.

Разделение метаболитов крезола на пористом графитированном углероде [128]. Условия разделения: колонка – Hypercarb 3 мкм, 100 × 4.6 мм; подвижная фаза — вода–метанол (1 : 1) + 0.1%-ная трифторуксусная кислота; скорость потока — 1 мл/мин; УФ-детектирование при 240 нм. Аналиты (кислоты): миндальная (1), 2-метилгиппуровая (2), гиппуровая (3), фенилгилоксиловая (4), 4-гидроксибензойная (5, внутренний стандарт), 3-метилгиппуровая (6), 4-метилгиппуровая кислота (7).

При разделении смеси п-нонилфенолов на сорбенте Hypercarb (7 мкм) зарегистрировано 12 пиков, каждый из которых соответствовал группе изомеров [129]. Известно, что п-нонилфенол, продукт деградации нонилфенолполиэтоксилатных поверхностно-активных веществ, образует множество структурных изомеров. Как правило, при разделении методом ВЭЖХ п-нонилфенолов на колонках с октадецилсиликагелем регистрируют один широкий пик, использование же ПГУ позволило разделить все вещества.

На сорбенте Hypercarb (5 мкм) разделяли позиционные изомеры монозамещенного сульфобутилового эфира β-циклодекстрина [130]. Эти изомеры не могут быть разделены на обычных обращенно-фазовых сорбентах, но хорошо делятся на ПГУ. Авторы работы [130] предположили, что эти гидрофильные и анионные соединения удерживаются по обращенно-фазовому механизму, а электронные взаимодействия играют второстепенную роль. Методика с использованием ПГУ обеспечила хорошее разделение при анализе неочищенной смеси монозамещенного сульфобутилового эфира β-циклодекстрина и позволила быстро определить количество каждого изомера. Возможность разделения смеси в изократических условиях (элюент – смесь водного раствора ацетата аммония с ацетонитрилом) допускает возможность простого масштабирования до полупрепаративного хроматографического разделения таких синтетических смесей.

Алкалоиды пиперидинового типа с антивирусной активностью – изомеры шуманифицина и N-метилсульмантинина – разделяли на колонке с сорбентом Hypercarb (7 мкм) [131]. На капиллярной колонке с сорбентом Hypercarb (5 мкм) методом ВЭЖХ-МС разделяли смеси алкалоидов тропана из коры растения Schizanthus grahamii (Solanaceae) [132]. Разработан быстрый и простой метод разделения четырех изомеров эфиров тропана (гидроксипропановых эфиров). При 60°С достигнута исключительная селективность разделения всех изученных алкалоидов.

Изомеры гормонов – эквилин-3-сульфат и D-8,9-дегидроэстон-3-сульфат, строение которых различается только положением олефиновой связи в стероидном кольце, как правило, не разделяются на колонках с октадецилсиликагелем или другими алкилированными силикагелями. Частичное разделение с разрешением 1.5 наблюдали только на дифенильной фазе, тогда как на колонке с сорбентом Hypercarb (5 мкм) достигнуто разделение с разрешением 19 [133]. Найдены также условия разделения более сложных смесей изомеров гормонов: эквилин-3-сульфата, D-8,9-дегидроэстон-3-сульфата, эстрон-3-сульфата, 17α-дигидроэквилин-3-сульфата.

С помощью сорбента Hypercarb (5 мкм) разделяли и другие изомеры – разветвленные олигосахариды, полученные ферментативной деградацией, лейцин, изолейцин, алло-изолейцин и гидроксипролин [125], цис-транс-изомерные родственные вещества ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы для лечения ВИЧ-инфекций [134].

Многие фенольные соединения весьма гидрофильны и их разделение/определение с использованием традиционных обращенно-фазовых сорбентов затруднено. Пористый графитированный углерод больше подходит для решения таких задач. Предложено ВЭЖХ-МС-определение ванилина, протокатехиновой, кофеиновой, кумариновой, галловой и сиреневой кислот (сорбент Hypercarb (5 мкм)) [135]. Аналиты разделяли в условиях градиента концентрации тетрагидрофурана (ТГФ) в подвижной фазе, который редко используют в ВЭЖХ-МС. Найдено, что при химической ионизации при атмосферном давлении и режиме регистрации отрицательных ионов присутствие ТГФ не ухудшало сигналы аналитов. Отмечена высокая селективность предложенного способа.

Углеводы. Разделение смесей углеводов является сложной задачей из-за большого разнообразия структур и высокой растворимости веществ в воде, что затрудняет их удерживание на модифицированных кремнеземах и полимерных фазах. В отличие от последних, ПГУ широко использовали для анализа смесей олигосахаридов [95], циклодекстринов [136], алкилгликозидов [72], разветвленных олигосахаридов [137], фосфатов сахара [138], N-гликанов и O-гликанов [139], гликопротеинов и гликопептидов [140]. Предложен ВЭЖХ-МС/МС-метод определения ключевых гликолитических промежуточных продуктов, сахаров и фосфатов сахара из растений с использованием стационарной фазы ПГУ (сорбент Hypercarb 5 мкм) и подвижными фазами, совместимыми с МС (вода, ацетонитрил, 15%-ная муравьиная кислота) [79].

Разработан метод ВЭЖХ-МС одновременного определения акриламида, аспарагина, фруктозы, глюкозы и сахарозы в экстрактах хлеба с использованием способности ПГУ удерживать сильно полярные аналиты (сорбент Hypercarb 5 мкм) [113].

Установлено, что использование ПГУ для разделения каррагинанов – сульфатированных полисахаридов, извлекаемых из водорослей – имеет преимущества перед ионообменным хроматографическим разделением, поскольку одновременно реализуемые механизмы гидрофобного и электронного взаимодействия позволяют лучше регулировать разрешение между пиками, особенно при использовании водно-органического элюента [141] (рис. 6). Предложен ВЭЖХ-МС-метод разделения/определения ферментативно расщепленных олигосахаридов k-каррагинана [142]. Его особенность состоит в том, что подвижная фаза (раствор гидрокарбоната аммония в смеси вода–ацетонитрил), используемая для разделения, одновременно позволяет детектировать аналиты в виде депротонированных ионов (даже для олигосахаридов с более чем шестью сульфатными группами), что дает информацию о положении сульфатной группы в структуре олигосахарида. Отмечено, что это является существенным преимуществом по сравнению с разделением/определением аналитов с помощью ион-парной ВЭ-ЖХ-МС с электрораспылением.

Рис. 6.

Разделение олигомеров k-каррагинана на колонке с пористым графитированным углеродом [141]. Подвижная фаза: А – вода, Б – 700 мМ ацетат аммония в 15%-ном ацетонитриле; градиент: увеличение концентрации Б в элюенте от 0 до 70% за 45 мин. В работе [141] пики аналитов не идентифицировали, цифровые обозначения пиков указывают на предполагаемое авторами число мономерных звеньев в олигомере; штрихи обозначают аномеры основных аналитов.

Особенность ПГУ – его плоская на микроуровне поверхность – улучшает разделение близких по структуре соединений. При ВЭЖХ-разделении углеводов на удерживание влияет не только размер, но и “плоскостность” молекулы [125]. Отмечено, что большой интерес к использованию ПГУ в этой области основан на его долговременной стабильности, позволяющей долго использовать колонки с сорбентом без снижения воспроизводимости для эффективного разделения как нейтральных, так и анионных олигосахаридов. Особенная способность графита к разделению изомеров также является важным параметром, способствующим успешному использованию ПГУ.

Нуклеотиды, нуклеозиды. Показано, колонки ПГУ эффективно разделяют смеси нормальных и модифицированных нуклеотидов, нуклеозидов, а также веществ, полученных в результате ферментативного гидролиза фотоокисленных олигонуклеотидов, определение которых важно при изучении окислительного повреждения ДНК [143]. Предложен метод одновременного определения гипоксантина, ксантина, гуанина и аденина в образцах тканей моллюсков (сорбент Hypercarb 7 мкм) [75]. Метод включает изократическое элюирование, характеризуется простотой и экспрессностью. Его предложено использовать в качестве альтернативы общепринятым методам контроля качества употребляемых в пищу морепродуктов. Отмечено, что условия разделения смесей нуклеозидов, их моно-, ди- и трифосфатов с использованием стационарной фазы ПГУ (сорбент Hypercarb 5 мкм) подходят для масс-спектрометрического детектирования [144]. Предложены различные водно-органические элюенты и модификаторы для градиентного разделения смеси 16 нуклеозидов и нуклеотидов. Показано, что на колонках с кремнеземными сорбентами эти смеси не разделяются. Рис. 7 иллюстрирует разделение некоторых циклических монофосфатных нуклеотидов.

Рис. 7.

Разделение циклических 3',5'-монофосфатов нуклеотидов [144]. Колонка — Hypercarb (3 мкм, 100 × 0.32 мм). Подвижная фаза: А – 20 мМ раствор ацетата аммония, pH 5.5; Б – ацетонитрил; градиент — от 10 до 30% фазы Б за 15 мин; скорость потока 6 мкл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Аналиты: 3',5'-циклический цитидин монофосфат (1); 3',5'-циклический уридин монофосфат (2); 3',5'-циклический гуанозин монофосфат (3); 3',5'-циклический аденозин монофосфат (4).

Разработан метод одновременного ВЭЖХ-определения урацила и дигидроурацила в плазме крови с использованием сорбента Hypercarb (5 мкм) [145]. Эти соединения плохо удерживаются на колонках с сорбентами на основе октадецилсиликагеля даже в водном элюенте, в то время как ПГУ обеспечил их хорошее удерживание и разделение. Этот метод в настоящее время используется в клинической практике. Предложен метод ВЭЖ-Х-МС/МС-определения 5-фторурацила (перорального лекарственного препарата Ftorafur, используемого при лечении рака желудка), 5-фторурацила и 5-фтор-5,6-дигидроурацила в плазме крови человека для фармакокинетических исследований (сорбент Hypercarb 5 мкм) [146].

Аминокислоты и пептиды. Предложен метод определения 20 аминокислот без применения высаливания с разделением на колонке с сорбентом Hypercarb (5 мкм) в виде ионных ассоциатов с неофторопентановой кислотой и детектированием по светорассеянию [147]. Эта система характеризуется меньшим временем уравновешивания колонки, чем при применении колонки с ОДС. Порядок элюирования аналитов при использовании ПГУ иной, чем в случае ОДС, что делает эти хроматографические системы взаимодополняющими при определении следовых количеств аминокислот. Сорбент Hypercarb (5 мкм) также применяли для разделения небольших пептидов (ди-, три-, тетрапептидов), аналиты детектировали по светорассеянию [148]. Предложен способ одновременного определения таурина, гипотаурина и тиотаурина в тканях морских беспозвоночных методом ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылением (сорбент Hypercarb 5 мкм) [149]. Разделение аналитов на ПГУ возможно в изократических условиях (элюент – водный 10 мМ раствор ацетата аммония, рН 9.3). Время разделения этих метаболитов – менее 10 мин, дериватизация не требуется.

Изучено удерживание 14 пептидов на сорбенте Hypercarb (7 мкм) с использованием подвижной фазы ацетонитрил–вода [150]. Удерживание уменьшалось с увеличением концентрации ацетонитрила, достигало минимума и снова увеличивалось с увеличением концентрации ацетонитрила в области его высоких содержаний. Установлено, что пептиды удерживаются по смешанному механизму, имеют место гидрофобные и электронные взаимодействия, большую роль в удерживании играют структурные особенности аналитов.

Моно-, ди-, три-, тетрапептиды и фосфопептиды слабо удерживаются на обычных обращенно-фазовых сорбентах, их разделение в этом случае проблематично. Сорбент Hypercarb (7 мкм) позволяет решить задачу определения этих аналитов [150] (рис. 8).

Рис. 8.

Разделение гидрофильных пептидов [150]. Колонка: Hypercarb (5 мм, 50 × 2.1 мм). Подвижная фаза: А – 0.1%-ная муравьиная кислота в воде, Б – 0.1%-ная муравьиная кислота в ацетонитриле; градиент: увеличение содержания фазы Б от 5 до 100% в течение 10 мин; скорость потока 0.2 мл/мин; температура колонки 30°С. Аналиты: Arg–Gly–Glu–Ser (1), Asp–Ser–Asp–Pro–Arg (2), Gly–Tyr (3).

Алкилфосфоновые и О-алкилалкилфосфоновые кислоты. Эти вещества являются маркерами применения боевых химических отравляющих веществ, таких как зарин, зоман, VX. Они весьма гидрофильны и слабо удерживаются на большинстве обращенно-фазовых сорбентов. Режим HILIC также не позволяет решить эту проблему. Обычно эти вещества определяют с применением дериватизации. Показано, что без дериватизации они хорошо удерживаются на ПГУ из водных растворов [151].

Так, для разделения изомеров изопропил-, н-пропил- и этилметилфосфоновых кислот на ПГУ Hypercarb предложен оригинальный ступенчатый градиентный режим элюирования, включающий промывку хроматографической колонки деионизованной водой перед инжектированием и дальнейшее разделение аналитов раствором муравьиной кислоты. Предложенный прием обеспечивает увеличение времен удерживания всех слабоудерживаемых аналитов, их разделение, а также позволяет улучшить симметрию пиков на хроматограммах [152–155]. С использованием предложенного приема разработаны способы экспрессного ВЭЖХ-МС-определения алкилфосфоновых, О-алкилметилфосфоновых кислот, а также глифосата, аминометилфосфоновой кислоты и глюфосината в водных растворах и природных водах. Показано, что разработанные способы позволяют определять аналиты на уровне 2–13 нг/мл при использовании трехквадрупольного масс-спектрометра.

Разделение веществ при экстремальных температурах. В отличие от большинства обращенно-фазовых сорбентов, ПГУ выдерживает воздействие высоких температур, что обеспечивает возможность его применения в высокотемпературной жидкостной хроматографии (ВТ-ВЭЖХ).

Хотя анализы методом ВЭЖХ обычно проводят при комнатной температуре или немного выше комнатной, отмечен ряд преимуществ, которые достигаются при более высоких температурах [156]. Среди них – уменьшение продолжительности анализа при сохранении скорости подачи подвижной фазы, снижение вязкости подвижной фазы, открывающее возможность использования более высоких скоростей потока с ограниченным противодавлением без снижения эффективности разделения, повышение симметрии пиков [157]. К сожалению, самые распространенные хроматографические колонки на основе диоксида кремния неустойчивы при температурах выше 60°С, поскольку гидролиз силоксановых связей усиливается при высоких температурах.

Сорбент Hypercarb (5 мкм) использовали для определения лекарственного препарата Циклоспорин в липосомах [158], при этом исследовали влияние температуры на разделение аналитов в диапазоне температур от –13 до +95°C. Увеличение температуры позволило улучшить симметрию пиков и разделение аналитов. ПГУ также использовали для разделения смесей стеринов во фруктовых соках при температурах от 25 до 150°C. Сравнивали результаты, полученные с помощью колонок с сорбентом Hypercarb (5 мкм), с ОДС и нанесенным на диоксид циркония углеродом. Отмечено, что при повышенной температуре колонка с ПГУ позволят достичь наибольших коэффициентов емкости. Повышение температуры также позволило значительно снизить продолжительность анализа и определять стерины во фруктовых соках менее чем за 1 мин [159]. Исследовали влияние температуры на разделение этоксилатов октилфенола на разных стационарных фазах, в том числе на Hypercarb (5 мкм), в диапазоне температур от 20 до 100°С [160]. Установлено, что механизм сорбции аналитов не зависит от температуры. При этом малоразмерные олигомеры элюируются раньше, чем крупные. Повышение температуры приводит также к снижению продолжительности анализа, порядок элюирования аналитов такой же, что и при использовании сорбентов на основе силикагеля, диоксида циркония и сшитого полистирол-дивинилбензола. Показано, что при использовании сорбента Hypercarb (5 мкм) симметрия пиков при разделении фармацевтических соединений (дифенгидрамина, хинина, кодеина, пропранолола, хлорпрокаина) улучшается при высоких температурах [161]. Отмечено также, что при высоких температурах увеличивается интенсивность сигналов веществ в масс-спектрах.

Hypercarb (5 мкм) использовали и для разделения липидов в условиях высокотемпературной ВЭЖХ [162]. Увеличение коэффициентов диффузии и снижение вязкости в этих условиях позволили сократить продолжительность анализа за счет увеличения скорости подачи подвижной фазы.

Среди методов ВТ-ВЭЖХ особое место занимает хроматография с использованием субкритической воды. Интерес к чистой воде в качестве подвижной фазы, помимо очевидного сокращения затрат, связан с ее экологической безопасностью, а также возможностью использования ее с универсальными детекторами, например пламенно-ионизационным [163]. “Перегретая” вода менее полярна, чем обычная, что увеличивает ее элюирующую силу в обращенно-фазовом варианте разделения веществ. Число работ, посвященных использованию ПГУ в сочетании с субкритическим водным элюентом, в последнее время увеличивается. Так, например, с помощью субкритической воды на сорбенте Hypercarb (5 мкм) разделяли триазиновые гербициды [82], компоненты фармацевтических препаратов (сорбент Hypercarb 7 мкм) [164].

Изомеры ароматических веществ разделяли на сорбенте Hypercarb (5 мкм) водным субкритическим элюентом [165]. Исследовали влияние модификаторов подвижной фазы (метанола, ацетонитрила, ТГФ, этанола, пропиловых спиртов, гексана), при этом наблюдали два типа поведения аналитов. Первый связан со стерическим распознаванием, второй – с обычным для ПГУ взаимодействием между полярными группами аналитов и неподвижной фазой. Разработанный способ применен для разделения и определения бензола, толуола, этилбензола, ксилолов и других ароматических веществ.

Недостатком методов ВТ-ВЭЖХ является то, что стабильность аналитов в достаточно агрессивных условиях (высокая температура, гидролитическое действие воды, возможность окисления растворенным кислородом) должна оцениваться не только до анализа [166], но и в процессе анализа, поскольку стационарные фазы могут действовать как катализаторы деградации [110]. К сожалению, стационарные фазы на основе углерода могут проявлять каталитические свойства в таких процессах.

Использование пористого графитированного углерода со сверхкритическими жидкостями и подвижными фазами повышенной текучести. Как и другие сорбенты, ПГУ применяли в сверхкритической флюидной хроматографии.

Исследовано разделение толуола, фенола, п/o-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, нитротолуола, бензилового спирта, метилбензоата, диметилфталата, бифенила, дигептилового эфира, циклогексанона и некоторых других веществ в среде диоксида углерода без добавок на ПГУ (получен в университете Эдинбурга) в сверхкритических условиях. Наблюдали симметричные пики, однако отмечены и чрезмерно большие времена удерживания полярных аналитов [167].

Показано, что добавление модификатора (лимонной кислоты в ацетонитриле или метаноле) к диоксиду углерода снижает удерживание полярных аналитов (фенола, о/п-крезола, о-нитротолуола, 3,5-ксилола в метилене и фенилсульфоксида, фенилдисульфида, фенилсульфида, бензотиафена и др. в ацетоне) и улучшает форму хроматографических пиков при использовании сорбента Hypercarb [168, 169]. Сделано предположение, что молекулы большого объема с высокой поляризуемостью и плоской структурой удерживаются на ПГУ по тем же механизмам, что и в ВЭЖХ. В дальнейших исследованиях авторы расширили круг модификаторов (за счет уксусной кислоты, ацетона, хлороформа, 1,4-диоксана и др.), добавляемых в малых концентрациях (1 мас. %) в сверхкритический диоксид углерода [170]. Снижение удерживания аналитов объяснили конкуренцией с модификатором при адсорбции, так как взаимодействия между компонентами подвижной фазы в сверхкритической флюидной хроматографии считаются пренебрежимо малыми. По мнению авторов, использование модификаторов слабоосновного характера с большими молекулярным объемом и дипольным моментом увеличивает элюирующую силу диоксида углерода.

Полярный характер растворенного вещества, особенно кислотный, и наличие π-электронов, неподеленных пар электронов способствуют существенному увеличению удерживания полярных аналитов (бензилового спирта, изофталевой кислоты, анизола, бензальдегида, ацетофенона, нитробензола, хлорбензола, бромбензола, фенола, о-хлорфенола, о-аминофенола, изомеров диметилфенола, резорцинола, o/м/п-крезола, o/м/п-нитрофенола) на сорбенте Hypercarb (5 мкм) [171, 172]. Исследовали влияние содержания метанола в интервале от 5 до 40% на удерживание аналитов. При этом наблюдали сорбцию модификаторов на стационарной фазе и сольватацию аналитов в подвижной фазе.

Установлено, что в сверхкритической флюидной хроматографии ион-парные реагенты, так же как и в обычной ВЭЖХ, могут быть полезными при разделении соединений в ионной форме [173, 174], а изомеры можно разделить с очень хорошим разрешением [175], учитывая способность сверхкритического диоксида углерода обеспечивать высокую площадь контакта подвижной и стационарной фаз [165].

Применение пористого графитированного углерода в двумерной хроматографии. Существенные различия в удерживании веществ на ПГУ и других стационарных фазах эффективно использовали в двумерных ВЭЖХ-системах, чаще всего в сочетании с обращенно-фазовой или ионообменной хроматографией. Так, колонка с сорбентом Hypercarb (5 мкм) применена в паре с ионообменной колонкой для разделения нейротрансмиттеров [113], а также фосфоновых кислот – продуктов разложения химических отравляющих веществ. Hypercarb (5 мкм) использовали в качестве второй неподвижной фазы после колонки с ОДС, а также после катионообменной колонки для определения пищевых красителей [175]. В сочетании с октадецилсиликагелем Hypercarb (7 мкм) использовали для разделения/определения полихлорированных бифенилов [74], полифенолов [176].

Концентрирование гидрофильных веществ на пористом графитированном углероде. Требования к сорбентам для концентрирования веществ иные, чем требования к сорбентам для ВЭЖХ. Сорбенты для концентрирования могут не быть монодисперсными, размер частиц обычно составляет 30 мкм и более, что позволяет снизить противодавление, создаваемое колонкой с сорбентом, так как при концентрировании веществ в динамических условиях, как правило, применяют насосы низкого давления. Для решения таких задач предложены более дешевые, чем для ВЭЖХ, модификации ПГУ. Так, HyperSep Hypercarb – пористый графитированный углерод для “твердофазной экстракции” аналогичный неподвижной фазе Hypercarb для ВЭЖХ, характеризуется однородной упорядоченной структурой и удельной поверхностью около 120 м²/г. Как и Hypercarb, частицы поверхности состоят из графитовых листов, удерживаемых вместе слабыми Ван-дер-Ваальсовыми силами. Заявленные производителем отличия от “хроматографического” Hypercarb заключаются в размере и форме частиц. Он также характеризуется высокой сорбционной способностью по отношению к полярным аналитам, причем более высокой, чем у алкилсиликагелей и органополимерных сорбентов [177]. Во многих работах показано, что на этом сорбенте из водных растворов извлекаются как неполярные, так весьма полярные аналиты [177–179]. Наблюдали высокое сродство этого ПГУ по отношению к плоским молекулам, содержащим несколько полярных групп. При использовании колонки, заполненной 200 мг сорбента, степень извлечения аналитов из 250 мл раствора превышала 90%, кроме трех наиболее полярных, для извлечения которых из этого объема образца требовалось 500 мг сорбента [178]. Предложен сорбционно-ВЭЖХ-МС (с электрораспылением) метод определения малых количеств атразина и его шести основных продуктов разложения [179].

Приведены данные о сорбционном концентрировании некоторых пестицидов (оксанила, метомила, метамитрона, фенурона, метоксурона, симазина, метрибузина, атразина, 3,5-дихлорфенола, 2,4,5-трихлорфенола, пентахлорфенола, антрацена и др.) на сорбенте Hypercarb (7 мкм) [180]. Отмечено сильное удерживание ряда полярных аналитов даже в органических растворителях (ТГФ), что приводит к затруднениям при их десорбции. Десорбция в противотоке частично решает эту проблему.

Пестициды паракват, дикват и дифензокват концентрировали на ПГУ-сорбентах Hypersep Hypercarb и Supelclean Envi-Carb [181]. Показано, что дифензокват сорбируется лучше остальных аналитов на обоих сорбентах, причем на Envi-Carb лучше, чем на Hypercarb. Паракват и дикват лучше извлекается на Hypercarb, чем на Envi-Carb.

Колонку с Thermo Hypercarb (с размером частиц 5 мкм, 100 × 4.6 мм) применяли для концентрирования и разделения органических и неорганических соединений селена (селенита, селената, селенометионина, селеноцистина и селеноэтионина). Аналиты извлекали на колонке с указанным сорбентом, затем разделяли на стадии десорбции и детектировали селен методом МС с индуктивно связанной плазмой (ИСП) [182]. При десорбции раствором муравьиной кислоты наблюдали уширение пиков. Для решения этой проблемы в анализируемый раствор вводили трифторуксусную или гептафтормасляную кислоту; при этом увеличивался объем до проскока на стадии сорбции. Аналогичный прием применяли при концентрировании и разделении селеноцистамина, селеноэтионина, селенометионина и селеноцистина: в анализируемый раствор вводили трифторуксусную или азотную кислоту [183]. Селен определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с ИСП.

Полярные фенольные соединения (фенол, ди- и тригидроксибензол, аминофенол и др.) также концентрировали на сорбенте Hypercarb (с размером частиц 7 мкм, 100 × 4.6 мм) из водных образцов [184]. Для выбора условий концентрирования сравнивали удерживание аналитов на ПГУ и на полимерном сорбенте PRP-1. Показано, что при хроматографическом разделении коэффициенты емкости аналитов в зависимости от состава подвижной фазы изменяются на этих сорбентах аналогичным образом, но сами соединения элюируются в обратном порядке. При изучении удерживания в воде коэффициент емкости самого полярного аналита (1,3,5-тригидроксибензола) при использовании Hypercarb составил порядка 1 × 10³, однако этот аналит вообще не удерживался на октадецилсиликагеле и плохо удерживался на PRP-1 (k' = 3 в воде). Hypercarb также применяли для концентрирования пирокатехина, резорцина и флороглуцинола [184].

Проточное сорбционно-ВЭЖХ-определение веществ с использованием пористого графитированного углерода. Как правило, при использовании ПГУ для разделения аналитов методом ВЭЖХ целесообразно применять углеродный сорбент на стадии концентрирования. Этот сорбент может представлять собой как ПГУ, так и графитированную сажу. Например, гербициды дикват, паракват и дифензокват селективно определяли проточным сорбционно-ВЭЖХ-методом [185] в водных объектах с использованием графитированной сажи Carbograph для концентрирования и ПГУ для последующего разделения. Для концентрирования применяли колонки c графитированной сажей Carbograph и с ПГУ [186], а для разделения аналитов использовали Hypercarb [187]. Продемонстрировано использование ПГУ для извлечения олигосахаридов (или их производных) из растворов, содержащих один или несколько следующих загрязнителей: анионы (включая гидроксид, ацетат, фосфат), моносахариды, детергенты (додецилсульфат натрия и Triton X-100), белок (включая ферменты) и реагенты для высвобождения олигосахаридов из гликоконъюгатов (такие как гидразин и борогидрид натрия) [186]. В дальнейших исследованиях показано, что десорбция в противотоке улучшает удерживание аналитов [187].

Предложена проточная двухколоночная система для определения продуктов трансформации антрацена в грунтовых водах; обе колонки (для концентрирования и разделения) были наполнены сорбентом Hypercarb [184] (рис. 9). Установлено, что диизопропилатразан элюируется после диэтилатразина, и время удерживания велико (может составлять 40 мин), что позволяет отделить диизопропилатразан от сопутствующих компонентов. Объем до проскока также большой, что обеспечивает высокий коэффициент концентрирования и низкие пределы обнаружения (на уровне 100 нг/мл) [184].

Рис. 9.

Определение диэтилатразина (DEA) и диизопропилатразана (DIA) в грунтовых водах [185]. Аналиты концентрировали из 100 мл образца без добавки (а), с добавкой 0.5 мкг/л DEA и DIA (б). Колонка для концентрирования: Hypercarb (Shandon, 10 × 4.6 мм); хроматографическая колонка: Hypercarb (Shandon, 100 × 4.6 мм); скорость потока 1 мл/мин; УФ-детектирование при 220 нм. Подвижная фаза: А – 0.005 М фосфатный буферный раствор с pH 7, Б – ацетонитрил; градиент фазы Б от 15 до 35% за 40 мин.

Гибридная проточная система предложена также для определения полярных пестицидов — диизопропилатразана, диэтилатразина и их метаболитов [18] с использованием колонки с Hypercarb (с размером частиц 5 мкм, 100 × 4.6 мм). Авторы разработали on-line процедуру концентрирования и ВЭЖХ-определения с использованием колонки для концентрирования и хроматографической колонки, заполненных ПГУ, специально для определения гидрофильных полярных пестицидов. Разработанный способ применен для анализа грунтовых вод, продемонстрирована возможность обнаружения следовых количеств пестицидов.

Хлортиазины (атразин, симазин, пропазин, аметрин и тербутрин) разделяли на сорбенте Hypercarb (с размером частиц 5 мкм, 100 × 2.1 мм), в том числе при повышенных температурах [82]. Несмотря на то, что хлортиазины в условиях субкритической воды частично разлагаются, проточное сорбционно-ВЭЖХ-определение характеризуется экспрессностью и высокой чувствительностью. Весь концентрат направляли в хроматографическую колонку.

Разработаны способы определения фенола, 4-нитрофенола, 2-хлорфенола, 2,4-динитрофенола, 2-нитрофенола, 2,4-диметилфенола, 4-хлор-3-метилфенола, 2,4-дихлорфенола, 2-метил-4,6-динитрофенола, а также фталевой кислоты, монометилфталата, моноэтилфталата и монобутилфталата в потоке, включающие сорбцию аналитов на колонке Hypersep Hypercarb, их десорбцию субкритической водой, вырезание зоны концентрата в дозирующую петлю, фокусирование и ВЭЖХ-разделение/определение [188–190]. Показана возможность определения аналитов в морской воде.

Этил-, изопропил- и пинаколилметилфосфоновые кислоты определяли в водопроводной воде с помощью времяпролетного масс-спектрометра после концентрирования и ВЭЖХ-разделения в on-line режиме [191]. Аналиты концентрировали из растворов на колонке для концентрирования (Hypercarb c размером частиц 5 мкм, 2.1 × 10 мм), а разделяли на колонке HILIC (ZIC-HILIC, 1 ×150 мм, 3.5 мкм). В выбранных условиях этилметилфосфоновая кислота количественно не извлекалась (степень извлечения составила 80–91%), но это не мешало достигать низких пределов обнаружения (4–7 нг/мл). Установлено, что для надежного определения аналитов необходимо предварительно удалять из образца основные неорганические анионы.

Для определения полярных хлорзамещенных анилинов, циануровой кислоты и аминофенола в природных водах применяли двухколоночную систему, обе колонки были наполнены сорбентом Hypercarb. Использовали хроматографическую колонку с размером частиц 5 мкм, 100 × 4.6 мм. При on-line процедуре колонку для концентрирования наполняли сорбентом Hypercarb PGC с размером частиц 10–15 мкм, а при off-line процедуре – тем же сорбентом с размером частиц 40–60 мкм [192]. В связи с сильным удерживанием аналитов на первой колонке и вызванной этим необходимостью использовать для десорбции сильные элюенты, отмечена невозможность последующего эффективного разделения этими элюентами веществ на колонке для разделения с ОДС. В связи с этим для разделения веществ также выбрана колонка с ПГУ. Предложенная система рекомендована для мониторинга природных вод.

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ПГУ

Использование в микросистемах. Общей тенденцией в развитии многих методов химического анализа и способов пробоподготовки является их миниатюризация. Одно из направлений – разработка микрофлюидных систем, в том числе хроматографических микрочипов, необходимых для анализа малых объемов уникальных образцов, таких какиологические жидкости.

Фирмы Agilent (США) и SGE (Австралия) разработали ВЭЖХ-микрочипы, включающие разделительную колонку с сорбентом Hypercarb, предназначенные для определения олигосахаридов и пептидов, продемонстрировано их успешное применение для анализа образцов гликопротеина, молока человека или ткани яичников [8]. Отмечено, что такие микросистемы иногда позволяют обнаружить вещества, не детектируемые с использованием обычных колонок для ВЭЖХ за счет сужения пиков аналитов. Следует отметить, что воспроизводимость характеристик систем разделения при переходе от чипа к чипу недостаточна [8]. Вероятно, это связано с трудностью достижения равномерной упаковки сорбента в небольших каналах микрочипов (иногда менее 100 мкм). Возможным способом решения этой проблемы является синтез стационарной фазы in situ – непосредственно в канале микрочипа [193].

Препаративные системы. В качестве неподвижной фазы для препаративной хроматографии ПГУ используют редко. Это объясняется высокой стоимостью углеродного материала. Однако ПГУ может обеспечить выделение веществ с высокой стоимостью и, возможно, с высокими коэффициентами разделения, которые недостижимы на других стационарных фазах [194]. Разработка более простых и дешевых способов получения ПГУ может обеспечить возможность создания новых препаративных приемов.

Уменьшение размера частиц. В настоящее время наименьший размер частиц коммерчески доступных образцов ПГУ составляет 3 мкм. Разработка технологий получения 2-микронных и более мелких частиц даст возможность применения ПГУ в быстро развивающемся направлении ВЭЖХ – ультраВЭЖХ. Этот углеродный сорбент обладает высокой механической прочностью и может быть использован для разделения полярных веществ при высоких давлениях [125].

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-03-00289).