Агрохимия, 2022, № 8, стр. 78-86

ВВЕДЕНИЕ

Кобальт относится к числу физиологически необходимых элементов для живых организмов. Микроэлемент активно влияет на физиологические процессы в растениях, особенно на азотный обмен. Важен он для жизни клубеньковых бактерий и фиксации ими молекулярного азота [1, 2]. При этом кобальт, как и другие тяжелые металлы (ТМ), в избыточном количестве вызывает ответные негативные реакции в растениях [3].

Ингибирующее действие ТМ связано с их влиянием на метаболистические процессы в растениях. При поступлении ионов ТМ в клетки растений начинают функционировать механизмы их детоксикации, включающие в себя связывание ионов различными хелаторами (органическими кислотами, аминокислотами, глутатионом и фитохелатинами, металлотионеинами). Активация защитных ферментов, синтез металлсвязывающих соединений и стрессовых белков приводят к нарушениям в метаболизме азота, увеличивая и снижая его содержание в органах растений в зависимости от концентрации токсичного элемента и фазы ответной реакции [2, 4–6].

Изменения в содержании свободных аминокислот под воздействием ТМ свидетельствуют об участии их в синтезе стрессовых белков и отображают адаптивные реакции растительного организма. В качестве ответной реакции на стресс, в том числе и обусловленный ТМ, в растениях активно синтезируется пролин, являющийся полифункциональным стресс-протекторным соединением, направленным на поддержание метаболизма растительного организма на разных стадиях адаптационного процесса [5, 7, 8]. Специфической реакцией на воздействие ТМ является синтез металлсвязывающих соединений, обогащенных тиоловыми (-SH) группами – металлотионеинов и фитохелатинов, образованных с участием цистина [9].

Представленные изменения в содержании свободных аминокислот характерны для конкретного (тестируемого) периода развития растения. Определение аминокислотного состава белков кормовых трав в период уборки позволяет оценить результаты сложных метаболических процессов, выявить суммарный эффект воздействия элемента на синтез аминокислот с учетом изменений в развитии растений. Исследования по влиянию ТМ на аминокислотный состав растений, кормовую ценность продукции крайне незначительны. Показано увеличение содержания суммы аминокислот главным образом за счет пролина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, снижение количества незаменимых аминокислот в зерне ячменя при избытке кадмия [4]. Загрязнение кадмием подзолистых почв приводило к росту содержания азота и аминокислот в составе белков биомассы кормовых культур, увеличению доли глутаминовой кислоты в белках гороха, аспарагиновой кислоты – в белках овса, снижению доли пролина в обоих видах растений [10].

Ранее нами были приведены исследования по влиянию кобальта на продуктивность кормовых трав на подзолистых почвах [11]. В низких концентрациях кобальт оказал стимулирующее действие на рост и развитие кормовых трав, при превышении оптимума происходило ингибирование и гибель растений.

Цель работы – изучение действия возрастающего содержания кобальта в почве на содержание азота и аминокислотный состав наземной массы однолетних трав.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование провели в микрополевом опыте в пригороде г. Сыктывкара на легкосуглинистой пахотной подзолистой почве в условиях искусственного загрязнения [11]. Разные по содержанию кобальта почвы были получены в результате смешивания ранее загрязненной почвы с почвой контроля. Почву весом 10 кг помещали в полиэтиленовые сосуды без дна (диаметр – 20, высота – 30 см), которые зарывали в траншеи. Эксперимент выполнен в четырехкратной повторности. Варианты опыта с различным содержанием кобальта в почве представлены в табл. 1.

В каждый сосуд высевали по 15 семян гороха (Pisum sativum) сорта Альбумен и овса (Avena sativa) сорта Льговский-82, оставляя впоследствии по 10 растений каждого вида. Отбор растительных проб (надземной биомассы) осуществляли в фазе образования бобов гороха и фазе колошения овса при учете продуктивности. Поскольку кобальт оказывал влияние на прохождение фенологических фаз и развитие репродуктивных органов, сроки уборки и отбора проб устанавливали по развитию растений в контроле.

Азот определяли методом газовой хроматографии на элементном анализаторе EA 1110 (CHNS-0). Относительная погрешность анализа при содержании азота 0.5–2.6% составляла 18.0%, при содержании 2.6–20% – 6.7%. Содержание аминокислот, входящих в состав белков растений, определяли методом жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе ААА Т 339 М. Относительная погрешность анализа конкретных аминокислот (при Р = 0.95) приведена в табл. 2. Гидролиз белков осуществляли в концентрированном растворе серной кислоты в запаянной ампуле при t = 110°С. Анализы выполняли в аккредитованной экоаналитической лаборатории Института биологии. Методы анализа растительных и почвенных образцов на содержание кобальта приведены в работе [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Валовое содержание кобальта в вариантах опыта изменялось с 6.2 в контроле до 65.5, подвижного (ацетатно-аммонийный буфер (ААБ)) – с 0.2 до 19.1 мг/кг. Стимулирующее действие элемента на растения гороха проявилось при содержании подвижного кобальта 5.3–10.2 мг/кг. В вариантах с бóльшим количеством Со происходило постепенное снижение эффективности действия микроэлемента. Биомасса овса в вариантах с кобальтом превышала контроль на 17–47%. Тенденция к снижению продуктивности злаковой культуры по сравнению с максимальной происходила при содержании подвижного кобальта 19.1 мг/кг (табл. 1). Необходимо отметить, что смоделированные концентрации данного физиологически значимого элемента в эксперименте были выше оптимальных: в варианте 2 количество кобальта, экстрагируемое ААБ (5.3 мг/кг), превысило ПДК, равное 5.0 мг/кг [12].

Под влиянием кобальта в растениях активизировался процесс накопления азота. Количество его в наземной массе гороха (стебли, листья, бобы) увеличилось с 1.21 до 1.41%, овса – с 1.36 до 1.62% (табл. 2) пропорционально росту содержания кобальта в почве. Превышающие относительную погрешность анализа изменения в бобовом растении начались при содержании подвижного кобальта в почве, равном 10.2, в злаковом – 9.1 мг/кг. Содержание кобальта в надземной массе при этом составило соответственно 8.3 и 1.8 мг/кг. Количество азота в горохе положительно коррелировало с содержанием подвижного кобальта в почве (r  = 0.95, Р < 0.001), в овсе связи были менее тесные (r = 0.71, Р < 0.001). Близкая зависимость обнаружена также между накоплением азота растениями и транслокацией кобальта в горох (r  = 0.93, Р < 0.001) и овес (r  = 0.61, Р < 0.01).

Анализ зависимости между формированием биомассы растений и синтезом азотсодержащих соединений показал, что для злакового растения взаимосвязи носили позитивный характер: биомассу овса и содержание в ней азота объединяла положительная корреляция средней силы (r = = 0.65, Р < 0.01), между тем как в бобовом растении зависимость была отрицательной (r = –0.77, Р < 0.001). Интенсивный синтез азотистых соединений в горохе продолжался на фоне снижения продуктивности культуры.

Изменения в азотном цикле и продуктивности растений под влиянием кобальта сказались на количестве сырого протеина. Наибольшее его количество в бобовом растении отмечено при содержании подвижного кобальта в почве 5.3–10.2, в злаковом растении – 9.1–15.1 мг/кг, при большем количестве элемента выход протеина снизился, оставаясь при этом больше контроля.

Нарушение стабильности белкового обмена, вызванное избыточным содержанием кобальта в почве, было ответной реакцией растений на стресс и результатом адаптации к сложившейся экологической ситуации. Изменения обусловлены нарушением процессов поглощения и транспорта азота, включением его в соединения, обеспечивающие защитные реакции растительного организма [5]. Тяжелые металлы могут приводить к увеличению содержания азота и белка в растениях. Показано снижение активности нитратредуктазы в присутствии ТМ и ингибирование процессов восстановления нитратов и накопления нитратного азота в органах растений [4, 6]. Наряду с ростом количества азота отмечали и снижение содержания азота в растениях, ингибирование азотного обмена под влиянием высоких концентраций ТМ [5].

С увеличением количества азота в надземной биомассе растений изменилось содержание практически всех аминокислот. Суммарное их количество в горохе повысилось с 4.35 до 6.03, в овсе – с 5.28 до 5.86 г/100 г. Сумма аминокислот положительно коррелировала с содержанием азота в горохе (r = 0.96, Р < 0.001) и овсе (r = 0.71, Р < 0.001), а также с количеством кобальта как в бобовой (r = = 0.91, Р < 0.001) так и злаковой (r = 0.81, Р < 0.001) культуре. При этом связи между величиной биомассы и суммой аминокислот носили иной характер: положительный (r = 0.72, Р < 0.001) для злакового растения и отрицательный – для бобового (r = –0.90, Р < 0.001). Интенсивный синтез аминокислот в горохе, как и азотистых соединений, в целом продолжался при негативных изменениях продуктивной массы растений, обусловленных возрастающим содержанием кобальта в почве.

Увеличение суммарного содержания аминокислот в зерне ячменя под действием ТМ наблюдали и при возделывании на дерново-подзолистой почве. Наиболее существенные изменения при этом были характерны для пролина [4].

Значимые по сравнению с контролем изменения в содержании большинства аминокислот в биомассе гороха начались при содержании подвижного кобальта в почве 15.1 мг/кг, в растениях – 16.6 мг/кг (табл. 2). Содержание глутаминовой кислоты статистически значимо повысилось, начиная с содержания подвижного элемента 9.1 мг/кг. При содержании кобальта в ААБ-вытяжке >16 мг/кг в биомассе гороха в 1.5 раза увеличилось содержание аспарагиновой кислоты, треонина, серина, изолейцина и тирозина, в 1.4 раза – пролина, лейцина и гистидина.

В злаковом растении в большей мере возросло количество аспарагиновой (в 1.4 раза) и глутаминовой (в 1.3 раза) кислот. Значимые изменения содержания аспарагиновой кислоты начались при более низком содержании кобальта в почве (5.3 мг/кг), чем для бобового растения. Доказанное повышение количества глутаминовой кислоты в биомассе овса происходило при содержании кобальта в почве >10.2 мг/кг, что достаточно близко к концентрациям, вызвавшим изменения в содержании аминокислоты в бобовом растении. Также доказано повышение количества серина и снижение – изолейцина, начиная с содержания кобальта в почве 16.1 мг/кг. Изменения в содержании остальных аминокислот в наземной массе овса находились в пределах погрешности, хотя и имели тенденцию к росту по мере повышения количества кобальта в почве. Уровень пролина, являющегося полифункциональным стресс-протекторным соединением [5, 7, 8], в злаковой культуре в отличие от бобовой в вариантах с кобальтом был меньше и составил 87–94% от его содержания в контроле, находясь при этом в пределах погрешности. В целом изменения в содержании аминокислот в биомассе овса были менее существенными, чем в бобовом растении.

С учетом роли метионина и цистина в синтезе металлсвязывающих соединений, необходимо отметить, что при содержании подвижного кобальта в почве 15.1 мг/кг и больше, в злаковом растении до 2-х раз возросло содержание метионина. Начиная с содержания кобальта в почве 10.2 мг/кг (для гороха) и соответственно 15.1 мг/кг (для овса) в биомассе растений был обнаружен цистин. Несмотря на изменения в содержании серосодержащих аминокислот достоверно утверждать о происходящих процессах не позволила примененная методика гидролиза белков, в результате которой возможны потери этих аминокислот. В этом случае можно говорить лишь о тенденции к росту их содержания.

Количественные изменения в содержании преобладающей части аминокислот были пропорциональны увеличившейся их сумме. Изменение относительного количества аминокислот (в % от их суммы) в большей мере, чем абсолютное содержание, позволяет определить участие отдельных из них в синтезе белков и других соединений, связанных с адаптацией растений к создавшимся в связи с загрязнением экологическим условиям. Относительное содержание аминокислот в кормовых культурах также дает возможность оценить аминокислотный состав белков по питательной ценности.

Биомасса гороха в контроле по сравнению с овсом характеризовалась бóльшим относительным содержанием большинства аминокислот, кроме аспарагиновой кислоты и пролина. В злаковом растении доля аспарагиновой кислоты в 1.5, пролина – в 2.0 раза превышала их количество в бобовом растении.

В бобовой культуре, исходя из относительного содержания аминокислот, преобладали глутаминовая и аспарагиновая кислоты, третье место занимал пролин (табл. 2). Доля глутаминовой кислоты в растениях во всех вариантах была достаточно постоянной и близкой к контролю. Некоторое снижение происходило при содержании кобальта в почве 19.1 мг/кг. Об отсутствии влияния возрастающего содержания кобальта на относительное количество этой аминокислоты можно судить по отрицательной корреляции как с содержанием подвижного кобальта в почве (r = = –0.71, Р < 0.001), так и с количеством его в растениях (r = –0.81, Р < 0.001). При этом бóльшим участием глутаминовой кислоты в синтезе белковых соединений характеризовались более продуктивные растения гороха, об этом свидетельствовала тесная положительная корреляция с биомассой (r = 0.91, Р < 0.001).

Относительное содержание аспарагиновой кислоты в горохе с ростом уровня загрязнения и транслокации кобальта в растения повысилось с 11.1 до 12.2%, в большей мере при превышении содержания подвижного кобальта 16.1 мг/кг. Доля ее в составе аминокислот положительно коррелировала как с количеством кобальта в почве (r = 0.75, Р < 0.001), так и в растениях (r = 0.75, Р < < 0.001). В связи с тем, что биомасса растений при значительном загрязнении Со была меньше, связи между ее величиной и долей аспарагиновой кислоты имели отрицательный характер (r = –0.79, Р < 0.001).

Рост содержания аспарагиновой кислоты в растениях гороха в ответ на действие кобальта связан с тем, что эта аминокислота является источником азота для синтеза новых аминокислот [13], входящих в состав белков и соединений, способствующих интоксикации ТМ. Аналогичное увеличение доли аспарагиновой кислоты в биомассе гороха вследствие адаптационных процессов происходило и под действием меди и цинка [14, 15].

В противодействии на разные стрессовые явления (в т.ч. и загрязнение ТМ) в клетках растений активно синтезируется свободный пролин, являющийся одним из компонентов общих (неспециализированных) клеточных защитных систем [5, 7, 8]. В связи с этим важно оценить долю пролина в белках растений. Максимальное относительное содержание пролина в биомассе гороха (9.5–10.0%) было характерно для растений, произраставших при содержании кобальта в почве от 10.2 до 15.1 мг/кг. При большем количестве кобальта доля пролина была близкой к контролю – 8.7% (табл. 2).

Одной из причин, наблюдаемого снижения относительного количества пролина в составе белков при высоком содержании кобальта в почве, могло быть ингибирование его биосинтеза вследствие избыточной транслокации элемента (16.8 мг/кг и более) в органы растений. Происходящие изменения могут быть связаны с различными фазами ответной реакции растительного организма на стресс (фазой адаптации и фазой повреждения), обусловленный ТМ [16]. Дисбаланс между синтезом и деструкцией пролина в результате ответных реакций на загрязнение почвы, на наш взгляд, и обусловил изменения в содержании аминокислоты в бобовом растении при переходе от фазы адаптации в фазу повреждения при высоких концентрациях кобальта в почве.

При содержании кобальта в почве, начиная с 10.2 мг/кг, в горохе активизировался синтез цистина. Доля его в составе белковых соединений положительно коррелировала с наличием кобальта в почве (r = 0.87, Р < 0.001) и в растениях (r = 0.88, Р < 0.001). Относительное количество пролина увеличилось до 0.05%, в то время как в контроле он не был установлен.

Тенденция к возрастанию синтеза цистина обусловлена тем, что ТМ в растениях могут связываться с соединениями, содержащими тиоловые группы, в т.ч. и с замещенным цистеином [17]. Цистеин же в свою очередь образуется в результате восстановления цистина. Синтез металлсвязывающих соединений с тиоловыми (-SH) группами в ответ на избыток ТМ является одним из наиболее специфических механизмов поддержания гомеостаза в растительной клетке [9].

С ростом содержания кобальта в горохе повысилась доля треонина, серина и изолейцина, связи между количеством этих аминокислот и содержанием элемента в почве и растениях имели положительный характер. Наряду с этим, начиная с содержания 5.3 мг Со/кг, уменьшилась доля валина, а при более высоком количестве кобальта в почве – лизина и аргенина, показатели объединяла отрицательная корреляция.

В злаковом растении в ответ на загрязнение наблюдали рост и абсолютного, и относительного содержания аспарагиновой кислоты (табл. 2). Доля ее в составе белковых соединений в биомассе овса увеличилась с 16.1 до 20.3–20.7%, положительно коррелируя с содержанием кобальта в почве (r = 0.89, Р < 0.001) и в растениях (r = 0.82, Р < 0.001). В составе белков продуктивных растений доля этой аминокислоты была более высокой (r = 0.76, Р < 0.001). Возрастание участия аспарагиновой кислоты в синтезе белковых соединений наблюдали также при избытке меди и цинка [14, 15].

Наряду с аспарагиновой в злаковом растении увеличилось относительное содержание глутаминовой кислоты с 11.6 до 14.0% пропорционально росту содержания кобальта в почве (r = 0.95, Р < < 0.001) и в биомассе растений (r  = 0.97, Р < 0.001). Избыток меди в почве и растениях также вызвал увеличение доли глутаминовой кислоты в биомассе овса [14]. Усиленный ее синтез мог осуществляться за счет возросшей под действием ТМ активности глутаминсинтетазы [18].

Повышенный синтез глутаминовой кислоты в растениях овса, так же, как и аспарагиновой кислоты в обоих растениях был обусловлен их ролью в реакциях переаминирования [13]. Выступая в качестве источника азота, эти аминокислоты поддерживают синтез аминокислот, в том числе и тех, которые входят в состав белков и соединений, способствующих снижению токсичности ТМ. В частности, биосинтез пролина, одной из наиболее важных аминокислот для адаптации растений, осуществляется из глутамина, им же завершается и его деструкция [7, 19].

Относительное содержание пролина в белках овса при содержании кобальта в почве 9.1 мг/кг и больше снизилась с 17.8 до 14.4%, негативно коррелируя с наличием элемента в почве (r = –0.83, Р < 0.001), в растениях (r = –0.74, Р < 0.001) и с величиной биомассы (r = –0.86, Р < 0.001). Уменьшение доли пролина с возрастанием стрессовой нагрузки возможно связано с тем, что содержание кобальта в почве и растениях превысило показатели, обеспечивавшие биосинтез пролина в параметрах, характерных для фазы адаптации.

Как и в бобовом растении в злаковом увеличилась доля цистеина и метионина. При содержании кобальта в почве 15.1–16.9 мг/кг относительное содержание цистина составило 0.03–0.04%. Доля метионина имела тенденцию к увеличению с 0.15 в контроле до 0.3–0.4% при превышении количества кобальта в почве 15.1 мг/кг. Тенденцию к увеличению содержания серосодержащих аминокислот наблюдали и при загрязнении другими ТМ [10, 14, 15]. Доля остальных аминокислот с повышением загрязнения кобальтом была меньше, их синтез и включение в состав белков в основном было подавлено.

Отсутствие существенных изменений в относительном содержании преобладающей части аминокислот (табл. 2) обусловлены генетической стабильностью аминокислотного состава белков. Непропорциональные изменения в содержании отдельных из них, которые наблюдали, свидетельствовали о вызванных при высоком содержании кобальта в почве и биомассе нарушениях в белковом обмене. Дестабилизация аминокислотного состава связана с экспрессией генов в ответ на стресс, в результате которой в растениях активизируется синтез стрессовых белков и металлсвязывающих соединений [2, 5].

Кроме нестабильности синтеза аминокислот и белков вследствие защитно-приспособительных реакций в ответ на загрязнение кобальтом на аминокислотный состав растений повлияли изменения в фенологическом развитии и морфологии растений. Например, в структуре надземной части гороха с ростом концентрации кобальта в почве снизилась доля цветов и бобов. Вследствие изменений в соотношении между вегетативными и репродуктивными органами произошли изменения во фракционном и аминокислотном составе белков продуктивной массы [20].

Одним из важных показателей качества растительной продукции является наличие в белках незаменимых аминокислот. Абсолютное их содержание в биомассе гороха увеличилось с 1.66 до 2.31 г/100 г пропорционально росту содержания кобальта в почве (r = 0.94,  Р <0.001) и растениях (r = 0.95,  Р <0.001). В биомассе овса абсолютное содержание изменялось менее существенно (1.57–1.69 г/100 г). Более высокие показатели имели растения, произраставшие при содержании подвижного кобальта в почве от 9.1–15.1 мг/кг.

Относительное количество незаменимых кислот в наземной массе гороха было более стабильным – 36.2–38.3%. Корреляция между количеством аминокислот, не синтезируемых в животных организмах, и содержанием элемента в почве и растениях была менее значима (r = 0.36–0.47, Р  <0.1), чем для абсолютных величин. Доля незаменимых кислот в биомассе овса была меньше, чем в надземной массе гороха – 27.5–29.9%. Количество их в злаке незначительно снизилось с ростом содержания подвижного кобальта в почве и растениях (r = –0.82, Р  <0.001).

В аминокислотном составе культур, в изменениях, вызванных загрязнением, отразились видовые особенности растений. Надземная масса гороха отличалась более высоким относительным содержанием большинства аминокислот. Обе кормовые культуры в контроле имели достаточно близкое относительное содержание глутаминовой кислоты, на загрязненной кобальтом почве оно было существенно больше в белках злакового растения. Биомасса овса характеризовалась более высоким относительным содержанием аспарагиновой кислоты и пролина: различия по участию этих аминокислот в белках кормовых растений составили соответственно 1.5 и 2.0 раза. Возможно, что с высоким содержанием пролина в составе белков злакового растения в какой-то мере связана его бóльшая толерантность по отношению к кобальту. В результате приспособительных реакций, обусловленных избытком кобальта, доля аспарагиновой кислоты в биомассе овса увеличилась в большей мере, чем в горохе. Доля пролина при загрязнении в злаковой культуре снизилась, в бобовой – повысилась.

Анализ аминокислотного состава белков кормовых трав позволил оценить результаты сложных процессов метаболизма азота, белковых соединений, выявить суммарный эффект воздействия кобальта на синтез аминокислот с учетом изменений в развитии растений, а также оценить качество растительной продукции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, установлено, что кобальт оказал значительное влияние на метаболизм азота в кормовых культурах, приводя в результате приспособительных реакций к росту содержания азота и суммы аминокислот. Интенсивность процессов определяли уровень загрязнения металлом и специфика культур. Количественные изменения в содержании преобладающей части аминокислот были пропорциональны увеличившейся их сумме. Вместе с тем в ответ на стресс произошел рост относительного содержания аспарагиновой в обеих культурах и глутаминовой кислоты в биомассе овса, снижение доли пролина в составе белковых соединений злаковой культуры. Более высокое содержание пролина отмечено в биомассе гороха при среднем загрязнении кобальтом. Значительного изменения количества незаменимых аминокислот в пределах изученных концентраций не произошло.