Почвоведение, 2022, № 10, стр. 1290-1300

ВВЕДЕНИЕ

Изучение биологического разнообразия различных регионов нашей планеты является вопросом первостепенной важности из-за расширения антропогенного воздействия на природные биогеоценозы. Наиболее богатыми с точки зрения видового разнообразия территориями являются тропические леса Северной и Южной Америки, а также Юго-Восточной Азии. Изучение микробных сообществ почв и сопряженных субстратов необходимо для понимания специфики структуры сообществ и участия микроорганизмов в процессах почвообразования в условиях тропического климата. Разнообразие сообществ культивируемых микроскопических грибов на территории заповедников Вьетнама в течение последних лет детально изучено Александровой с соавт. [1, 9, 10]. Начато исследование разнообразия актиномицетов в почвах и растительном опаде тропических лесов Вьетнама [28]. Изучено разнообразие сообщества прокариот на уровне филумов в некоторых почвах национального парка Кат Тьен [19]. Несмотря на проведенные и проводимые в настоящее время исследования, прокариотные сообщества почв и сопряженных с ними субстратов заповедников Вьетнама продолжают оставаться “белым пятнам” биогеографии почвенной микробной экологии [27].

Комплексная оценка обилия и разнообразия отдельных таксономических групп прокариот и их метаболической активности широко распространенной и активно используемой на территории Вьетнама аллювиальной бурой почвы при помощи современных молекулярно-биологических методов на территории особо охраняемых природных территориях Вьетнама не проводилась. Такие работы имеют теоретическое (выявление специфики распределения обилия и разнообразия отдельных таксонов микроорганизмов) и практическое значение (поиск культур с важными биотехнологическими свойствами), что и определяет актуальность проводимых исследований.

Цель работы – количественная и качественная таксономическая (филогенетическая) характеристика прокариотного сообщества аллювиальной бурой почвы и сопряженных субстратов (опад, “подвешенная почва”) с использованием современных методов почвенной микробиологии.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на территории особо охраняемых природных территориях Пу Хоат. Объектами исследования служили аллювиальная бурая почва, опад на поверхности почвы, а также “подвешенная почва” в корзинках эпифитов. Материал собрали в рамках работ темы Тропического центра Эколан Э-1.2 “Сохранение, восстановление и устойчивое использование тропических лесных экосистем на основе изучения их структурно-функциональной организации”.

Аллювиальная бурая почва (Dystric Fluvisol (WRB) [35]) имела мощность гумусового горизонта 10–12 см. Далее залегал среднеобогащенный органическим веществом сильноопесчаненный аллювий [18]. Содержание С_орг в гумусовом горизонте 1.7%, N_орг – 0.34%. Реакция среды сильнокислая (рН_KCl 4.0–4.6).

Растительный опад представляет собой частично фрагментированный на разных стадиях разложения растительности лиственный материал деревьев Terminalia sp. (Терминалия, сем. Комбретовые), Aglaia odorata var. Gigantean (Аглая душистая, сем. Мелиевые), мощность над поверхностью почвы составляла 3–5 см.

Характерной особенностью фитоценозов тропических лесов Вьетнама является рост растений-эпифитов на стволах древесной растительности. В настоящей работе рассматривались эпифиты, относящиеся к сем. Dryopteridaceae (Щитовниковые). Эпифитные папоротники “корзиночного” типа имеют свойство накапливать значительные (до 40 кг) массы органического и органо-минерального субстрата [3]. Субстрат образуется за счет мортмассы корней эпифита, а также органических и неорганических поступлений из окружающей среды [16]. Он получил название “подвешенной” или “воздушной” почвы.

Образцы почв и сопряженных субстратов отобрали в апреле–мае 2019 г., хранили в воздушно-сухом состоянии при комнатной температуре (20–22°С). Экспериментальные исследования проводили летом и осенью 2019 г.

Общую численность бактерий и длину актиномицетного мицелия определяли с помощью прямого люминесцентно-микроскопического метода с применением красителя акридина оранжевого [11]. Учет численности прокариотных клеток проводили с использованием люминесцентного микроскопа ZEISS Axioscope 2+. Численность бактерий и длину актиномицетного мицелия рассчитывали по общепринятым формулам [11].

Таксономическую структуру прокариотного сообщества определяли методом высокопроизводительного секвенирвания (Next Generation Sequencing: NGS) с использованием платформы Illumina MiSeq методом парно-концевого чтения (2 × 300 пар оснований) генерацией не менее 10 000 парных прочтений на образец по последовательностям гена гипервариабельного региона V3–V4 16S рРНК. Подготовку образцов осуществляли по двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР) – амплификация V3–V4 16S рРНК, а затем амплификация ПЦР продукта с целью баркодирования библиотеки. Получаемые ампликоны после очистки на магнитных частицах и измерения концентрации флуориметрическим методом являлись готовыми ДНК-библиотеками.

Данные секвенирования обрабатывали с использованием автоматизированного алгоритма QIIME [22], включающего объединение прямых и обратных прочтений, удаление технических последовательностей, фильтрации последовательностей с низкими показателями достоверности прочтения отдельных нуклеотидов (качество менее Q20), фильтрации химерных последовательностей. Для разбиения последовательностей на операционные таксономические единицы (ОТЕ) использовали алгоритм с открытым референсным порогом классификации 97%. Выравнивание прочтений на последовательность 16S рРНК и распределение последовательностей по таксономическим единицам проводили с использованием базы данных Silva версии 132 [32].

Оценку разнообразия и сходства бактериальных сообществ исследованных субстратов проводили с помощью индексов α-разнообразия, рассчитанных при объединении сиквенсов в ОТЕ с уровнем схожести нуклеотидного состава сиквенсов в 97%. Использованы следующие индексы: разнообразия Шеннона (H = Σp_i lnp_i, где p_i – доля i-го вида в сообществе) и Chao1, который является показателем видового богатства (общее количество видов в пробе) и чувствительным к редким ОТЕ. Более высокие значения индекса Chao1 указывают на большее разнообразие микробного сообщества [14, 23].

Пул метаболически активных прокариот определяли методом in situ гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олиго-нуклеотидными зондами (FISH), меченным Cy-3 красителем. Применяли зонды, специфичные для доменов Archaea и Bacteria (филумы α-, β-, γ-, δ-Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria) [12].

Количественную оценку содержания функциональных генов (nifH и alkB) прокариот осуществляли методом количественной ПЦР в реальном времени. Реакцию проводили в амплификаторе DТLite4 ДНК-Технология. Реакционную смесь готовили из препарата Super Mix Eva Green (“Bio-Rad”). Для каждого варианта эксперимента (образца) реакцию проводили в трех повторностях. Результаты измерения обрабатывали с использованием пакета программы Real time_PCR [13, 26].

Для определения наличия гена, отвечающего за способность обеспечения системы азотом (nifH), использовали следующие праймеры и условия: Forward5'-GGTTGTGACCCGAAAGCTGA-3'; Reverse 5'-GCGTACATGGCCATCATCTC-3'. Амплификация: 94°C – 1 мин (94°C 30 с, 50°C 1 мин, 72°C 30 с) (40 циклов), 72°C 10 мин [12].

Для детекции микроорганизмов по направлению бактерии–археи амплификацию фрагментов гена 16S рРНК осуществляли с помощью вырожденных праймеров, комплементарных последовательностям как бактерий, так и архей: PRK341F (CCTACGGGRBGCASCAG) и PRK806R (GGACTACYVGGGTATCTAAT) [13]. Амплификация: 95°C – 3 мин (95°C 10 с, 50°C 10 с, 72°C 20 с) (40 циклов), 90°C 15 с (100 циклов).

Для количественного анализа числа копий ДНК представителей бактерий, содержащих функциональный ген alkB, отвечающих за разрушение н-алканов, применяли следующие праймерные системы и программы амплификации: Forward5'-TGGCCGGCTACTCCGATGATCGGAATCTGG-3'; Reverse 5'-CGCGTGGTGATCCGAGTGCCGCTGAAGGTG-3'. Амплификация: 94°C – 5 мин (94°C 1 мин, 60°C 1 мин, 72°C 1 мин) (30 циклов), 72°C 3 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение численности бактерий и длины актиномицетного мицелия. Общая численность бактерий, определенная с помощью прямого люминесцентного метода, в исследованных образцах почвы и других субстратов варьировала от 1.1 до 2.6 млрд. кл./г почвы. Она была наибольшей в “подвешенной почве” (2.6 млрд кл./г почвы), меньше – в опаде и горизонте А аллювиальной бурой почвы (2.24 и 2.03 млрд кл./г почвы соответственно), наименьшей – в горизонте АВ (рис. 1). Длина актиномицетного мицелия варьировала от 406 до 800 м/г почвы и была наибольшей в лиственном опаде (800 м), меньше – в “подвешенной почве” и горизонтах АВ и А, 580, 406 и 178 м/г почвы соответственно (рис. 2).

Рис. 1.

Общая численность бактерий в разных горизонтах аллювиальной бурой почвы и сопряженных субстратах.

Рис. 2.

Длина актиномицетного мицелия в разных горизонтах аллювиальной бурой почвы и сопряженных субстратах.

Следует отметить, что в целом показатели общей численности бактерий в исследованных образцах почвы и сопряженных субстратов были близки к регистрируемым в почвах умеренных широт [5, 17]. Длина актиномицетного мицелия в исследованных субстратах оказалась больше таковой для почв умеренных широт и близка для почв аридных территорий [8].

Таксономическая структура прокариотного сообщества (баркодинг гена 16S рРНК). Характеристика филогенетического разнообразия бактериального сообщества горизонта А аллювиальной бурой почвы, “подвешенной почвы” из корзинки эпифита сем. Dryopteridaceae (сем. Щитовниковые) и опада получена методом высокопроизводительного секвенирования (баркодинг гена 16S рРНК).

В исследованных образцах почвы и сопряженных субстратов выявлено около 30 филумов прокариот (табл. 1). При этом содержание филумов Proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Acidobacteria и Actinobacteria превышало 20%. Содержание филумов Verrucomicrobia и Bacteroidetes было значительно меньше (1–10%). Относительно низкое содержание (<1%) было характерно для бактериальных филумов: Nitrospirae, Cyanobacteria, Elusimicrobia, Planctomycetes, Chlorobi, Fibrobacteres, Spirochaetae, Armatimonadetes, Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Chlamydiae и филумов-кандидатов Ignavibacteriae, Parcubacteria, Saccharibacteria, Latescibacteria, Tectobacteria, Aminicenantes, FCPU 426, TM6, PBG-1, GAL15. Представители домена Archaea выявлены в незначительном количестве (не более 1%) и отнесены к филумам Тhaumarchaeota, Euryarchaeota и Woesearchaeota (рис. 3).

Рис. 3.

Соотношение филумов Euryarchaeota, Thaumarchaeota, Woesearchaeota по данным метабаркодинга в “подвешенной почве” (а) и горизонте А аллювиальной бурой почвы, 0–5 см (b).

Обращает на себя внимание факт, что относительное содержание отдельных филумов и их число в почве, опаде и “подвешенной почве” значительно различалось (табл. 1). В почве горизонта А преобладали таксоны филумов Proteobacteria (38%), Chloroflexi (18%), Firmicutes, Acidobacteria и Actinobacteria. В опаде доминировал филум Proteobacteria (70%), значительно меньше содержание филумов Acidobacteria (7%) и Actinobacteria (7%), в “подвешенной почве” – филум Proteobacteria (49%), Acidobacteria (19%) и Actinobacteria (11%). Следует отметить, что наиболее широко представлены во всех субстратах филумы Proteobacteria, Actinobacteria и Acidobacteria, что коррелирует с данными, полученными ранее [15, 19].

Филум Proteobacteria являлся доминирующим во всех исследованных субстратах. Значительное содержание филума Acidobacteria, вероятно, связано с кислой реакцией почвенной среды (pH 4.2–4.9). Высокая доля филума Actinobacteria соотносилась с высоким содержанием мицелия актиномицетов.

Филум Chloroflexi вносил существенный вклад в бактериальное сообщество горизонта А (18%) и “подвешенной почвы” (4%), тогда как филум Bacteroidetes был наиболее представлен в образцах опада и “подвешенной почвы”. Филум Firmicutes доминировал только в образце органо-минерального горизонта А почвы (0–5 см). Во всех образцах выявлен недавно описанный и малоизученный филум Gemmatimonadetes, наибольшее содержание которого характерно для “подвешенной почвы”. Представители этого филума выделяли из почв прерий, лугов, а также эвтрофных озерных отложений и альпийских горных почв [25]. Разнообразие сред, в которых были обнаружены представители данного филума, предполагает адаптацию бактерий к условиям низкой увлажненности [25], которая характерна для сухих периодов года в тропиках.

Представители домена Archaea обнаружены в горизонте А (0.8%) и “подвешенной почве” (0.2%). Интересно, что в растительном опаде этот до детектирован. Обнаруженные в горизонте А археи относились к филумам Тhaumarchaeota, Euryarchaeota, в “подвешенной почве” к филумам Thaumarchaeota, Woesearchaeota.

Представители филума Thaumarchaeota окисляют аммиак в анаэробных условиях и являются хемолитотрофами [2, 20]. Обнаруженные в почве археи филума Euryarchaeota относятся к порядку Thermoplasmatales, характеризующегося значительной ацидофильностью, что согласуется с кислотностью почвы (рН 4.2–5.1) [33]. Филум Woesearchaeota входит в созданный в 2013 г. суперфилум DPANN. Представители этого филума ранее обнаружены в отложениях и в поверхностных водах засоленных озер, почвах и некоторых других местообитаниях [31]. На территории Вьетнама и Лаоса данный филум обнаружен в морских донных осадках и гидротермальных источниках [29].

Таксономическое разнообразие доминирующих в бактериальных сообществах исследованных субстратов филумов Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria, Firmicutes проанализировано на уровне классов, порядков (табл. 2). Разнообразие, индицируемое ОТЕ, было наибольшим для класса α-Proteobacteria. Во всех трех проанализированных субстратах доминирующими в филуме Proteobacteria являлись представители порядка Rhizobiales (20–26%). Основные доминирующие филумы верхнего горизонта почвы и “подвешенной почвы” совпадали: Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria, однако филум Firmicutes в “подвешенной почве” был представлен в значительно меньших количествах (0.8%), чем в аллювиальной бурой почве (16%), что указывает на значительные отличия бактериальных сообществ исследованных субстратов. Доминирующие таксоны бактерий в опаде включали в себя порядки Rhizobiales, Sphingomonadales и филум Acidobacteria. Высокое содержание бактерий-ацидофилов (Acidobacteria, Solibacteres) соотносится с низкой кислотностью почв (рН 4.2–5.1).

Наиболее часто в исследованных сообществах детектировались представители родов Bradyrhizobium, Variibacter (филум Proteobacteria), Acidothermus, Mycobacterium (филум Actinobacteria), Candidatus solibacter, Bryobacter (филум Acidobacteria), Bacillus (филум Firmicutes) (табл. 3).

На основании полученных данных по секвенированию гена 16S рРНК были подсчитаны экологические индексы, характеризующие α- и β-разнообразие прокариотных сообществ на уровне ОТЕ (табл. 4). Наибольшее разнообразие филумов на видовом уровне (97% ОТЕ) относилось к “подвешенной почвы” (1972 ОТЕ), ниже показатели для опада (1677 ОТЕ), наименьшие – к горизонту А почвы (743 ОТЕ). Наибольшее α-разнообразие характерно для “подвешенной почвы”, что подтверждается индексами Шеннона (6.76) и Chao1 (2075.7), тогда как эти индексы для горизонта А и опада близки. Сходство сообщества “подвешенной почвы” по метрике Брея–Кертиса было наибольшим с таковым горизонта А аллювиальной бурой почвы и составило 0.41, аналогичные результаты получены с помощью метрики weighted UniFrac (0.39). Обе рассмотренные метрики бинарны и принимают значения в диапазоне от 0 до 1, где 0 отражает полное сходство сообществ, а 1 отсутствие общих таксонов. При общем выявленном сходстве “подвешенной почвы” с аллювиальной бурой почвой, в литературных источниках также показано, что данный субстрат, улавливаемый адаптивными приспособлениями растений-эпифитов (агеотропными воздушными корнями), близок по изотопному составу азота тканей эпифитов и растений-форофитов, повышенная концентрация зоогенного азота происходит за счет поселения в этом биотопе колоний муравьев [6, 7].

Таким образом, проведенный метагеномный анализ (пиросеквенирование гена 16S рРНК) бактериального сообщества аллювиальной бурой почвы, опада и “подвешенной почвы” выявил доминирование в них филумов Proteobacteria, Actinobacteria и Acidobacteria. Причем в почве филумы Chloroflexi, Firmicutes и Verrucomicrobia обнаружены в меньшем количестве, а Nitrospirae, Planctomycetes и Gemmatimonadetes – наименьшем. Наибольшие показатели α- и β-разнообразия наблюдались в “подвешенной почве” из корзинок эпифитных папоротников. Прокариотное сообщество “подвешенной почвы” сходно с таковым верхнего (органоминерального горизонта) почвы, менее – с сообществом опада. Данный вывод подтверждается мерами сходства по метрикам Брея–Кертиса (0.41) и weighted UniFrac (0.39).

Характеристика метаболически активных представителей прокариотного комплекса почвы и сопряженных субстратов. Проведенный метагеномный анализ (секвенирование гена 16S рРНК) бактериального сообщества аллювиальной бурой почвы, опада и “подвешенной почвы” выявил доминирование в них филумов Proteobacteria, Actinobacteria и Acidobacteria. Представляло значительный интерес сравнить численность и соотношение метаболически активных представителей этих филумов в изученных субстратах (рис. 4). Обращает на себя внимание факт, что содержание метаболически активных клеток вышеперечисленных таксонов меньше в почве и больше в опаде и “подвешенной почве”. Однако соотношение таксонов в этих субстратах различалось. Доминирующей группой во всех субстратах были протеобактерии, минорной – Actinobacteria и Acidobacteria. При этом наибольшая численность филума Proteobacteria была зарегистрирована в “подвешенной почве”, меньшая – в опаде и верхнем горизонте почвы. Эта закономерность была характерна и для ацидобактерий. Для актинобактерий, напротив, максимальное содержание отмечено в верхнем горизонте почвы и меньшие значения в опаде и “подвешенной почве”. Интересно, что максимальная численность метаболически активных протеобактерий соотносилась с высоким таксономическим разнообразием этого филума в “подвешенной почве”, выявленным с помощью метабаркодинга (табл. 2). Подобные закономерности для ризосферной почвы ранее отмечены другими исследователями [21, 24, 34]. Можно предположить, что “подвешенная почва” является специфическим субстратом, который несет на себе отпечатки верхнего горизонта почвы, атмосферных выпадений пылеватых частиц, прижизненных выделений биоты и микроорганизмов, попадающих в субстрат с частицами пыли; также значительное влияние на формирование микробного сообщества оказывают корни растений, обильно пронизывающих этот субстрат.

Рис. 4.

Численность метаболически активных прокариотных организмов наиболее распространенных филумов в исследованных субстратах.

Детекция функциональных генов (nifH и alkB) в исследованных образцах. В дополнение к характеристике филогенетической структуры прокариотного сообщества проведен анализ функциональных генов, отвечающих за активность прокариотного сообщества в процессах азотфиксации (nifH) и разложения углеводородов (alkB). Рассматривали наличие и число копий генов бактерий, способных к осуществлению этих процессов. Гены бактерий азотфиксаторов (nifH) способствуют обеспечению почвы азотом, что является одним из ее важных показателей активности. Ген nifH обнаружен во всех исследованных субстратах, наибольшая численность выявлена в “подвешенной почве” (0.37 млн копий гена/г почвы), меньшая – в опаде и верхнем горизонте почвы, 0.06 и 0.04 млн копий/г почвы соответственно (рис. 5). Полученные результаты в определенной степени соотносятся с данными метагеномного анализа – в изученных образцах выявлено значительное содержание порядка Rhizobiales и Sphingomonadales, известных как активные азотфиксаторы.

Рис. 5.

Количество копий гена nifH (a) и alkB (b) в аллювиальной бурой почве и сопряженных субстратах.

Процесс окисления алканов в почве начинается с гидроксилирования алифатических углеводородов, что приводит в дальнейшем к образованию альдегида или жирной кислоты [4]. Об активном протекании этого процесса свидетельствует обнаружение гена alkB в почве [12]. Бактериальный ген, отвечающий за катаболизм алканов, обнаружен во всех исследуемых образцах. Наибольшая численность этого гена обнаружена в “подвешенной почве” (2.46 млн копий/г почвы), меньшая – в опаде (0.84 млн копий/г почвы), наименьшая в верхнем почвенном горизонте. Очевидно, что в “подвешенной почве” можно ожидать значительного присутствия штаммов, способных к деструкции алканов, к которым относятся многие представители родов Pseudomonas, Rhodococcus, Burkholderia (выявлены метабаркодингом).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые дана количественная и качественная характеристика почвенного прокариотного сообщества аллювиальной бурой почвы и сопряженных субстратов (опад и “подвешенная почва”) с использованием прямого люминесцентного метода и современных молекулярно-биологических методов почвенной микробиологии. Численность бактерий (прямой люминесцентный метод) варьировала от 1.1 до 2.6 млрд. кл./г почвы и была наибольшей в “подвешенной почве”, меньшими значениями характеризовались опад и горизонты А и АВ аллювиальной бурой почвы.

В прокариотном сообществе изученных субстратов преобладали бактерии филумов Proteobacteria, Actinobacteria и Acidobacteria, в меньшинстве – филумы Chloroflexi, Firmicutes и Verrucomicrobia, минорные – филумы Nitrospirae, Planctomycetes и Gemmatimonadetes.

Представители домена Archaea обнаружены в горизонте А и “подвешенной почве”, однако их общее содержание было значительно меньше, чем домена Bacteria, и не превышало 1%. Детектированные в горизонте А археи относились к филумам Тhaumarchaeota, Euryarchaeota, в “подвешенной почве” – к филумам Thaumarchaeota, Woesearchaeota.

На основании рассчитанных экологических показателей (α- и β-разнообразие, меры сходства по метрикам Брея–Кертиса и weighted UniFrac можно сделать вывод, что прокариотное сообщество “подвешенной почвы” ближе к сообществу горизонта А, чем к таковому опада. Метаболически активная часть прокариотного сообщества, представленная филумами Proteobacteria, Actinobacteria и Acidobacteria, достигала наибольших значений в “подвешенной почве” и была меньше в опаде и горизонте А почвы, что соотносилось с высокой численностью данных филумов и их значительным таксономическим разнообразием в этом локусе.

Функциональные гены (nifH и alkB) детектированы во всех исследованных субстратах (горизонт А, опад и “подвешенная почва”). Численность копий функциональных генов была набольшей в “подвешенной почве”, что делает этот локус перспективным для выделения штаммов с высоким биотехнологическим потенциалом, способных к фиксации атмосферного азота и разложению алканов.