1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА»
  4. T. 4, № 4, 2023

Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА», 2023, T. 4, № 4, стр. 342-346

Децеллюляризация органов и тканей как ключевой этап создания биосовместимого материала

Д. В. Товпеко 1, *, А. А. Кондратенко 1, А. П. Астахов 1, А. А. Гусаков 1, А. И. Зоря 1, Андрей И. Зоря 1, В. Е. Чернов 1, Л. И. Калюжная 1

1 НИЦ “Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова” МО РФ
Санкт-Петербург, Россия

* E-mail: tovpeko.dmitry@gmail.com

Поступила в редакцию 09.10.2023
После доработки 09.10.2023
Принята к публикации 15.11.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Острый дефицит подходящих для трансплантации органов и тканей является предпосылкой для развития тканевой инженерии, способствующей решению проблем, возникающих при алло- и ксенногенной трансплантации. Методы тканевой инженерии направлены на создание тканеинженерных конструкций для имплантации с применением биосовместимых материалов самостоятельно или в сочетании с клетками и биологически активными молекулами. Биосовместимый материал должен быть структурно и функционально близким к нативной структуре заменяемого органа или ткани, а также способствовать адгезии, пролиферации и дифференцировке клеток, используемых при рецеллюляризации. Перспективными для тканевой инженерии считаются биоматериалы на основе естественного внеклеточного матрикса. Одним из наиболее широко используемых и эффективных методов создания неиммуногенной и безопасной конструкции на основе внеклеточного матрикса является технология децеллюляризации, заключающаяся в удалении клеточных компонентов из соответствующих органов и тканей. Децеллюляризацию осуществляют физическими, химическими и ферментативными (биологическими) методами. При использовании любого метода децеллюляризации происходят изменения в составе внеклеточного матрикса, а также в той или иной степени нарушение его структуры, что необходимо учитывать при разработке оптимального протокола децеллюляризации.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

1. Основные методы децеллюляризации

1.1. Физические методы обработки

1.2. Химические методы обработки

1.3. Ферментативные методы обработки

2. Оценка полноты децеллюляризации

Заключение

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время во всем мире существует проблема нехватки донорских органов и тканей для трансплантации [1, 2]. За 2022 г. в России выполнено 2555 пересадок органов, из них более 250 детям [3], в то время как в листах ожидания трансплантации органов в медицинских организациях России за этот же год состояло до 10 000 реципиентов [3]. Помимо тех, кто находится в листах ожидания, многие пациенты страдают от терминальной стадии заболевания органов, но не считаются кандидатами на трансплантацию по ряду причин в соответствии с текущими протоколами распределения. Кроме того, учитывая сложности, связанные с организацией донорства органов и их трансплантации, во многих медицинских организациях нашей страны подобные операции не проводят. Что касается пересадки тканей, к сожалению, в России нет соответствующего учета. Но согласно Международному регистру донорства органов и трансплантации (IRODaT), например, в Канаде выполнено более 12 000 трансплантаций тканей за 2022 г., включая трансплантацию роговицы, кожи, сердечных клапанов и скелетной мышечной ткани.

Острый дефицит подходящих для трансплантации органов и тканей является предпосылкой для развития тканевой инженерии, способствующей решению проблем, возникающих при алло- и ксенногенной трансплантации. Методы тканевой инженерии направлены на создание тканеинженерных конструкций для имплантации с применением биосовместимых материалов самостоятельно или в сочетании с клетками (клеточными линиями) и биологически активными молекулами [1, 2, 4].

Биосовместимый материал должен быть структурно и функционально близким к нативной структуре заменяемого органа или ткани, а также способствовать адгезии, пролиферации и дифференцировке клеток, используемых при рецеллюляризации [1]. Перспективными для тканевой инженерии считаются материалы на основе естественного внеклеточного матрикса (ВКМ) [1]. ВКМ представляет собой трехмерную макромолекулярную сеть, состоящую из коллагена, протеогликанов, гликозаминогликанов, эластина, фибронектина, ламининов и других биомолекул [1, 2]. Компоненты ВКМ играют важную роль в мобилизации факторов роста, хемокинов, цитокинов и регулировании адгезии, миграции, дифференцировки и пролиферации клеток [1]. Стоит отметить, что ВКМ по своему биохимическому составу и структурной организации является уникальным для каждой ткани [2] и потому наиболее перспективным для тканевой инженерии.

Одним из наиболее широко применяемых и эффективных методов создания безопасного и биосовместимого неиммуногенного материала на основе ВКМ является технология децеллюляризации, заключающаяся в удалении клеточных антигенов и других иммуногенных компонентов из соответствующих органов и тканей [1, 5, 6].

Были проведены многочисленные исследования с оценкой эффективности различных протоколов децеллюляризации с целью получения биосовместимого материала на основе дермы свиньи [5] и крупного рогатого скота [6], легочной ткани мышей [7], лентикулы роговицы человека [8], сердечных клапанов свиньи [9], кровеносных сосудов крыс [10] и свиней [11], суставного хряща [12] и мениска крупного рогатого скота [13], яичников мышей, овец и человека [14], седалищного нерва крыс [15, 16], сухожилий из крысиных хвостов [17], бычьего перикарда [18], печени свиньи [19], тонкой кишки свиньи [19], мочевого пузыря свиньи [19, 20], жировой ткани свиньи [21, 22], амниотической мембраны [23] и пуповины человека [24].

1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ

Децеллюляризацию осуществляют физическими, химическими и ферментативными (биологическими) методами [1, 2, 25]. Выбор наиболее оптимального и эффективного способа децеллюляризации органа или ткани зависит от многих факторов, включая тип органа, видовую специфичность ткани, ее структуру, клеточный состав и плотность. Изменения в составе ВКМ могут вызывать сами агенты децеллюляризации, в той или иной степени нарушая его структуру, что необходимо учитывать при разработке и оптимизации протокола децеллюляризации. Сохранность в бесклеточной конструкции на основе ВКМ структуры и всех его основных компонентов представляется необычайно важной и сложной задачей.

1.1. Физические методы обработки

К физическим методам децеллюляризации относят циклы замораживания–оттаивания [12, 24, 26, 27], прямое механическое воздействие [22], обработка ультразвуком [13], градиент давления [28], воздействие сверхкритического диоксида углерода (scCO2) [21] и электропорация [10]. Использование этих методов приводит к лизису клеток без существенного нарушения ультраструктуры органа или ткани [29, 30].

Воздействие циклами попеременного замораживания и оттаивания является одним из наиболее широко используемых методов, при котором происходит образование внутриклеточных кристаллов льда, способных механически повредить клеточные мембраны [1, 30]. Метод попеременного замораживания и оттаивания может повторяться несколько раз, прежде чем обрабатываемый образец подвергнется дальнейшим этапам децеллюляризации. Многократное его повторение не приводит к значительной потере белков [27] и не влияет существенно на механические свойства ВКМ [7].

При электропорации, также называемой нетермической необратимой электропорацией, генерируются электрические импульсы микросекундной длительности для дестабилизации электрического потенциала клеточных мембран, вызывая образование на них микропор, приводящих к нарушению клеточного гомеостаза, и, как следствие, гибели клетки [1, 10]. Этот метод, как правило, сохраняет целостность, морфологию и трехмерную архитектуру ВКМ в органах или тканях, но ограничивается относительно малым размером электродов [1, 10, 30]. Однако, что более важно, децеллюляризация при электропорации должна проводиться in vivo, поскольку предполагается, что механизм удаления клеток является иммунноопосредованным [10, 25].

Под ультразвуком понимают звуковые волны, частота которых выше 20 кГц. Обработку ультразвуком, как правило, проводят в растворе додецилсульфата натрия для наиболее полной децеллюляризации [13, 31]. Применение ультразвука инициирует образование кавитационных пузырьков и приводит к увеличению проницаемости матрикса, что усиливает проникновение додецилсульфата натрия вглубь [13]. Такая обработка является эффективным методом децеллюляризации, позволяющим сохранить основные компоненты ВКМ [13, 31]. Однако при увеличении мощности ультразвука, или длительности обработки, или неконтролируемости кавитации, могут наблюдаться структурные нарушения ткани и изменения ее механических свойств [30, 31].

Органы и ткани, которые подвергаются только физической децеллюляризации, в частности циклам замораживания–оттаивания, считаются девитализированными, поскольку клетки лизируются, но клеточный дебрис и генетический материал все еще остаются в обработанном образце [12, 25, 29]. Таким образом, существует риск развития иммунных реакций, которые могут возникнуть в связи с наличием в ткани остаточного клеточного и генетического материала [29]. Поэтому физические методы рекомендуется сочетать с другими для достижения полной децеллюляризации [12, 29, 30].

1.2. Химические методы обработки

При химической децеллюляризации применяют кислоты [18, 20] и основания [5, 6, 14], детергенты (поверхностно-активные вещества) [5, 12, 14, 20, 24, 26], гипо- и гипертонические растворы [8, 15, 16], хелатирующие вещества [23] и различные растворители (например, спирты, ацетон и трибутилфосфат) [1, 17, 19, 22].

Обычно используют такие кислоты, как уксусная, надуксусная, соляная и серная, и такие основания, как гидроксиды аммония, кальция и натрия. Кислоты солюбилизируют цитоплазматические компоненты и разрушают нуклеиновые кислоты и их фрагменты [14, 25]. Щелочные растворы вызывают или катализируют деградацию нуклеиновых кислот и биомолекул путем гидролиза [2, 6]. Одним из основных недостатков при обработке кислотами является то, что они могут снижать прочность и механические свойства ВКМ из-за воздействия на его некоторые основные компоненты [1, 2, 18]. Так, при обработке уксусной кислотой могут наблюдаться разрушение и удаление коллагенов из ВКМ с соответствующим снижением прочности конструкции [18]. В то же время использование щелочных растворов может способствовать существенным изменениям структуры матрикса в связи с частичной денатурацией молекул коллагена [6, 14], а также приводить к удалению факторов роста [5]. Успешность децеллюляризации будет варьироваться в зависимости от типа и концентрации используемой кислоты или основания, времени обработки и типа обрабатываемого материала.

Химическая децеллюляризация также может быть выполнена с использованием детергентов. Различают три их основных типа: неионные, ионные и цвиттерионные [1, 2, 25, 29].

Неионные детергенты, такие как Triton X-100, разрушают клеточную мембрану, нарушая липид-липидные и липид-белковые взаимодействия, в значительной степени сохраняя белок-белковые [2, 25, 26]. При их воздействии белки растворяются, но нативная структура белков, как правило, остается неизменной [2]. Основным недостатком неионных детергентов является то, что при длительном воздействии они способны вызвать значительное снижение содержания гликозаминогликанов и отрицательно повлиять на ультраструктуру ВКМ [2, 25, 26].

Ионные детергенты, такие как додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, Triton X-200, лизируют клетки и разрушают их мембраны, подвергают клеточное содержимое дальнейшей деградации, а затем удаляют клеточную популяцию и дебрис из ткани [12, 25]. Ионные детергенты имеют тенденцию вызывать денатурацию и расщепление белков за счет белок-белковых взаимодействий, сопровождающихся изменением их нативной структуры [2], а также удалять факторы роста из тканей [5]. Кроме того, они могут приводить к значительной потере сульфатированных гликозаминогликанов [12, 20, 24, 27] и оказывать негативное влияние на процесс рецеллюляризации из-за цитотоксичности, обусловленной их остаточным содержанием в полученном материале [2, 9]. Как правило, ионные детергенты считаются более эффективными, чем неионные [17], однако их влияние на целостность и состав ткани зависит от конкретного органа, типа ткани, концентрации и длительности воздействия [12, 17, 20].

Цвиттерионные детергенты, такие как 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS), сульфобетаин-10 (SB-10) и сульфобетаин-16 (SB-16), обладают свойствами как ионных, так и неионных детергентов [25]. Хотя цвиттерионные детергенты вызывают меньшую денатурацию белков по сравнению с ионными, они также склонны удалять меньшее количество клеточного материала [29].

Использование гипо- и гипертонических растворов приводит к лизису клеток, вызывая осмотический шок и разрушение клеточной мембраны в органах и тканях, оказывая минимальное влияние на молекулы матрикса или его структуру [15, 25]. Для достижения максимального осмотического эффекта принято поочередно погружать органы или ткани в гипо- и гипертонические растворы в течение нескольких циклов [16]. Гипотонические растворы могут лизировать клетки за счет осмотического шока и способствовать увеличению проникновения других агентов децеллюляризации, в то время как гипертонические растворы обезвоживают клетки и разрушают связь ДНК с белками [8]. Однако гипо- и гипертонические растворы не способны полностью очистить и удалить клеточный дебрис из тканей [16, 25].

Хелатирующие вещества (или хелатообразующие агенты), такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и этиленгликольтетрауксусная кислота (EGTA), нарушают адгезию клеток к белкам ВКМ, секвестрируя ионы металлов (Ca2+ и Mg2+) [23, 25]. Как правило, их применяют совместно с детергентами или ферментами, поскольку они не способны вызвать даже поверхностного удаления клеток [23, 25].

1.3. Ферментативные методы обработки

Ферментативная децеллюляризация чаще всего используется непосредственно после других методов децеллюляризации или совместно с ними с целью облегчения деградации клеток и более эффективного удаления остаточного ядерного материала из матрикса [22, 29]. Обычно используют трипсин [5, 11], нуклеазы [16, 24], липазу [22], диспазу [23], термолизин [23] и α-галактозидазу [32]. Каждый из ферментов характеризуется своим собственным механизмом действия.

Трипсин представляет собой сериновую протеазу, которая селективно гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот – лизина и аргинина [11, 25]. Эффективность децеллюляризации и сохранение компонентов ВКМ при обработке трипсином зависят от его концентрации и времени воздействия [11]. Полная децеллюляризация только трипсином требует длительного времени воздействия, что коррелирует со снижением уровня некоторых белков и гликозаминогликанов [26], приводя к отрицательным изменениям механических свойств ВКМ [11].

Нуклеазы, такие как дезоксирибо- и рибонуклеаза, расщепляют фосфодиэфирные связи между нуклеотидными субъединицами нуклеиновых кислот [25]. Как правило, эти ферменты используются совместно с химическими методами обработки, что приводит к более эффективной элиминации нуклеиновых кислот [9]. Однако удаление самих нуклеаз после обработки затруднено [25].

При использовании диспазы происходит гидролиз N-концевых пептидных связей неполярных аминокислотных остатков. Преимущество диспазы заключается в том, что она расщепляет только фибронектин и коллаген IV. Длительная обработка диспазой ограничена из-за прямого воздействия на общую ультраструктуру ВКМ [25].

Чтобы свести к минимуму нежелательные эффекты при обработке ферментами, следует тщательно выбирать подходящую концентрацию, температуру и длительность обработки [1]. Сочетанное использование ферментов и детергентов или хелатирующих агентов является более эффективным [2].

2. ОЦЕНКА ПОЛНОТЫ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ

Для оценки полноты (эффективности) децеллюляризации проводят количественные и качественные методы исследования. Измерение количества двухцепочечной (дц) ДНК в децеллюляризованном матриксе является текущим “золотым стандартом” для оценки степени успешной децеллюляризации. Минимальными критериями качественной децеллюляризации являются:

– количественное содержание дцДНК менее 50 нг на миллиграмм сухой массы;

– фрагменты ДНК должны иметь длину менее 200 пар нуклеотидов;

– отсутствие ядерного материала в тканевых срезах при гистологическом окрашивании гематоксилином и эозином (haematoxylin and eosin, H&E) и окрашивании флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) [25].

Комплекс иммуногистохимических, гистологических и микроскопических методов исследования позволяет оценить изменения структуры ВКМ, а также его биохимический состав [33]. Количество гликозаминогликанов и коллагена в полученном материале, как правило, определяют с использованием 1,9-диметил-метиленового синего и реактива Эрлиха соответственно [24, 27]. Методы визуализации, такие как сканирующая/просвечивающая электронная микроскопия и микрокомпьютерная томография, могут использоваться для оценки сохранности структуры ВКМ [33]. Кроме того, в зависимости от предполагаемого клинического применения могут быть исследованы механические свойства полученного материала, включая модуль упругости и прочность при растяжении [29, 33].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на большое количество разработанных методов децеллюляризации органов и тканей, не существует универсального подхода, который бы обеспечивал как полное удаление клеточных компонентов и генного материала с сохранением структуры и основных компонентов ВКМ, так и подходил бы ко всем органам и тканям. В связи с этим при разработке и оптимизации протокола децеллюляризации необходимо учитывать множество факторов, включая специфичность органа, тип, толщину, плотность и клеточный состав ткани, а также предполагаемое клиническое применение полученного материала.

Список литературы

  1. Yi S., Ding F., Gong L., Gu X. // Curr. Stem Cell Res. Ther. 2017. V. 12. № 3. P. 233. https://doi.org/10.2174/1574888X11666160905092513

  2. Cesur N.P., Yalman V., Laçin Türkoğlu N. // Cumhur. Med. J. 2020. V. 42. № 2. P. 192. https://doi.org/10.7197/cmj.vi.609592

  3. Готье С.В., Хомяков С.М. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2023. Т. 25. № 3. С. 8. https://doi.org/10.15825/1995-1191-2023-3-8-30

  4. Крюков Е.В., Брижань Л.К., Хоминец В.В. и др. // Гений ортопедии. 2019. Т. 25. № 1. С. 49. https://doi.org/10.18019/1028-4427-2019-25-1-49-57

  5. Reing J.E., Brown B.N., Daly K.A. et al. // Biomaterials. 2010. V. 31. № 33. P. 8626. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2010.07.083

  6. Калмыкова Н.В., Демьяненко И.А., Шевлягина Н.В. и др. // Морфологические ведомости. 2016. Т. 24. № 4. С. 36. https://doi.org/10.20340/mv-mn.2016.24(4):36-45

  7. Nonaka P.N., Campillo N., Uriarte J.J. et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. 2014. V. 102. № 2. P. 413. https://doi.org/10.1002/jbm.a.34708

  8. Huh M.I., Lee K.P., Kim J. et al. // J. Ophthalmol. 2018. V. 2018. P. 2590536. https://doi.org/10.1155/2018/2590536

  9. Rieder E., Kasimir M.T., Silberhumer G. et al. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004. V. 127. № 2. P. 399. https://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2003.06.017

  10. Phillips M., Maor E., Rubinsky B. // J. Biomech. Eng. 2010. V. 132. № 9. P. 091003. https://doi.org/10.1115/1.4001882

  11. Gu Y., Wang F., Wang R. et al. // Cell Tissue Banking. 2018. V. 19. № 3. P. 311. https://doi.org/10.1007/s10561-017-9675-9

  12. Tavassoli A., Matin M.M., Niaki M.A. et al. // Iran. J. Basic Med. Sci. 2015. V. 18. № 12. P. 1221.

  13. Yusof F., Sha’ban M., Azhim A. // Int. J. Nanomed. 2019. V. 14. P. 5491. https://doi.org/10.2147/IJN.S207270

  14. Eivazkhani F., Abtahi N.S., Tavana S. et al. // Mater. Sci. Eng. C. 2019. V. 102. P. 670. https://doi.org/10.1016/j.msec.2019.04.092

  15. Kim J.K., Koh Y.D., Kim J.O., Seo D.H. // J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 2016. V. 69. № 12. P. 1690. https://doi.org/10.1016/j.bjps.2016.08.016

  16. Cornelison R.C., Wellman S.M., Park J.H. et al. // Acta Biomater. 2018. V. 77. P. 116. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2018.07.009

  17. Cartmell J.S., Dunn M.G. // J. Biomed. Mater. Res. 2000. V. 49. № 1. P. 134. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-4636(200001)49:1<134::aid-jbm17>3.0.co;2-d

  18. Dong X., Wei X., Yi W. et al. // J. Mater. Sci.: Mater. Med. 2009. V. 20. № 11. P. 2327. https://doi.org/10.1007/s10856-009-3791-4

  19. Brown B., Lindberg K., Reing J. et al. // J. Tissue Eng. 2006. V. 12. № 3. P. 519. https://doi.org/10.1089/ten.2006.12.519

  20. Kao C.Y., Nguyen H.Q., Weng Y.C. // Polymers (Basel). 2020. V. 12. № 12. P. 3007. https://doi.org/10.3390/polym12123007

  21. Chung S., Kwon H., Kim N.P. // J. Cosmet. Med. 2019. V. 3. P. 86. https://doi.org/10.25056/JCM.2019.3.2.86

  22. Brown B.N., Freund J.M., Han L. et al. // Tissue Eng. C. Methods. 2011. V. 17 № 4. P. 411. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2010.0342

  23. Hopkinson A., Shanmuganathan V.A., Gray T. et al. // Tissue Eng. C. Methods. 2008. V. 14. № 4. P. 371. https://doi.org/10.1089/ten.tec.2008.0315

  24. Safari F., Fani N., Eglin D. et al. // J. Biomed. Mater. Res. A. 2019. V. 107. № 8. P. 1793. https://doi.org/10.1002/jbm.a.36698

  25. Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. // Biomater. 2011. V. 32. № 12. P. 3233. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.01.057

  26. Cheng J., Wang C., Gu Y. // Biomed. Mater. Eng. 2019. V. 30. № 2. P. 191. https://doi.org/10.3233/BME-191044

  27. Fernández-Pérez J., Ahearne M. // Sci. Rep. 2019. V. 9. № 1. P. 14933. https://doi.org/10.1038/s41598-019-49575-2

  28. Sierad L.N., Shaw E.L., Bina A. et al. // Tissue Eng. C. Methods. 2015. V. 21. № 12. P. 1284. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2015.0170

  29. Kim Y.S., Majid M., Melchiorri A.J., Mikos A.G. // Bioengineering Translational Medicine. 2019. V. 4. №1. P. 83. https://doi.org/10.1002/btm2.10110

  30. Rabbani M., Zakian N., Alimoradi N. // J. Med. Signals Sensors. 2021. V. 11. № 1. P. 1. https://doi.org/10.4103/jmss.JMSS_2_20

  31. Lin C.H., Hsia K., Su C.K. et al. // Polymers (Basel). 2021. V. 13. № 11. P. 1699. https://doi.org/10.3390/polym13111699

  32. Nam J., Choi S.Y., Sung S.C. et al. // Korean J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2012. V. 45. № 6. P. 380. https://doi.org/10.5090/kjtcs.2012.45.6.380

  33. Сотниченко А.С., Губарева Е.А., Куевда Е.В. и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2017. Т. 19. № 3. С. 65.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА»

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал