Радиационная биология. Радиоэкология, 2022, T. 62, № 4, стр. 399-407

ФОНОВЫЕ УРОВНИ FISH-РЕГИСТРИРУЕМЫХ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ ДЛЯ ОДНОЦВЕТНЫХ И ДВУ-ТРЕХЦВЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ДНК-ЗОНДОВ

В связи с вышесказанным о недоступности знания исходного количества транслокаций у возможно облученных лиц приходится опираться на их предполагаемые значения, полученные в неких общих исследованиях контрольных контингентов, хотя идеально было бы иметь собственную базу данных, что в принципе достаточно трудоемко [2].

В статье [10] указывается, что необходимо знать факторы, которые могут оказывать возмущающее влияние на фоновые уровни транслокаций, к которым относятся возраст, привычка к курению, кластогенные химические вещества из внешней среды и медикаменты. На 42 здоровых субъектах в возрасте от 21 года до 73 лет авторы этой работы показали, что пол не влиял на частоту транслокаций (одноцветный FISH для разных наборов ДНК-зондов). Курение даже при ежедневном потреблении больше 30 сигарет, по-видимому, не оказывало существенного воздействия на выход этих аберраций. Однако наблюдалось явное увеличение числа транслокаций с возрастом: у лиц старше 60 лет их уровень был в 3 раза выше, чем у людей в возрасте до 40 лет. Кроме того, вариабельность частот транслокаций была выражена значительнее при возрасте после 40 лет, чем в более молодой группе. Так, у первых диапазон колебаний составлял частоту 1–6 наблюдаемых транслокаций на 1000 клеток, а у вторых – 0–3.

Возрастная динамика частот FISH-регистрируемых транслокаций была представлена в статье, посвященной сравнению уровней различных типов аберраций хромосом в экспонированных и контрольных контингентах [11]. Под экспонированными группами понимались ликвидаторы последствий аварии на Чернобыльской АЭС, которые не перенесли ОЛБ; лица (взрослые и дети), эвакуированные с радиационно-загрязненных территорий; работники, предположительно подвергшиеся облучению при их участии в проведении испытаний ядерного оружия, захоронении ядерных отходов, работе на ядерных предприятиях, службе на атомных подводных лодках. Параллельно обследовались люди, не имевшие случайного или профессионального контакта с источниками ионизирующих излучений, и их дети. На рис. 1 приведена диаграмма, взятая из статьи [11] и демонстрирующая возрастающую возрастную динамику геномных частот FISH-зарегистрированных транслокаций (одноцветное окрашивание, разные наборы ДНК-зондов) и в экспонированном (342 человека), и в контрольном (153 обследованных) контингентах. Как можно видеть, частоты транслокаций у экспонированных лиц достоверно превышали контрольные величины в тех же возрастных группах. При этом зависимости возраст–эффект удовлетворительно описывались квадратичными уравнениями в обоих случаях. Отметим, что, судя по визуальному анализу рис. 1, в контроле возрастные группы 40–49 и 50–59, а возможно, и 30–39 лет слабо различались между собой.

Рис. 1.

Возрастная динамика FISH-зарегистрированных транслокаций в экспонированной и контрольной популяциях (рисунок взят из статьи [11]).

Fig. 1. Age dynamics of FISH-registered translocations in the exposed and control populations (the figure is taken from the article [11]).

В дальнейшем было высказано мнение, что только комбинацией данных, полученных в разных лабораториях, можно получить уточненные сведения о фоновых уровнях транслокаций, разумеется, с переходом на их полногеномную частоту [12]. В самой этой работе было произведено комбинирование данных, полученных в восьми лабораториях: две из Великобритании (55 и 16 доноров – возраст 52–82 и 29–64 года соответственно), две из Германии (71 и 42 донора – возраст 10–74 и 21–73 года соответственно), одна из США (58 доноров – возраст 27–55 лет), одна из Нидерландов (55 доноров – возраст 23–66 лет), одна из Финляндии (119 доноров – возраст 18–70 лет) и одна из Франции (20 доноров – возраст 20–67 лет). В разных лабораториях результаты были получены с помощью различных в основном одноцветных ДНК-зондов (только в одной лаборатории использовали трехцветный набор). Ясное влияние возраста на накопление транслокаций было обнаружено в трех лабораториях. В остальных то же самое наблюдалось с некоторыми отклонениями в виде тенденции. Соответственно объединение данных подтвердило связь между фоновым уровнем транслокаций и возрастом обследованных лиц. При этом имелись некоторые выбросы внутри каждой возрастной группы. Половые различия отсутствовали, но в некоторых группах был зафиксирован эффект от курения. Также высказывалось предположение о возможном влиянии факторов образа жизни на накопление FISH-регистрируемых цитогенетических повреждений и минимальной роли в этом процессе фонового воздействия ионизирующей радиации.

Отдельно и в развитие данного сообщения была опубликована другая статья [13] с включением данных только семи европейских лабораторий: шесть участвовали в предыдущем исследовании и одна (из Испании) была добавлена вместо американской лаборатории. Около половины обследованных лиц принадлежали к контингенту из работы [12]. Однако, если в работе [12] старались различать полные и неполные транслокации, то теперь был сделан вывод о том, что в этом нет необходимости. Также подчеркивалось, что в европейских лабораториях последовательно отбрасывают клетки, в которых наблюдается явное отсутствие части какой-либо из FISH-окрашенных хромосом. При этом отмечалось, что для измерения контрольных уровней не имеет практического значения анализ только стабильных или всех клеток Достаточно лишь исключать метафазы с транслокациями в нестабильных клетках, число которых в целом очень мало. За единичными исключениями совпадение полученных результатов между различными лабораториями было хорошим. Наблюдалась сильная плавно возрастающая нелинейная по своему характеру связь частоты транслокаций с возрастом доноров. Это могло быть вызвано накоплением действия факторов внешней среды, процессами естественного старения или обеими причинами. В 10% всех образцов наблюдались резко выделяющиеся значения большей частью в сторону увеличения, хотя примерно в половине случаев это могло ожидаться и на статистических основаниях. Данные выбросы не имели клонального происхождения, так как обнаруженные четыре клона были скорректированы и сведены к одной клетке в каждом случае. Убедительные данные относительно влияния пола на фоновую частоту транслокаций получены не были, поскольку только в возрастной группе 30–39 лет у мужчин было значимо больше транслокаций, чем у женщин. Также отсутствовали явные свидетельства влияния статуса курильщика: более высокий уровень перестроек хромосом наблюдался только в двух из восьми (без новорожденных) возрастных групп (30–39 и 60–69 лет), да и то, только при сравнении некурящих и сильно курящих лиц. Это не согласуется с данными работ [14–16], в которых сообщалось о почти 30%-ном возрастании количества транслокаций у курильщиков.

Как продолжение работ [12, 13] был выполнен обширный мета-анализ [17] с использованием цитогенетических данных, полученных 16 лабораториями из Великобритании, Германии, Испании, Канады, Китая, Кореи, Нидерландов, России, Финляндии, Франции, Чехии и Японии на материале 1933 относительно здоровых индивидуумов в возрасте от 0 (пуповинная кровь новорожденных) до 85 лет. Здесь также использовался пересчет на число геном-эквивалентных клеток, так как применялись разные ДНК-зонды для одноцветного (11 лабораторий), двухцветного (три лаборатории) и трехцветного (три лаборатории) FISH-окрашивания. До сих пор это исследование считается лучшей международной базой данных по FISH-цитогенетическому контролю с учетом возраста, пола, расы, отношения к курению и регионов расположения лабораторий [2].

Как и в предыдущих рассмотренных работах [10–16], возраст оказывается основным фактором, определяющим рост частоты транслокаций. Эта связь почти линейна для молодых людей и приобретает существенную криволинейность в более старшем возрасте. На рис. 2 представлена такая возрастная зависимость для контрольных частот транслокаций, полученная после объединения данных разных лабораторий и взятая из статьи [17].

Рис. 2.

Зависимость геномной частоты транслокаций на 100 клеток от возраста. Возраст представлен в виде 5-летних средних (квадраты) с 95%-ными доверительными интервалами (рисунок взят из работы [17]).

Fig. 2. Dependence of the genomic frequency of translocations per 100 cells (ordinate axis) from age (years, abscissa axis). Age is presented as 5-year means (squares) with 95% confidence intervals (figure taken from [17]).

Возрастные зависимости крайне мало различались у мужчин и женщин, однако существенно модифицировались фактом курения в сторону увеличения частот транслокаций. Последнее обстоятельство входит в противоречие с данными работы [13] по Западной Европе. По контрольным уровням этих стабильных перестроек азиаты не отличались существенно от белой расы, а в культурах лимфоцитов периферической крови представителей черной расы имелось значительно меньше транслокаций, чем у белых. При этом в лабораториях из Азии и Западной Европы частоты транслокаций существенно не отклонялись от североамериканских лабораторий, но в лабораториях из Центральной и Восточной Европы было зарегистрировано больше транслокаций, чем в других лабораториях. Одновременно для лиц старше 60 лет наименьшие уровни наблюдались в западноевропейских лабораториях, промежуточные – в азиатских и североамериканских лабораториях и наивысшие опять в центрально- и восточноевропейских учреждениях. Соответственно возникали различия и в ходе возрастных зависимостей. Наибольшая кривизна наблюдалась в центрально- и восточноевропейских лабораториях, а в западноевропейских лабораториях эта связь носила практически линейный характер. В целом авторы признают, что, несмотря на обнаруженные расовые и территориальные (лабораторные) различия, их на самом деле очень трудно отличить друг от друга.

Хотя описанное международное исследование [17] объединило данные от большого числа представителей населения, проживающего в разных странах и регионах, однако практическое использование этих сведений порождает проблемы, связанные с различиями в образе жизни, величине естественного радиационного фона, наборе доступных медицинских услуг, особенно в связи с объемом осуществляемых лучевых диагностических исследований [18, 19]. По мнению авторов работы [19], если полученные в какой-либо лаборатории контрольные значения частот транслокаций соответствуют региону, из которого происходят обследуемые люди, то предпочтительно использовать собственные разработки. В случае, если радиационный инцидент произошел в другой стране (местности), применение объединенных международных данных будет более подходящим. Также была высказана мысль, что при получении собственных данных по фоновым частотам транслокаций количество образцов в каждой возрастной группе не должно быть меньше пяти для сближения показателей с результатами выполненного международного мета-анализа в статье [17].

Заметим, что в статье Bocskay K.A. et al. (2005), в которой с помощью двухцветного FISH-окрашивания производился подсчет транслокаций в культурах лимфоцитов пуповинной крови новорожденных, неожиданно было обнаружено существенно больше перестроек у афроамериканцев, чем у доминиканцев, хотя обе группы на момент обследования проживали в г. Нью-Йорке [20]. При этом гендерные различия отсутствовали. Фактор курения матерей также не влиял на уровень аберраций хромосом.

В более поздней работе также наблюдалась существенная связь (r = 0.416, p = 0.016) с возрастом для частоты транслокаций (ДНК-зонды к 1, 4 и 11 парам хромосом) в контрольной группе из 45 человек (18–57 лет), принадлежавших к административному штату АЭС “Козлодуй” (Болгария) [21]. При этом отсутствовала корреляция со статусом курильщика, потреблением кофе, приемом медикаментов, хроническими болезнями, радиологическими медицинскими исследованиями и действием пестицидов, но значимым, хотя и в низкой степени, был эффект от потребления алкоголя.

В некотором противоречии с вышесказанным о возрастной зависимости частот FISH-выявляемых транслокаций находятся данные статьи Hille A. et al. (2010), посвященной сравнению спонтанных выходов аберраций хромосом с их частотой в группе пациентов, подвергшихся радиотерапии по поводу рака простаты, где транслокации и дицентрики были объединены в одну группу простых обменов [22]. Использовались ДНК-зонды к двум и четырем парам хромосом. Оказалось, что в контрольной группе у трех доноров в возрасте 81–92 года уровень простых обменов варьировал от 0 до 0.6 на 100 клеток, а у доноров в возрасте от 64 до 70 лет (семь человек) – от 0.5 до 1.1 на 100 клеток. Таким образом, в младшей возрастной подгруппе наблюдалось больше перестроек, чем в более старшей, хотя и понятно, что количество обследованных лиц было очень мало.

О кластогенном влиянии алкоголя сообщалось и ранее еще при использовании классической однородной окраски хромосом, например, в работе [23], где был проведен цитогенетический анализ культур лимфоцитов 23 тяжелых алкоголиков в возрасте от 21 до 55 лет и 50 непьющих лиц в возрасте от 18 до 34 лет. В контроле вообще не были обнаружены хромосомные и хроматидные обмены. У алкоголиков больше всего наблюдалось дицентриков, но были зарегистрированы и реципрокные транслокации (атипичные хромосомы). Правда, алкоголики существенно больше и курили. Поэтому разделить эти два фактора не представлялось возможным. В другой статье [24] наряду с классической окраской использовался и одноцветный метод FISH-окрашивания (ДНК-зонды к 1, 3 и 6 парам хромосом), который продемонстрировал существенно большее число транслокаций у хронических алкоголиков и алкоголиков в стадии воздержания, чем у непьющих лиц. Однако в каждую группу при таком цитогенетическом исследовании входило только по шесть человек. Относительно влияния курения на выход аберраций хромосом можно судить только по результатам классического анализа, с помощью которого было обследовано 29 алкоголиков, 11 алкоголиков в состоянии воздержания и 10 человек в контрольной группе. Если в контрольной группе у курильщиков частота хромосомных перестроек увеличилась в 4 раза, по сравнению с некурящими индивидуумами, то у курящих алкоголиков их увеличение по сравнению с некурящими было очень незначительным, демонстрируя отсутствие аддитивности действия двух вредных факторов. Такая картина, скорее всего, наблюдалась бы и для FISH-регистрируемых транслокаций. Однако в статье [25] сообщалось об отсутствии влияния курения как на частоту нестабильных аберраций хромосом (классическая окраска), так и на частоту стабильных перестроек (FISH-окрашивание). Единственным эффектом было увеличение частоты гипердиплоидии у курильщиков.

Относительно влияния хронических заболеваний на уровни реципрокных транслокаций надо заметить, что не все так однозначно, как наблюдалось в работе [21]. Так, с помощью трехцветного FISH-окрашивания (ДНК-зонды для одной, двух и четырех пар хромосом) было показано существенное увеличение количества аберраций хромосом, представленных в виде числа разрывов на метафазу, у больных злокачественными новообразованиями до проведения радиотерапии по сравнению со здоровыми донорами [26]. Правда, из статьи не ясно, какое лечение эти больные также получали.

ФОНОВЫЕ УРОВНИ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ ПРИ ПОЛНОМ КАРИОТИПИРОВАНИИ С ПОМОЩЬЮ G- и mFISH-МЕТОДИК

mFISH-окрашивание может быть использовано для полного кариотипирования, и в этом отношении рассматривается как подход, дополнительный к методу G-бэндинга, используемому в онкогематологии, хотя мультицветный FISH, по-видимому, не имеет такой достаточно высокой степени разрешения, чтобы точно идентифицировать хромосомные регионы, участвующие в той или иной перестройке [8, 27]. В статье Талана О.А. и др. (2014) дифференциальная G-окраска метафазных хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови была использована для изучения спонтанных уровней аберраций хромосом, включая реципрокные транслокации, у жителей г. Киева разного возраста – подросткового (10–15 лет), среднего (35–50 лет), пожилого (60–70 лет) и долгожителей (90–100 лет) по 10 человек в каждой группе [28]. Проведенный анализ показал достоверное увеличение с повышением возраста от 10 до 70 лет средних групповых частот разных аберраций хромосомного типа. У долгожителей уровни перестроек были ниже, чем у лиц пожилого возраста и значимо не отличались от таковых у доноров среднего возраста. Это наглядно представлено диаграммой на рис. 3, взятом из рассматриваемой работы.

Рис. 3.

Стабильные (транслокации и инверсии) и нестабильные (делеции, дицентрики и кольца) аберрации хромосом (G-бэндинг) в культурах лимфоцитов периферической крови у лиц, входящих в разные возрастные группы (рисунок взят из работы [28]).

Fig. 3. Stable (translocations and inversions) and unstable (deletions, dicentrics and rings) chromosome aberrations (G-banding) in peripheral blood lymphocyte cultures of individuals from different age groups (the figure is taken from [28]).

Целью другой работы с использованием G-бэндинга для окраски хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови было сравнение частот аберраций у здоровых доноров в возрасте от 21 до 78 лет, разбитых в соответствии с последним показателем на группы, и у лиц, старше 100 лет [29]. При этом основные выводы были сделаны для “общей частоты всех хромосомных аберраций”, куда авторы включили анеуплоидию, пробелы и разрывы и структурные аномалии, что с нашей точки зрения не является правильным. К тому же, судя по фотографиям, не все в порядке с терминологией, так как пробелы – это хроматидные фрагменты, а разрывы – это хромосомные фрагменты, но все это тоже является структурными перестройками, а объединять их с количественными (анеуплоидия) не верно из-за разных механизмов их происхождения. В результате был сделан вывод, что в целом с возрастом наблюдалось увеличение уровня аберраций у представителей обоих полов. В трех более молодых группах (25–68 лет) средняя частота аберраций была существенно (в три раза) выше у женщин, чем у мужчин. В двух более пожилых группах (>68 лет) гендерные различия были несущественны, отражая факт наличия плато в выходе аберраций у женщин старше 60 лет, причем гиподиплоидия отмечалась как ведущий тип перестроек. Тренды позитивной корреляция между возрастом и стабильными структурными перестройками, к которым отнесли не только транслокации, но и некоторые делеции, были статистически несущественными.

Сведения о контрольных частотах аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови, обнаруженных с помощью mFISH-метода, значительно более ограничены, чем аналогичные данные, полученные при использовании одноцветного или двух-трехцветного FISH-окрашивания. Собственно говоря, требуемая информация в очень ограниченном виде содержится в работах, в которых проводилось обследование каких-либо групп, подвергающихся или подвергавшихся случайному или профессиональному облучению. При этом распределения по возрастным или гендерным подгруппам обычно отсутствовали, так как в контрольной и экспонированной популяциях производился подбор контингентов по соответствию возрастного и полового составов.

Так, одна из статей была посвящена цитогенетической индикации пролонгированного радиационного воздействия у работников ПО “Маяк”. Контрольная группа состояла из 34 жителей близлежащего г. Озерска (30% мужчины) со средним возрастом 77.42 ± 5.85 (± среднее квадратичное отклонение), которые никогда не подвергались профессиональному облучению, не участвовали в дезактивационных мероприятиях и не жили на радиоактивно загрязненных территориях. Уровень транслокаций на 100 клеток равнялся примерно 0.6–0.7 (оценка по представленному графику) [30]. Об остальном сказано, что в исследованных группах уровень всех аберраций не зависел от пола и возраста, а на количество стабильных аберраций не влияли курение и потребление алкоголя. В другой статье, посвященной цитогенетическому mFISH-обследованию почти тех же контингентов, но с другим числом лиц, вошедших в разработку, контрольная группа в возрасте 62.4 ± 12.5 лет состояла из 15 жителей г. Озерска (восемь мужчин и пять женщин), у которых средняя частота всех аберраций составила 0.67 ± 0.23 на 100 клеток, включая 1.22 ± 0.41 и 0.13 ± 0.08 стабильных и нестабильных аберраций соответственно [31].

В другой работе сравнивались частоты хромосомных аберраций, выявляемых с помощью mFISH-метода, в контрольном контингенте и у моряков (ветераны) с двух новозеландских фрегатов, которые участвовали в серии ядерных испытаний, проводившихся в 1957–1958 гг. британским правительством в Тихом океане [32]. Кровь была взята у 50 бывших моряков (у одного рост лимфоцитов в культуре был неудовлетворительным) и у 50 контрольных лиц (главным образом из армейской интендантской службы). Представители обеих групп географически проживали на Северном Острове Новой Зеландии, а их возраст соответствовал друг другу, составляя в среднем 65.9 и 66.5 лет соответственно. В целом частота хромосомных аномалий была значимо выше у ветеранов (275 транслокаций и 12 дицентриков в 9360 клетках), чем в контроле (96 транслокаций и один дицентрик в 9548 клетках). Вариабельность также была выше у ветеранов по сравнению с контролем: 0–65 и 0–35 транслокаций на 1000 метафаз соответственно, причем контрольная группа была в основном представлена категорией 0–10 транслокаций на 1000 клеток. В неэкспонированном контингенте распределение транслокаций по клеткам показало хорошее согласие с распределением Пуассона. Хотя размер выборки в исследовании не был достаточным для уверенного утверждения о несоответствии распределению Пуассона распределения транслокаций у ветеранов, но была ясно видна его мультимодальность в соответствии со сложной экспозицией. При планировании исследования старались соблюсти точное соответствие возраста и образа жизни. Таким образом, эти факторы не могли считаться определяющими переменными. Кроме того, не было значительной разницы в нынешнем уровне курения между двумя группами, так как почти все участники в настоящее время не курили. Более высокий уровень курения в прошлом среди ветеранов по сравнению с контрольной группой мог бы, по крайней мере, частично быть ответственен за более высокий уровень транслокаций у ветеранов. Однако уровни транслокаций у курильщиков и не курильщиков в обеих группах существенно не различались, т.е. фактор курения не влиял на частоты обнаруженных транслокаций как у ветеранов, так и в контроле.

Существенное преимущество мультицветного FISH-метода перед его одноцветным, двух- и трехцветными вариантами заключается в большей возможности идентифицировать сложные перестройки хромосом, в частности, при действии плотно ионизирующих излучений [31, 33, 34]. Первично было предложено считать, что они возникают, когда в двух и более хромосомах индуцируется три и более разрыва [34, 35]. Однако некоторые авторы отошли от этого положения и стали считать сложной транслокацией перестройку, возникшую в результате более двух разрывов в двух и более хромосомах [33]. В этой же работе было обнаружено, что частоты сложных аберраций были значительно выше у бывших работников ПО “Маяк”, которые подверглись воздействию плутония, чем у работников, пострадавших только от γ-облучения. Наоборот, частоты простых транслокаций были сравнимы в обеих этих группах. В контрольной группе уровень простых транслокаций был существенно ниже, а сложные аберрации не были обнаружены вообще. Одновременно авторы данной статьи высказываются в том смысле, что сложные транслокации, находящиеся в стабильных клетках, являются передающимися аберрациями при делении клеток и имеют тенденцию элиминировать с течением времени в той же степени, как и простые транслокации, хотя ранее предполагалась неустойчивость любых сложных аберраций. С этой точкой зрения согласны исследователи, представившие работу [35], в которой предлагается, с одной стороны, суммировать полные и неполные транслокации, а с другой стороны, представлять сложные обмены в стабильных клетках как сумму простых транслокаций.

В то же время, в связи со сказанным выше, возможность нахождения сложных аберраций в контроле при использовании mFISH-окрашивания была показана в работе [36].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в большинстве работ, использовавших от одноцветного до трехцветного вариантов FISH-окрашивания была показана или существенная, или в виде тенденции положительная криволинейная корреляция с возрастом величин частот реципрокных транслокаций в культурах лимфоцитов периферической крови. Одновременно связь с полом в подавляющем большинстве исследований не была обнаружена. Значительно менее однозначны данные о влиянии курения и приема алкоголя на уровни этих аберраций хромосом. В целом эти вредные привычки оказывают заметный генотоксический эффект, по-видимому, только при существенном злоупотреблении ими. Дифференциация между влиянием расовых и территориальных различий остается нерешенной проблемой, хотя отмечается возможная глобальная роль особенностей образа жизни. Предполагается, что желательно иметь собственные данные относительно спонтанных уровней реципрокных транслокаций в культурах лимфоцитов периферической крови. При этом возможно и использование в практических целях соответствующих сведений, полученных по результатам международного мета-анализа, осуществленного, например, в работах [13, 17].

Значительно более ограниченно количество работ, посвященных оценке с помощью мультицветного FISH-окрашивания количества транслокаций у неэкспонированных контингентов людей, хотя, конечно, сложно ожидать, что могут быть получены какие-либо закономерности, существенно отклоняющие от обозначенных выше. С другой стороны, полногеномное mFISH-карио-типирование, вероятно, позволит разрешить имеющиеся неопределенности относительно влияния различных факторов на контрольные уровни аберраций хромосом именно за счет более полного цитогенетического анализа.