Радиационная биология. Радиоэкология, 2022, T. 62, № 2, стр. 171-179

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Лабораторные животные. В экспериментах использовали 60 мышей самцов линии C57BL/6 в возрасте 7–8 нед массой 18–21 г, полученных из питомника “Столбовая”. При исследовании количества нейронов головного мозга, содержащих модифицированные 4-HNE белки, и количества клеток микроглии проведено две серии экспериментов, в каждой из которых использовано по пять животных в группе (контроль, 2, 8 и 20 Гр), при анализе экспрессии гена TNFα в гиппокампе использовано по пять животных в группе. Животных содержали в стандартных условиях вивария, со свободным доступом к воде и пище. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с требованиями этического комитета НИЦ “Курчатовский институт”.

Облучение. Однократное воздействие γ-излучения на голову мышей в дозах 2 и 8 Гр и фракционированное облучение головы мышей в суммарной дозе 20 Гр по схеме пять фракций по 4 Гр (три фракции по 4 Гр с интервалом 1 сут в течение 5 сут, затем через 2 сут еще две фракции с интервалом 1 сут) проводили на установке “ГУТ-200М” (источник – ⁶⁰Со, мощность дозы – 2.35 Гр/мин) при комнатной температуре. На время облучения животных помещали в специальные прозрачные пластмассовые фиксаторы для мышей (“Открытая наука”, Россия). Для предотвращения воздействия γ-излучения на другие ткани использовали свинцовую защиту.

Выделение клеток из головного мозга. Выделение клеток из мозга контрольных и облученных мышей проводили, как описано ранее [13], в соответствии с методом [14]. Для каждого срока исследования одновременно анализировали мозг контрольных и облученных животных. Транскардиальную перфузию для удаления клеток крови проводили после анестезии мышей с использованием смеси золетила и рометара. Мозг извлекали, удаляли мозжечок и обонятельные доли, помещали в чашку Петри и промывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с сахарозой (20 г/л) и глюкозой (0.9 г/л). Мозг измельчали в холодном ФСБ с добавлением аккутазы, переносили в пробирку и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Затем добавляли в каждую пробирку по 0.5 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС), помещали в ледяную баню, и гомогенат ткани дважды протирали через нейлоновое сито с диаметром пор 100 мкм (“SPL Life Sciences”, Республика Корея), а затем 1 раз через сито с диаметром пор 70 мкм и центрифугировали при 4°С 7 мин при 500 g. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 20%-ном изотоническом растворе (10 мл на 1 мозг) перколла (“GE Healthcare”, США). На перколл наслаивали 5 мл раствора Хэнкса (“ПанЭко”, Россия) и центрифугировали 10 мин при 550 g без торможения. Слой миелина, сконцентрированный в интерфазе, и супернатант удаляли, осадок клеток дважды промывали ФСБ. Клетки ресуспендировали в 0.5 мл ФСБ и подсчитывали в камере Горяева с добавлением трипанового синего.

Фенотипирование клеток головного мозга. Фенотипирование клеток мозга мыши проводили с помощью окрашивания антителами к соответствующим антигенам. Клетки фиксировали в растворе 2%-ного параформальдегида (ПФА) в ФСБ в течение 20 мин при комнатной температуре, отмывали ФСБ и пермеабилизировали в ФСБ, содержащем 0.1% Triton X-100 и 1% бычьего сывороточного альбумина (“Sigma Aldrich”, США) в течение 30 мин. Клетки мозга окрашивали антителами к антигену мыши CD11b, конъюгированными с фикоэритрином, и к CD45, конъюгированными с красителем Alexa Fluor 488. Клетки микроглии идентифицировали как субпопуляцию СD11b⁺/СD45^low после двойного окрашивания антителами к CD11b и к СD45 (“ВioLegend”, США). Популяция клеток с фенотипом СD11b⁺/СD45^high соответствует клеткам активированной микроглии и макрофагам. Разведение антител использовали в соответствии с указаниями фирмы-изготовителя.

При исследовании количества нейронов, содержащих белки, модифицированные 4-HNE, клетки головного мозга фиксировали в ФСБ, содержащем 2% ПФА при комнатной температуре 30 мин. Фиксированные образцы хранили при +4°С. Перед окрашиванием образцы инкубировали в 0.1%-ном растворе Triton X-100, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) для блокировки неспецифического связывания в течение 30 мин при комнатной температуре. Иммуноцитохимическое окрашивание 4-HNE-модифицированных белков и маркера зрелых нейронов NeuN проводили в блокирующем буфере (ФСБ, содержащем 1% БСА) c использованием непрямых кроличьих поликлональных антител (ab46545) к модифицированным 4-HNE белкам (“Abcam”, Великобритания) в разведении 1 : 200, и мышиных моноклональных антител к мышиному белку NeuN (“Merck”, Германия) в разведении 1 : 200 в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее образцы отмывали в ФСБ трижды и окрашивали вторичными антителами: козьими против мышиного иммуноглобулина, мечеными Alexa Fluor 647 (“Biolegend”, США) в разведении 1:1000, и козьими против кроличьего иммуноглобулина, мечеными Alexa Fluor 488 (“Biolegend”, США) в разведении 1:2000 в течение 1 ч при комнатной температуре. После окрашивания образцы трижды отмывали в ФСБ.

Флуоресценцию клеток анализировали на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur (“BD Biosciences”, США), оснащенном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм, и диодным красным лазером с длиной волны 635 нм. (Ресурсный центр клеточной и молекулярной биологии.) В каждом образце анализировали 10 000 клеток.

Анализ экспрессии мРНК гена TNFα. Анализ экспрессии гена TNFα в гиппокампе мышей проводили с помощью ПЦР в реальном времени. Через 2 мес. после облучения у контрольных и облученных мышей после проведения перфузии извлекали мозг и отделяли гиппокамп. РНК из гиппокампа выделяли фенол-хлороформенным методом, используя реактив ExtractRNA (“Евроген”, Россия) по инструкции производителя. Анализ относительной экспрессии мРНК гена TNFα проводили с помощью ОТ-ПЦР. Обратную транскрипцию (синтез кДНК) проводили в реакционной смеси с конечным объемом 20 мкл, приготовленной на обработанной ДЭПК деионизованной стерильной воде, содержащей 67 ммоль/л Трис-HCl (рН 8.8), 16.6 ммоль/л (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween 20, 4 ммоль/л МgCl₂, 1 ммоль/л каждого дНТФ, 3.2 мкг смеси гексамерных праймеров со случайной последовательностью, 10 ммоль/л дитиотреитола, 10 ед. акт. ингибитора рибонуклеаз, 30 ед. рекомбинантной обратной транскриптазы M-MLV, 1 мкг суммарной РНК. Смесь инкубировали при 42°С в течение 1 ч. Реакцию останавливали путем тепловой инактивации обратной транскриптазы, выдерживая смесь при 94°С в течение 10 мин. Экспрессию мРНК гена TNFα определяли с использованием красителя SYBR Green I на амплификаторе CFX96 TouchTM (“Bio-Rad”, США). ПЦР проводили в реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR (“Евроген”, Россия) с конечным объемом 25 мкл, в реакцию вносили 2 мкл реакционной смеси после ревертирования, содержащую кДНК и 7.5 пкмоль каждого из пары праймеров: для гена TNFα f5'aaatggcctccctctcatc3', r5'tttgagatccatgccgttg3'; для гена GAPDH f5'cagcctcgtcccgtagaca3', r5'ttcccgttgatgacaagcttc3'. Проверку геноспецифичности праймеров осуществляли при помощи программ Oligo Ver.7 и Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi). Нуклеотидные последовательности генов были взяты из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Временной и температурный режим ПЦР для анализа экспрессии TNFα и GAPDH: 95°С – 15 с (первый шаг – 5 мин), 54°С (62°С для GAPDH) – 15 с, 72°С – 45 с, 45 циклов ПЦР. Каждый образец кДНК анализировали трижды.

Уровень экспрессии мРНК гена TNFα в гиппокампе измеряли относительно экспрессии конститутивного гена GAPDH и выражали как 2^–∆Сt, где ∆Ct = Ct_TNFα. – Ct_GAPDH. Ct – пороговый уровень флуоресценции, соответствующий номеру цикла ПЦР исследуемого образца, в котором флуоресценция отличается от фонового шума. Анализ проводили с использованием программы Bio-Rad CFX Manager 2.0. Относительный уровень экспрессии гена TNFα в гиппокампе облученных животных рассчитывали по отношению к среднему значению для контрольной группы, который принимали за единицу. Результаты представляли в виде средних значений ± стандартное отклонение.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ осуществляли по методу Стьюдента с использованием t-критерия Стьюдента с помощью компьютерной программы “Origin”. Результаты, кроме данных по ПЦР, представлены в виде средних значений ± ошибка среднего; данные по ПЦР представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение. Статистически значимыми считали различия при р < 0.05. Для анализа характера зависимости повышения количества нейронов, содержащих 4-HNE-модифицированные белки, от дозы облучения проводили регрессионный анализ также с использованием компьютерной программы “Origin”.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Количество нейронов, содержащих 4-HNE-модифицированные белки, определяли в суспензии клеток мозга контрольных и облученных мышей через 2 мес. после однократного γ-облучения головы в дозах 2 и 8 Гр и фракционированного облучения головы в дозе 20 Гр.

Алгоритм определения клеток, содержащих 4-HNE-модифицированные белки, с помощью проточной цитометрии показан на рис. 1.

Рис. 1.

Анализ количества нейронов головного мозга, содержащих белки, модифицированные 4-HNE, с помощью проточной цитометрии. а – прямое/боковое светорассеяние типичного препарата клеток мозга мыши, область R1 соответствует анализируемой популяции. б и в – dot-plot гистограммы клеток мозга мыши контрольной группы и через 2 мес. после облучения головы в суммарной дозе 20 Гр соответственно, окрашенных антителами к NeuN, конъюгированными с красителем Alexa Fluor 647, и к модифицированным 4-HNE белкам, конъюгированным с красителем Alexa Fluor 488. г–е – примеры гистограмм аутофлуоресценции (левый пик) и флуоресценции нейронов, окрашенных антителами к белкам, модифицированным 4-HNE (правый пик), из мозга контрольных (г) и облученных в дозе 8 (д) и 20 Гр (е) мышей. MFI – средняя интенсивность флуоресценции.

Fig. 1. Assessment of the number of brain neurons containing 4-HNE-modified proteins using flow cytometry. a – forward/side scatter shown for one of the typical samples, R1 region identifies population of interest. b and c – dot plots for brain cells, isolated from control mice and from mice 2 months after head irradiation at a dose of 20 Gy respectively. Cells were stained with antibodies to NeuN, conjugated with Alexa Fluor 647, and antibodies to 4-HNE modified proteins, conjugated with Alexa Fluor 488. d–f – examples of the histograms, showing autofluorescence (left peak) and fluorescent signal from the neurons, stained with antibodies to 4-HNE modified proteins (right peak) from the control mice (d) and mice, irradiated at a dose of 8 Gy (e) and 20 Gy (f). MFI – Mean Fluorescence Intensity.

Нейроны идентифицировали как клетки, окрашенные антителами к белку NeuN (расположены в квадратах 2 и 4 на рис. 1, б и в). Нейроны, содержащие 4-HNE-модифицированные белки, определяли как 4-HNE⁺/NeuN⁺-клетки, расположенные в квадрате 2 dot-plot гистограмм б и в. Относительное количество модифицированных белков в клетках оценивали по величине средней интенсивности флуоресценции (MFI) нейронов, содержащих 4-HNE-модифицированные белки (рис. 1, гистограммы г–е).

Из представленных данных следует, что через 2 мес. после облучения в дозах 8 и 20 Гр возрастает как количество 4-HNE-модифицированных нейронов (рис. 1, гистограммы б и в), так и количество 4-HNE-модифицированных белков в этих клетках (гистограммы г–е).

Данные количественного анализа полученных результатов представлены на рис. 2 и в табл. 1. Показано, что в мозге контрольных мышей 14.3 ± 2.3% нейронов содержат 4-HNE-модифицированные белки, которые образуются в результате модификации эндогенным 4-HNE, возникающим под действием АМК, появляющихся в процессе метаболизма.

Рис. 2.

Количество нейронов головного мозга, содержащих модифицированные 4-HNE белки, через 2 мес. после γ-облучения головы мышей (а) и зависимость их уровня от дозы облучения (б). На рис. б приведено уравнение линии регрессии.

Fig. 2. The number of mouse brain neurons, containing 4-HNE modified proteins 2 months after γ-irradiation of the head (a) and it’s dose dependence and the regression line equation (б).

Через 2 мес. после облучения головы в дозе 2 Гр увеличения 4-HNE⁺нейронов в мозге облученных мышей по сравнению с контрольными не обнаружено, в то время как количество таких клеток после облучения головы мышей в дозах 8 и 20 Гр статистически значимо возрастало с 14.3 ± 2.3% в контроле до 23.1 ± 2.6 и 34.8 ± 4.9% (р < 0.05) соответственно (рис. 2, а). Количество 4-HNE⁺-нейронов в выделенной фракции клеток мозга возрастало прямо пропорционально дозе облучения (уравнение линии регрессии y = 13.2 + 1.1X; R² = 0.97; p = 0.03, рис. 2, б).

Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) 4-HNE⁺ нейронов отражает количество модифицированного 4-HNE белка в клетках. В табл. 1 приведены данные об изменении величины MFI 4-HNE⁺ нейронов после облучения головы мышей.

Показано достоверное увеличение 4-HNE-модифицированных белков в клетках головного мозга животных через 2 мес. после облучения головы в дозе 20 Гр (табл. 1). Таким образом, при высоких дозах облучения головы возрастает не только количество нейронов, содержащих 4-HNE-модифицированные белки, но и количество модифицированного 4-HNE белка в нейронах.

Для оценки развития нейровоспаления в мозге облученных мышей в рассматриваемый период анализировали долю клеток активированной микроглии в выделенной фракции клеток мозга и уровень экспрессии гена провоспалительного цитокина TNFα в гиппокампе. Полученные результаты представлены на рис. 3 и 4.

Рис. 3.

Доля клеток активированной микроглии в суспензии клеток, выделенных из головного мозга контрольных мышей и из мозга мышей через 2 мес. после облучения головы в разных дозах.

Fig. 3. The proportion of activated microglia in a suspension of cells, isolated from the brains of control mice and mice 2 months after irradiation of the head at different doses.

Рис. 4.

Уровень экспрессии гена провоспалительного цитокина TNFα в гиппокампе контрольных мышей и мышей через 2 мес. после облучения головы в разных дозах.

Fig. 4. The level of cytokine TNFα gene expression in the hippocampus of control mice and of mice 2 months after head irradiation at different doses.

Долю клеток активированной микроглии с фенотипом CD11⁺CD45^high рассчитывали по отношению ко всей микроглии (сумма покоящейся CD11⁺CD45^low и активированной микроглии CD11⁺CD45^high) в суспензии выделенных клеток мозга, которые идентифицировали с помощью проточной цитометрии, как описано ранее [13]. Полученные результаты представлены на рис. 3. Доля клеток активированной микроглии в составе выделенной фракции клеток мозга представлена в процентах от контроля.

Показано, что через 2 мес. после облучения головы мышей в дозе 2 Гр доля активированной микроглии в суспензии клеток, выделенных из мозга, не отличалась от контроля, в то время как после облучения в дозах 8 и 20 Гр она была достоверно повышена и составляла 268.3 ± 55.6% и 245.0 ± 25.0% от контроля (р < 0.05), что свидетельствует о нейровоспалении в мозге мышей через 2 мес. после облучения головы в дозах 8 и 20 Гр и его отсутствии в этот период после облучения головы в дозе 2 Гр.

Повышение содержания доли активированной микроглии при разных воздействиях является одним из показателей развития нейровоспаления, при котором в мозге также повышается уровень ряда провоспалительных цитокинов, в частности уровень фактора некроза опухоли α – TNFα – в гиппокампе. На рис. 4 представлены данные, полученные при анализе уровня экспрессии гена TNFα в гиппокампах, выделенных у мышей через 2 мес. после обучения головы в дозах 2, 8 и 20 Гр по отношению к уровню, наблюдаемому у контрольных мышей, который был принят за единицу.

Показано, что уровень экспрессии цитокина TNFα в гиппокампе мышей, облученных в дозах 2, 8 и 20 Гр через 2 мес., возрастал в 2, 4 и 3 раза соответственно по сравнению с контролем (р < 0.05), что свидетельствует о повышении активности этого биохимического маркера нейровоспаления.

ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве источника нейронов и микроглии в настоящей работе были использованы клетки, выделенные из головного мозга мыши. Полученные препараты, как было показано ранее, содержали нейроны, олигодендроциты, астроциты, клетки покоящейся и активированной микроглии [13], при этом общее количество выделенных клеток составляло 1.5–2.5 млн на 1 мозг. Выделенная фракция представляет лишь небольшую часть от общего количества клеток мозга мыши, но, тем не менее, ее использование позволяет оценить влияние разных воздействий, в том числе и действие γ-облучения головы, на состояние разных типов клеток головного мозга.

При исследовании клеток контрольных мышей и клеток, полученных через 2 мес. после γ-облучения головы в выбранных дозах, нами обнаружено повышение количества нейронов, содержащих белки, модифицированные 4-HNE, после облучения в дозах 8 и 20 Гр, в то время как после облучения головы мышей в дозе 2 Гр количество 4-HNE⁺ нейронов не отличалось от контроля. В то же время следует отметить, что в работе [15] при иммуногистохимическом исследовании коры головного мозга через 2 мес. после общего γ-облучения мышей в дозе 2 Гр обнаружено повышение количества 4-HNE⁺ нейронов до 35% клеток в поле зрения по сравнению 8% положительных клеток в контроле. Наблюдаемые различия связаны, по-видимому, с особенностями ответа как всего организма, так и клеток мозга на общее и локальное облучение. Так, хорошо известно, что общее облучение мышей в дозе 2 Гр вызывает острую лучевую болезнь с опустошением костного мозга и подавлением кроветворения, которое восстанавливается только после 1 мес. с момента облучения. Глубокая и длительная лейкопения показана и нами при общем облучении мышей в этой дозе [13], в то время как при локальном облучении головы ни при дозе 2 Гр, ни при дозах 8 и 20 Гр не наблюдали снижения количества лейкоцитов в периферической крови облученных мышей [12]. Длительное снижение клеток костного мозга и лейкоцитов периферической крови приводит к глубокому нарушению гомеостаза, в том числе к потере защитных факторов и цитокинов, продуцируемых клетками костного мозга, что может быть причиной более глубокого окислительного повреждения нейронов при общем облучении, чем при локальном облучении головы.

Следует отметить, что около 14% нейронов у необлученных мышей также содержали модифицированные 4-HNE белки (рис. 2, а), что, по-видимому, отражает образование определенного уровня 4-HNE в результате физиологических окислительных процессов в мозге. Действительно, показано, что концентрация 4-HNE в сыворотке крови здоровых добровольцев составляла около 18 мкмоль/л, что определяется эндогенным образованием этого окислительного метаболита. При этом у пациентов с обструктивной болезнью легких в условиях ишемии, вызванной снижением парциального давления кислорода ниже 40 мм рт. ст., концентрация 4-HNE в сыворотке возрастала до 30 и даже до 50 мкмоль/л [16]. Определенный уровень модифицированных 4-HNE белков обнаружен и в нейронах нормального мозга мышей при иммуногистохимическом исследовании, который возрастал при окислительном стрессе, вызванном ишемией [15, 17].

Образование 4-HNE и накопление модифицированных 4-HNE белков, по-видимому, происходит как сразу после облучения, так и в отдаленный период в результате длительного действия факторов воспаления. Вклад каждого из этих процессов в повреждение нейронов в настоящей работе оценен не был, этот вопрос представляет значительный интерес и требует дополнительных исследований. Следует подчеркнуть, что 4-HNE токсичен для клеток [4, 16, 18], поэтому часть клеток с высоким уровнем образования 4-HNE после облучения могла уже погибнуть к 2 мес. после воздействия.

Обнаруженное повышение доли клеток активированной микроглии в выделенных клетках мозга (рис. 3) и повышенный уровень экспрессии гена TNFα в гиппокампе мышей, облученных в дозах 8 и 20 Гр, можно рассматривать как признаки нейровоспалении у этих животных спустя 2 мес. после такого воздействия. Нейровоспаление в свою очередь может приводить к повышенной продукции активных метаболитов кислорода, образованию под их действием 4-HNE и повреждению нейронов с его участием. Повышение TNFα в гиппокампе после облучения мышей в дозе 2 Гр при отсутствии повышения доли активированной микроглии и увеличения модифицированных 4-HNE нейронов в выделенных клетках мозга может определяться повышением концентрации свободного 4-HNE, который является активатором экспрессии гена TNFα [19].

Таким образом, через 2 мес. после облучения головы мышей в дозах 2, 8 и 20 Гр обнаружено дозозависимое повышение количества нейронов, содержащих белки, модифицированные 4-HNE. Количество таких нейронов во фракции выделенных клеток мозга возрастало прямо пропорционально дозе облучения. Использованные маркеры нейровоспаления – доля клеток активированной микроглии в выделенной фракции клеток мозга и уровень экспрессии гена цитокина TNFα в гиппокампе мышей – также возрастали при увеличении дозы облучения. Это позволяет связывать происхождение модифицированных 4-HNE белков в нейронах не только с развитием окислительного стресса непосредственно при облучении мозга, но и с длительным окислительным стрессом в результате действия факторов пострадиационного нейровоспаления.

Полученные результаты позволяют рассматривать повышение количества нейронов, содержащих 4-HNE-модифицированные белки в отдаленный период после облучения, как маркер окислительного повреждения этих клеток мозга под действием АМК, образующихся при облучении и вызванном им длительном нейровоспалении.