Радиационная биология. Радиоэкология, 2022, T. 62, № 1, стр. 28-41

Трансплантация опухолевой ткани

Культура клеток легочной карциномы Льюиса была получена в Центре онкологии им. Н.Н. Блохина. Для получения опухолевой суспензии извлекали опухоль у мыши-донора. Навеску опухоли (4 г) с раствором Хенкса (24 мл) измельчали палочкой в ступке и отфильтровывали через сито. Полученную 14%-ную суспензию диспергированной опухолевой ткани в объеме 0.2 мл вводили подкожно в правую заднюю лапу мышей (10⁵ клеток в 0.2 мл р-ра Хенкса/животное). Измерение опухоли у каждого животного производили ежедневно за исключением выходных, начиная с 13-х суток после введения клеток, когда объем опухоли был достаточно выражен.

Облучение животных

Тотальное 4-кратное рентгеновское облучение в дозе 75 мГр проводили на аппарате РУСТ М1 (Россия) на 10-е, 13-е, 17-е и 21-е сутки после трансплантации опухолевых клеток с расположением каждой мыши в отдельной ячейке планшета. Пониженную мощность дозы (0.154 Гр/мин) получали путем снижения тока на трубку до 0.7 мА при напряжении 200 кВ. Дозиметрию в ячейках планшета проводили с помощью термолюминесцентных дозиметров.

Рис. 1.

Схема опыта на мышах с перевитой карциномой Льюиса и облучением в малой дозе.

Fig. 1. Scheme of the experiment on mice with transplanted Lewis carcinoma and irradiated at a low-dose radiation.

Мышей подвергали эвтаназии путем декапитации на 14-е и 22-е сутки после трансплантации. Костный мозг выделяли из большой бедренной кости в 0.8 мл среды RPMI-1640 (Sigma Aldrich), с глутамином без фенола красного, рН = 7.2–7.4. Полученная суспензия костного мозга содержала (0.5–2) × 10⁶ клеток в 0.1 мкл и хранилась при –70°С до использования. Также извлекали селезенку, тимус, печень, опухоли бедренной кости, замораживали и хранили при –70°С.

Часть животных в каждой из двух групп с опухолями выделяли для наблюдения за выживаемостью вплоть до полного падежа, реализующегося примерно в течение месяца после трансплантации опухолевых клеток. Схема опыта изображена на рис. 1.

Получение гомогената и выделение тотальной РНК

Образцы биоптатов органов и опухоли мышей одинаковой массы (0.1 г) обрабатывали на механическом гомогенизаторе Daihan HS (Ю. Корея) в 1 мл раствора охлажденного тризола или фосфатного буфера. Выделение тотальной РНК проводили тризольным методом с использованием набора “Trizol RNA Prep 100” в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Метод основан на применении лизирующего реагента Trizol (гуанидинтиоционат с фенолом, рН = 4.0) с добавлением хлороформа и последующим осаждением РНК спиртом из водной фазы.

Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени

Синтез комплементарной ДНК проводили с помощью набора лиофилизированных реагентов для проведения реакции обратной транскрипции “GenePak RT Corе” (OOO “Лаборатория Изоген”, Россия), содержащего 100 ед. обратной транскриптазы M-MLV (“Promega”, США), 20 ед. ингибитора РНК-аз RNasin, cлучайные гекса- и нанонуклеотидные праймеры, дезоксинуклеотид-трифосфаты и оптимизированную буферную систему. Реакцию обратной транскрипции для miR-21 осуществляли по технологии “stem loop”, где использовали праймер: L-5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG-ATACGACTCAACAT-3' (50 нмоль/л) и набор “GenePak RT Corе” (OOO “Лаборатория Изоген”, Россия), без добавления cлучайных гекса- и нанонуклеотидных праймеров.

ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе “DTprime 5М3” (НПО ДНК-Технология, Россия) с использованием красителя SYBR Green I (Thermo Scientific, США) или TaqMan-зонда. Условия ПЦР-РВ для генов и микроРНК были подобраны эмпирическим путем с помощью температурного градиента по матрице. Каждую ПЦР проводили не менее двух раз. Результаты, полученные с помощью ПЦР, анализировали методом ΔΔCt [10]. В качестве эндогенного контроля экспрессии генов и некодирующих РНК был выбран ген GAPDH. Нуклеотидная последовательность праймеров и зондов для исследуемых генов, а также условия для ПЦР-РВ представлены в табл 1.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ STATISTICA 7.0, которая включала в себя определение медианы и 25 и 75% квартилей [11]. Для оценки значимости различий применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Значения медианы в контрольной группе были приняты за единицу, а значения медианы в исследуемых группах показывали, во сколько раз уровень экспрессии показателя выше или ниже по отношению к контрольной группе. Различия признавали статистически значимыми при р < < 0.05 и р < 0.1, где р – показатель статистической значимости данных.

Корреляционные зависимости рассчитывали по непараметрическому ранговому критерию Манна–Уитни, поскольку большая часть данных не подчинялась нормальному распределению, и по ранговому критерию Спирмена. Также для оценки корреляции был применен регрессионный анализ.

Влияние действия МДР на динамику роста опухолей у мышей, инокулированных карциномой Льюиса

На рис. 2 в динамике представлены усредненные результаты изменения объема инокулированной опухоли в группах необлученных и облученных 4-кратно в малой дозе мышей. Как видно из рис. 2, рост опухоли до 20-х суток в обеих группах происходит абсолютно одинаково, а затем начинается постепенное замедление роста в группе облученных мышей, переходящее после 28 сут на плато у обеих групп, но с выраженной тенденцией к снижению объема опухоли в группе мышей, облученных в малых дозах.

Рис. 2.

Динамика роста карциномы Льюиса (% к исходному объему на 13-е сутки, когда измерение становится возможным) в группах необлученных (1) и облученных в МДР (2) мышей.

Fig. 2. The dynamics of the growth of Lewis carcinoma (% of the initial volume on 13th day after transplantation, when measurement becomes possible) in the groups of unirradiated (1) and irradiated with low doses (2) mice.

Чтобы охарактеризовать количественно различия в динамике роста опухоли в сравниваемых группах необлученных и облученных в малых дозах мышей, был проведен регрессионный анализ сравниваемых кривых. На рис. 3 представлены регрессионные кривые роста опухолей, их аналитические выражения и корреляционные оценки в интервале 13–28 сут после перевивки опухоли.

Рис. 3.

Регрессионный анализ динамики роста опухоли в группах необлученных (1) и облученных (2) мышей.

Fig. 3. Regression analysis of the dynamics of tumor growth in the groups of unirradiated (1) and irradiated (2) mice.

Из рис. 3 видно, что линейная регрессия значимо аппроксимирует представленные на графике усредненные оценки размеров опухоли для обеих групп мышей. Также видно, что наклон кривой 2 снижен по сравнению с кривой 1, что правомерно отнести на счет 4-кратного воздействия в МДР. Количественно тормозящее действие облучения в МДР можно оценить по отношению коэффициентов регрессий, отражающих скорость роста в относительных единицах (% увеличения за сутки объема опухоли от исходного измерения, принятого за 100). Таким образом, скорость роста в облученной группе составляет от аналогичного показателя в необлученной группе: (314.9/410.7) × 100 = 76.7%.

Учитывая, что облучение происходило в интервале 10–21 сут после трансплантации опухоли и фактическое торможение роста имело место после окончания курса облучения, регрессионный анализ динамики роста был дополнительно применен к периоду 20–28 сут (рис. 4).

Рис. 4.

Регрессионный анализ кривых роста опухоли в группах необлученных и облученных мышей (обозначения как на рис. 3) в интервале 21–28 сут после трансплантации опухолевых клеток.

Fig. 4. Regression analysis of tumor growth curves in groups of unirradiated and irradiated mice (notation as in Fig. 3) in the interval of 21–28 days after tumor cell transplantation.

На рис. 4 видно, что усредненные результаты измерений объема опухоли в обеих группах значимо аппроксимируются линейными зависимостями. Количественное соотношение роста опухоли в облученной группе мышей по отношению к необлученной группе составляет (251.4/483.2) × × 100 = 52%.

В отношении показателя выживаемости мышей различий между группой “Опухоль” и группой “Опухоль + облучение” отмечено не было. Средняя продолжительность жизни в первом случае составила 30.6 сут после трансплантации опухолевых клеток, а во втором – 31.3 сут.

Полученный материал из-за небольшого количества животных не дает возможности констатировать увеличение продолжительности жизни. Однако в литературе имеется значительное число публикаций, на разных представителях животного мира начиная от насекомых и заканчивая человеком, об увеличении этого показателя после применения МДР или при проживании людей в регионах с повышенным фоном радиации [12].

Динамика изменения активности генов и некодирующих РНК у мышей с трансплантированной карциномой Льюиса

Нами были исследованы две основные системы, имеющие первую линию защиты при повреждении клеток ионизирующим излучением – P53-система сохранения стабильности генома и NFkB-система воспалительного ответа. Были проанализированы изменения экспрессии генов, днРНК и микроРНК, вовлеченных в каскад реакций, запускаемых ионизирующим излучением.

После воздействия фракционированного облучения на мышей отмечалась значимая положительная корреляция между генами Р53 и NFkB и их мишенями. Замечено, что после двух облучений изменения активности генов еще не так выражены.

Воздействие ионизирующего излучения на клетку в зависимости от дозы можно рассматривать по-разному. Высокие дозы ионизирующего излучения обладают противоопухолевым эффектом, ингибируя пролиферацию злокачественных клеток, индуцируя двухцепочечные разрывы ДНК. С другой стороны, действие МДР имеет защитный эффект и способно активировать иммунную систему организма, формируя адаптивный ответ [3, 13, 14].

На основании литературных данных исследуемые нами показатели можно разделить на две группы: гены и их регуляторы (некодирующие РНК), несущие функцию онкогенов (активирующих рост опухолей), к которым относятся гены NFkB(p50), NFkB(p65), TNFa, G-CSF, Cyclin E2, IAP1, IAP2, IkBa, iNOS, TAL1, CTCF, днРНК MALAT1, NEAT1 и miR-21, а также онкосупрессоров (подавляющих рост опухоли), среди которых гены P53, PTEN, p38α, днРНК PINT, DINO и lncp21.

В данном исследовании была проанализирована активность онкогенов и онкосупрессоров в различных органах мышей в динамике на 14-й и 22-й день после трансплантации мышам опухолевых клеток.

Акцент был сделан на изменении экспрессии генов P53 и NFkB после второго и четвертого облучений (табл. 2).

В табл. 3 приведен анализ изменения активности онкогенов и онкосупрессоров в группе “Опухоль + облучение” по отношению к группе “Опухоль”, выраженных в долях медианы (принятой за единицу) в опухолевой ткани, костном мозге и тимусе мышей после четырех облучений (на 22-е сутки).

После этого нами были проанализированы процентные соотношения активированных онкогенов и онкосупрессоров в нормальных и опухолевых тканях.

На рис. 5 показано, что в опухолевых клетках количество активированных онкосупрессоров составляло 33.3% (активируется два из шести исследуемых онкосупрессоров), в то время как процент активированных онкогенов составляет 64.3% (девять из 14 показателей). В костном мозге отмечается активность 75% супрессоров (повышенная экспрессия генов P53, PTEN и днРНК PINT и DINO). Кроме того, в этой же группе активировался только онкоген (TAL1), что составляет 7% от числа исследуемых онкогенов. В тимусе была обнаружена инициация активности всех онкосупрессоров (100%) и лишь шести онкогенов (42%). Для селезенки характерна активация 50% онкосупрессоров и 21% онкогенов (рис. 5).

Рис. 5.

Процент активированных онкогенов и онкосупрессоров в различных органах мышей в ответ на действие МДР.

Fig. 5. The percentage of activated oncogenes and suppressors in various organs of mice in response to low-doses radiation.

Особое внимание было уделено анализу экспрессии показателей в трансплантированных опухолях. Наиболее значимыми оказались изменения экспрессии онкогенов CTCF и днРНК MALAT1. Показано подавление активности гена CTCF и днРНК MALAT1 в 4166 и 1.15 раза соответственно (рис. 6, а).

Рис. 6.

Относительная активность онкогенов и онкосупрессоров в опухолевых тканях инокулированных мышей после четырех фракционированных облучений. * Статистически значимые изменения (p < 0.05) по критерию Манна–Уитни. Медиана группы “опухолей” принята за единицу.

Fig. 6. Comparative activity of oncogenes and suppressors in mice’ tumor tissues after 4 fractionated irradiations. * Statistically significant statistical changes (p < 0.05) according to the Mann–Whitney U-test, the median of the group of “tumors” is taken as one.

Однако в тимусе экспрессия днРНК MALAT1 четко отличалась от экспрессии в костном мозге: повышалась в 3.04 раза в группе “Опухоль + облучение”, что говорит о чувствительности этого показателя к действию МДР. В селезенке также отмечалось увеличение роста экспрессии днРНК MALAT1 (в 1.19 раза) (рис. 7).

Рис. 7.

Относительная активность онкогенов в костном мозге, селезенке и тимусе в группах “Опухоль + облучение” и “опухоль” инокулированных мышей после четырех фракционированных облучений. * Статистически значимые изменения (p < 0.05) по критерию Манна–Уитни; # статистически значимые изменения (p < 0.1) по критерию Манна–Уитни. Относительная экспрессия в группах “Опухоль + облучение” и “опухоль” соотносится к медиане группы “биоконтроль”, принятой за единицу.

Fig. 7. Comparative activity of oncogenes in bone marrow, spleen, and thymus in the “Tumor + irradiation” and “tumor” groups of mice after 4 fractionated irradiations. * Statistically significant statistical changes (p < 0.05) according to the Mann–Whitney U-test; # statistically significant changes (p < 0.1) according to the Mann–Whitney U-test. The relative expression in the “Tumor + radiation” and “tumor” groups corresponds to the median of the “Control” group, taken as one.

Было показано, что изменения экспрессии гена CTCF в нормальных органах коррелировали с изменениями в опухолях. В частности, подавление активности этого гена отмечается в селезенке и тимусе – в 1.45 и 25 раз соответственно (p < < 0.05), в отличие от костного мозга, где его активность выросла в 1.11 раза по сравнению с “Биоконтролем” (рис. 7).

На рис. 8 продемонстрированы изменения экспрессии гена P53 и днРНК PINT в различных органах. Аналогичные изменения с клетками опухоли отмечались и в костном мозге у гена Р53, активность которого увеличивалась одинаково в группах “Опухоль + облучение” и “Опухоль” в 1.23 раза по сравнению с “Биоконтролем”. Однако для днРНК PINT, также являющейся онкосупрессором, не отмечалось соответствующих опухоли изменений.

Рис. 8.

Относительная активность онкосупрессоров в костном мозге, селезенке и тимусе в группах “Опухоль+облучение” и “опухоль” инокулированных мышей после четырех фракционированных облучений. * Статистически значимые изменения (p < 0.05) по критерию Манна–Уитни. Относительная экспрессия в группах “Опухоль + облучение” и “опухоль” соотносится к медиане группы “биоконтроль”, принятой за единицу.

Fig. 8. Comparative activity of suppressors in the bone marrow, spleen, and thymus in the “Tumor + irradiation” and “tumor” groups of mice after 4 fractionated irradiations. * Statistically significant statistical changes (p < 0.05) according to the Mann–Whitney U-test. The relative expression in the “Tumor + radiation” and “tumor” groups corresponds to the median of the “Control” group, taken as one.

В частности, экспрессия днРНК PINT изменялась противоположным образом – и уменьшалась в 1.56 раза в клетках костного мозга. Аналогичное ингибирование активности этой днРНК наблюдалось и в других органах иммунной защиты – селезенке и тимусе: в 1.27 и 1.92 раза соответственно. В ряде работ также показана роль днРНК PINT как супрессора опухолей [15, 16].

На рис. 7 и 8 отмечены выраженные изменения экспрессии ряда показателей в клетках селезенки и тимуса. В частности, статистически значимо отличалась активность онкосупрессоров гена PTEN и днРНК DINO, а также онкогенов TAL1, Cyclin E2 и микроРНК miR-21 в группах “Опухоль+облучение” и “Опухоль” по сравнению с “Биоконтролем”, хотя соответствующих изменений не наблюдалось в опухолевых тканях. Это может быть связано с ответом клеток на облучение и активацию сигнальных путей при воздействии МДР, а также стимуляцией репарационных процессов.

На рис. 6, б показано, что в опухолевых тканях отмечалась только тенденция к снижению активности гена PTEN (p < 0.1), в то же время в селезенке (рис. 8) фиксируется статистически значимое подавление экспрессии гена PTEN в 1.37 раза в группе “Опухоль+облучение” (p < 0.05).

Интересно, что аналогичная динамика характерна для днРНК DINO: тогда как в опухоли (рис. 6, б) практически не отмечалось понижения экспрессии этой днРНК (изменение в 1.078 раза), в селезенке и тимусе наблюдалось значительное ингибирование ее активности – 1.37 и 2.13 раза (p < 0.05) (рис. 8). По данным [17], активность днРНК DINO в клетках при различных типах рака также подавляется.

Также показано ингибирование активности гена CCNDE2 в селезенке и тимусе, которая ниже в 1.79 и 2.38 раза соответственно, в группе “Опухоль” по отношению к группе “Биоконтроль”, а также снижение активности этого гена в 4 раза в тимусе в группе “Опухоль” по сравнению с группой “Опухоль + облучение” (рис. 7).

Нами продемонстрировано, что онкоген TAL1, экспрессия которого, как можно было предполагать, должна возрастать, показал себя абсолютно противоположным образом (рис. 7). И в селезенке, и в тимусе в группах “Опухоль” его активность снижалась в 1.37 и 2.04 раза соответственно (p < < 0.05).

Отмечено увеличение активности гена NFkB(р50) в клетках костного мозга и тимуса в 1.19 (p < 0.05) и 2.14 раза (p > 0.05), что подтверждает гипотезу о взаимодействии генов TAL1 и NFkB. Кроме того, показана значительная роль микроРНК miR-21, активность которой значительно подавлена в селезенке и тимусе в 1.37 (группа “Опухоль + облучение”) и 2.13 раза (группа “Опухоль”) соответственно (рис. 7).