Радиационная биология. Радиоэкология, 2022, T. 62, № 1, стр. 5-17

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Материалом для цитогенетических исследований служила кровь, взятая из кубитальной (срединной локтевой) вены в различные сроки после радиационного воздействия у пациента Г.О.И. (1960 г. р., УКН 1047), пострадавшего при ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС в 1986 г. Он был оператором центрального зала блока № 4 и в момент аварии находился в подсобном помещении за тонкой перегородкой в 20 м от реактора. Через 20 мин после того, как помещение заполнилось паром, он покинул разрушенный блок. Через 1 ч после аварии возникли слабость, головная боль, тошнота и рвота, продолжавшаяся в течение 2 сут. Жидкий стул был в течение первых суток. По данным цитогенетического исследования культуры лимфоцитов периферической крови средняя доза облучения на все тело по частоте дицентриков составила 3.2 Гр. Доза на щитовидную железу равнялась 11.28 Зв. После проведенного лечения в специализированной клинике пациенту был поставлен следующий диагноз: ОЛБ III степени тяжести от преимущественно внешнего относительно равномерного γ-β-облучения, аппликации и инкорпорации радионуклидов (¹³¹I – 65 МБк), костномозговой синдром II степени, орофарингеальный синдром II степени, местные лучевые поражения I, II и III степеней тяжести с поражением 8, 20 и 5% поверхности кожных покровов соответственно (грудь, предплечья, живот, правое бедро и обе ноги); острый гипотиреоз (по лабораторным данным). В отдаленный период после радиационного воздействия пациент подвергался многократным клиническим обследованиям, во время которых и производился забор крови для цитогенетических анализов.

Материал для данного исследования был получен в общем временном промежутке 9053–12 554 дней (24.8–34.4 года) после радиационного воздействия.

Постановку в стерильных условиях культур лимфоцитов периферической крови производили по следующей методике. После самопроизвольного осаждения эритроцитов лейкоцитарную пленку с частью плазмы (общий объем 1 мл) добавляли к 9 мл среды RPMI 1640 с GlutaMAX^TM-I (“Thermo Fisher Scientific”, США), содержащую также фитогемагглютинин в конечной концентрации 20 мкг/мл (ФГА-П, “ПанЭко”, Россия) и антибиотики стрептомицин и пенициллин (растворены предварительно в среде). Культивирование производили в стерильных культуральных флаконах 25 см² (“NUNC”) в вертикальном положении. Для того, чтобы избежать появления в культурах существенного числа метафаз во втором митозе, время инкубации в термостате при 37°С составило 48 ч. За 2–2.5 ч до его окончания в культуральную среду добавляли колхицин (0.5 мкг/мл) для остановки протекания митозов в стадии метафазы.

Препараты хромосом готовили принятым в лаборатории стандартным способом [16].

Для выполнения FISH-окрашивания хромосом использовали готовые наборы цельнохромосомных ДНК-зондов фирмы “MetaSystems” (Германия). Однако в разные сроки после радиационного воздействия они могли быть различными: одноцветные ДНК-зонды для 1, 4 и 12 пар хромосом (1 раз), трехцветные ДНК-зонды для 1, 4 и 12 пар хромосом (5 раз), параллельно два набора трехцветных ДНК-зондов к {1, 4, 12} и {2, 3, 8} парам хромосом (5 раз). Контркрасителем служила флуоресцентная краска DAPI.

Отметим, что суммарно в этих наборах хромосом относительное содержание ДНК почти совпадает: в соответствии с данными, приведенными в рекомендациях [1], доля ДНК в них по отношению к мужскому диплоидному набору хромосом равняется 0.1917 и 0.1966 соответственно.

При обработке и окраске препаратов хромосом руководствовались фирменными инструкциями, прилагаемыми к наборам.

Для автоматического поиска метафаз на разных препаратах и осуществления собственно цитогенетического исследования пользовались системой “Метафер 4” (фирма “MetaSystems”, Германия). Критериями отбора метафаз для анализа служили наличие в них квазидиплоидного числа хромосом (40–46) и полный набор всех FISH-окрашенных хромосом с учетом всей их суммарной длины. Это согласуется с данными работы [11], показавшей, что при учете метафаз только с 46 центромерами частота транслокаций была сравнима с их уровнем при анализе метафаз с 38–46 центромерами. В соответствии с таким подходом метафазы, содержавшие делеции по FISH-окрашенным хромосомам, не вошли в итоговые результаты анализа, которые содержали только перестройки хромосомного типа, в продукции которых участвовали FISH-окрашенные участки или целые хромосомы (все транслокации, инсерции, инверсии, дицентрики, центрические кольца, ацентрики).

Перевод наблюдаемых частот транслокаций в геномные частоты с целью возможности их сравнения осуществляли с помощью соответствующих уравнений для одноцветного и трехцветного методов [1]. Уточним, что геномная частота в данном случае связана с геном-эквивалентной экстраполяцией.

При проведении цитогенетического анализа учитывали нахождение аберраций хромосом в стабильных и нестабильных клетках. К цитогенетически стабильным клеткам относили неаберрантные метафазы и метафазы, содержавшие только стабильные перестройки хромосом – реципрокные транслокации, перицентрические инверсии, инсерции (вставки), контрокрашенные атипичные хромосомы. В нестабильных клетках могли находиться только нестабильные аберрации хромосом – FISH-окрашенные и контрокрашенные дицентрики, центрические и ацентрические кольца, парные фрагменты – или они же в сочетании со стабильными перестройками. Таким образом, при определении стабильности клеток учитывали не только аберрации по FISH-регистрируемым, но и по видимым контрокрашенным хромосомам. При этом, если не удавалось произвести точную идентификацию любых контр-окрашенных перестроек, то такие клетки считались стабильными при отсутствии или стабильности FISH-окрашенных аберраций.

Для статистической обработки полученных результатов (сравнение средних и регрессионный анализ) использовали пакет программ Statistica 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В табл. 1 представлены результаты цитогенетического анализа культур лимфоцитов периферической крови пациента Г.О.И. в отдаленные сроки после радиационного воздействия. В ней показаны как реально обнаруженные частоты аберраций хромосом, так и геномные частоты транслокаций, рассчитанные в зависимости от использованного набора ДНК-зондов по соответствующим формулам [1]. Следует обратить внимание на то, что наблюдались метафазные клетки с обменом дистальными участками между тремя хромосомами как бы “по кругу”, т.е. происходили три разрыва в трех хромосомах, а затем возникали двухцветные структуры следующего вида: FISH-окрашенный “краской 1” центромерный участок + контрокрашенный бесцентромерный участок, FISH-окрашенный “краской 2” центромерный участок + FISH-окрашенный “краской 1” бесцентромерный участок, контр-окрашенный центромерный участок + FISH-окрашенный “краской 2” бесцентромерный участок. Обнаружение таких структур возможно только при трехцветном (мультицветном) FISH-окрашивании хромосом. Как известно, при одной простой транслокации происходит два разрыва в двух хромосомах, при двух независимых транслокациях – четыре разрыва в четырех хромосомах. Для итоговой количественной оценки описываемого обмена участками между тремя хромосомами, по-видимому, следует считать, что, как это и не парадоксально, произошло 1.5 транслокации, что и отразилось на данных, представленных в табл. 1. С позиций действующего определения сложных (комплексных) перестроек хромосом, заключающегося в превышении хотя бы на единицу числа разрывов над числом вовлеченных в процесс хромосом [1], данный феномен не относится к указанному типу аберраций, хотя стандартные инсерция или инверсия формально уже являются сложными перестройками. Вероятно, надо более подробно рассмотреть вопрос о значении дефиниций “простые” и “сложные” аберраций.

Основную массу обнаруженных аберраций хромосом составили реципрокные транслокации, количество которых варьировало от 90.4 до 98.4% от общего числа всех зарегистрированных FISH-окрашенных перестроек. Доля нестабильных аберраций колебалась от 0 до 7.6%. Частота транслокаций на геном при анализе всех клеток была значимо в 42–67 раз выше (p < 0.01), чем для соответствующего возрастного контроля, приведенного в работе [16].

В результате осуществления цитогенетического анализа с помощью трехцветного FISH-метода были выделены, насколько это возможно при данной окраске хромосом, два клона лимфоцитарных клеток с определенными транслокациями, которые были обозначены как t (4; 8) и t (1; 3). Первая транслокация при использовании одноцветных и трехцветных ДНК-зондов для 1, 4 и 12 пар хромосом выглядит как транслокация (4; ?), а при использовании трехцветных ДНК-зондов для 2, 3 и 8 пар хромосом выглядит как транслокация (?; 8). Соответственно вторая транслокация при применении одноцветных и трехцветных ДНК-зондов для 1, 4 и 12 пар хромосом выглядит как транслокация (1; ?), а при использовании трехцветных ДНК-зондов для 2, 3 и 8 пар хромосом выглядит как транслокация (?; 3). В табл. 2 приведены частоты этих клоновых транслокаций. В дальнейшем расчеты общих частот транслокаций были выполнены без коррекции и с коррекцией на этот феномен. Коррекция на наличие клонов заключалась в представлении каждого из них в виде одной клетки с соответствующим вычитанием остального клона из общего числа транслокаций и клеток.

В наиболее раннем в данном исследовании сроке взятия крови через 9053 дня (24.8 года) после аварии использовали одноцветные ДНК-пробы для 1, 4 и 12 пар хромосом. При последующих заборах материала (в общей сложности 10 раз) при окрашивании применяли трехцветные ДНК-зонды только для 1, 4 и 12 пар хромосом (5 сроков) или параллельно для {1, 4, 12} и {2, 3, 8} пар хромосом (другие 5 сроков). Сравнение геномных частот транслокаций для разных наборов ДНК-зондов с помощью критерия знаков для связанных выборок продемонстрировало отсутствие различий между ними при анализе как всех, так и только стабильных клеток без и с коррекцией на наличие клонов (р = 0.371).

Частоты наблюдаемых транслокаций во всех и стабильных клетках без и с коррекцией на наличие клонов также существенно не отличались друг от друга (критерий знаков для связанных выборок: р = 0.453 и 0.423 соответственно).

Изучение зависимости частоты транслокаций от времени после облучения было осуществлено с помощью получения соответствующей линейной регрессии для геномных частот, определенных на основе пересчета наблюдаемых частот этих аберраций при использовании одноцветного и трехцветного ДНК-зондов для 1, 4 и 12 пар хромосом. Коэффициенты корреляции составили 0.388 и 0.417 при уровнях значимости р = 0.239 и 0.231 соответственно для данных без и с коррекцией на наличие клоновых транслокаций, что демонстрирует отсутствие статистически существенной зависимости уровня транслокаций от срока взятия крови в период от 24.8 до 34.4 года после облучения пациента. Соответствующий график для транслокаций без коррекции представлен на рис. 1.

Для ретроспективной оценки дозы у пациента Г.О.И. были использованы фактические данные, полученные в работе [16]. В ней были построены кривые доза–эффект для радиационно-индуцированных транслокаций в лимфоцитах периферической крови после γ-облучения крови здоровых доноров in vitro в дозах от 0.1 до 3 Гр. Для учета перестроек хромосом использовали трехцветное FISH-окрашивание с помощью ДНК-зондов к {1, 4, 12} или {2, 3, 8} парам хромосом раздельно. При этом, как было установлено, вид набора ДНК-зондов не влиял на выявленные частоты транслокаций. Так как в указанной статье [16] были приведены калибровочные кривые для наблюдаемых уровней транслокаций, то применительно к настоящему исследованию после вычитания из зарегистрированных частот контрольных величин был осуществлен пересчет в соответствии с известными формулами [1] для получения радиационно-индуцированных геномных частот. Регрессионный анализ по методу наименьших квадратов позволил установить следующие линейно-квадратичные дозовые зависимости для уровней транслокаций при цитогенетическом исследовании всех (1) и только стабильных (2) клеток соответственно:

где Y – геномная частота транслокаций на 100 клеток, С – постоянный коэффициент, равный фоновой средней геномной частоте транслокаций с учетом возраста обследуемого лица, D – доза, Гр. Коэффициент С для пациента Г.О.И. брался из статьи [17]: для возрастов 50–59 и 60–69 лет он составлял 0.00732 и 0.01008 соответственно. Действительно, в настоящее время сведения о фоновых уровнях транслокаций при использовании трехцветного FISH-окрашивания очень ограничены и по ним сложно составить суждение о наличии или отсутствии их зависимости от возраста обследуемых людей. Однако, исходя из установленных в разных работах (например, [17]) возрастных зависимостей фоновых частот транслокаций при использовании одноцветного FISH-метода, можно первоначально использовать эти данные и в случае применения трехцветного FISH-метода хромосом, так как в контрольной популяции и в диапазоне малых доз вероятность появления транслокаций между FISH-окрашенными хромосомами должна быть очень низка.

Рассчитанные величины доз при анализе всех и только стабильных клеток без и с проведением коррекции на наличие клонов представлены в табл. 3. Хотя в каждый срок забора материала различия между дозами, оцененными при исследовании всех и только стабильных клеток без коррекции на клоны, не были большими и колебались от 6.9 до 9.8%, составляя в среднем 2.16 ± 0.04 и 2.34 ± 0.04, однако дозы, определенные по уравнению (2), были регулярно выше доз, полученных с использованием уравнения (1), что привело к существенной статистической разнице между ними. Это показано с помощью критерия знаков для связанных выборок (р = 0.0002). Точно так же дело обстояло и после проведения коррекции на наличие клонов (р = 0.017). Естественно, дозы после коррекции на наличие клонов были несколько ниже, чем без такой коррекции.

Таблица 4 демонстрирует относительное участие выбранных FISH-окрашенных пар хромосом в различных транслокациях. Более подробно эти данные будут рассмотрены ниже.

ОБСУЖДЕНИЕ

При описании наблюдаемых перестроек мы исходили из традиционной терминологии, не обращаясь к специально разработанным для FISH-метода системам PAINT или S&S, что в международных методических рекомендациях считается допустимым [1]. При этом обнаруженные транслокации учитывались суммарно и не разделялись на полные/неполные (реципрокные/нереципрокные, двунаправленные/однонаправленные). В данной ситуации на самом деле речь идет о разрешающей способности FISH-метода. В одной из работ полагается, что ее граница составляет 10–50 тыс. пар оснований [18]. Правда, другие авторы [19] обосновывают существенно более высокую величину данного порога разрешения: (11.1 ± 0.8) × 10⁶ и (14.6 ± 0.6) × 10⁶ пар оснований для окрашенных и неокрашенных участков хромосом соответственно. В то же время, как отмечено в [20], длина теломер в хромосомах человека составляет 5–15 тыс. пар оснований, а они идентифицируются с помощью FISH-метода, хотя в настоящее время для этого используются не ДНК-зонды, а более эффективные PNA-пробы (PNA, Peptide nucleic acid – пептидо-нуклеиновые кислоты, созданные искусственно) [21]. С помощью мечения теломер хромосом облученных лимфоцитов было продемонстрировано, что многие, якобы нереципрокные транслокации на молекулярном уровне оказываются реципрокными, и частота неполных обменов является очень низкой [22]. По данным работ [23–25], доля неполных транслокаций составляет примерно 3–5%. Таким образом, на самом деле видимая “односторонность” транслокации не обеспечивает надежную оценку неполноты или нереципрокности обмена [1]. Также отметим, что, по-видимому, без теломерных проб различные специалисты-цитогенетики могут по-разному оценивать полноту транслокаций.

Для ретроспективной оценки дозы по частотам реципрокных транслокаций, включая использование FISH-метода, изначально исходили из мнения об их постоянстве с течением времени после облучения. Однако результаты цитогенетических исследований через 8 и 10 лет после аварий в г. Гойяния (Бразилия, 1987 г.) [26] и на Чернобыльской АЭС (1986 г.) [27] показали, что в общем случае это не так. Действительно, в указанных исследованиях было продемонстрировано, что при первоначально оцененных дозах соответственно больше 1 и 2 Гр частоты всех зарегистрированных FISH-транслокаций оказывались меньше исходно выявленных частот дицентриков, хотя, предполагая равновероятную индукцию дицентриков и реципрокных транслокаций, частота последних в отдаленные сроки должна была быть равной начальной частоте дицентриков. По-видимому, такой эффект был обусловлен элиминацией как стабильных, так и нестабильных аберраций при их совместном нахождении в одних и тех же клетках.

Ранее также было проведено изучение динамики (до 25 лет после облучения) уровней FISH-зарегистрированных транслокаций у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС и сгруппированных по степени тяжести развившейся острой лучевой болезни (ОЛБ), которая зависела от величины поглощенной дозы [28]. Во всех группах, включая 1-ю степень тяжести ОЛБ, уровни транслокаций существенно превышали спонтанный уровень и в общем временном промежутке не имели явной тенденции к снижению своей частоты, за исключением случаев с ОЛБ 1-й степени. Время снижения количества транслокаций до некоторого постоянного уровня было оценено величиной 5–8 лет интенсивной элиминации нестабильных аберрантных клеток, включавших в определенной своей части и транслокации. В последующие сроки аберрантные клетки содержали главным образом аберрации стабильного типа.

В 1994 г. в Эстонии произошел радиационный инцидент с похищением из хранилища радиоактивных отходов источника γ-излучения с последующим его нахождением в частном доме [29]. Для дальнейших цитогенетических исследований у трех человек из общей группы пострадавших важно то, что имелись исходные результаты FISH-анализов [30, 31]. Оцененные средние дозы на все тело у двух пациентов составили примерно 1 Гр, а у третьего – 2.7 Гр, причем у всех имелись ожоги на руках и были обнаружены цитогенетические признаки парциального радиационного воздействия. В первые четыре года было показало снижение частот транслокаций до 70% от первоначального уровня, по мнению авторов, более медленное для полных, чем для всех транслокаций, хотя отмечается, что это различие не было статистически существенным. Продолжение исследований до семи лет после инцидента показало стабилизацию количества транслокаций, делая очевидным достижения минимального уровня в течение первых двух лет. При этом через 5, 6 и 7 лет наблюдалось очень мало дицентриков, ацентриков и сложных обменов. В конце концов был сделан вывод, что содержание транслокаций в стабильных клетках в течение первых двух лет равно этому показателю в более поздние времена. Таким образом, первоначальное снижение выхода транслокаций было вызвано в основном, если не полностью, путем элиминации нестабильных клеток, и для ретроспективной оценки дозы цитогенетический анализ необходимо проводить в стабильных клетках [31, 32]. Однако эти данные в том числе означают, что в нестабильных клетках в ближайшие сроки после облучения содержится больше реципрокных транслокаций, чем в стабильных, что довольно удивительно. Отметим, что в нашем исследовании, посвященном построению in vitro кривых доза–эффект для транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода, также наблюдалась значимо или в виде тенденции более высокая частота транслокаций во всех клетках по сравнению с только стабильными клетками при наибольших использованных дозах (2 и 3 Гр) [17].

В работе Y. Chen et al. (2009) были представлены результаты продолжительного цитогенетического обследования пяти выживших пострадавших (двое погибли) после серьезной радиационной аварии 25 июня 1990 г. в Китае (г. Шанхай) [4]. В ходе этого наблюдения были использованы три различных цитогенетических метода: 1) классический, 2) G-бэндинг и 3) FISH-окрашивание 1 пары хромосом. Первоначальная оценка дозы варьировала от 1.9 до 5.1 Гр. К сожалению (по-видимому, из-за ограниченной возможности забора материала), сроки взятия крови после аварии для разных методик были в целом не одинаковы, составляя для 1) 24 ч; 3,5; 5; 6; 9; 12; 14 и 17 лет; для 2) 5; 12; 14; 17 лет и для 3) 8; 9 и 12 лет соответственно. К 12-му году после облучения количество дицентриков и колец уменьшилось больше чем на 90%. Частота же стабильных аберраций была существенно выше, чем в контроле, и зависела от дозы. При использовании G-бэндинга уровень транслокаций был несколько больше через 5 лет, чем в последующие сроки, когда он мало изменялся. Количество FISH-регистрируемых транслокаций у четырех пациентов с течением времени несколько снижалось в разной степени, оставаясь на примерно одном уровне у пятого пострадавшего. В целом у авторов создалось впечатление, что, чем большая доза была получена, то с тем меньшей скоростью частота транслокаций снижалась со временем, что находится в противоречии с данными работ [26, 27, 31].

Как указывалось выше, этап цитогенетических исследований, представленный в настоящей статье, начался примерно через четверть века после чернобыльской аварии и продолжался около 10 лет. За этот период, как показал регрессионный анализ, частота транслокаций существенно не изменилась и колебалась в границах от 33.8 до 49.2 на 100 клеток (на геном) при использовании одноцветных и трехцветных ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом. Ранее пациент Г.О.И. попал в группу лиц, которые были обследованы в одной из германских клиник примерно через 5.5 года после радиационного воздействия [33]. В программу обследования входило и проведение цитогенетического анализа культур лимфоцитов периферической крови с помощью одноцветного FISH-окрашивания 1, 4 и 12 пар хромосом. Геномная частота всех транслокаций составила у него 26.3 на 100 клеток. Критерий для отбрасывания крайних вариант не смог продемонстрировать существенность отличия этой величины от совокупности данных, полученных в настоящей работе: τ = 0.328 при τ_0.05 = 0.428 [34]. С другой стороны, при построении линейной регрессии с учетом этой ранее полученной варианты коэффициент корреляции составил 0.645 при уровне значимости р = 0.0235. Можно ли предположить на этой основе, что все-таки имело место некоторое повышение уровня всех транслокаций через 24.8–34.4 года по сравнению с их частотой через 5.5 года после облучения? Вопрос остается открытым, так как имеется вероятность наличия межлабораторных различий при цитогенетической регистрации транслокаций, что может быть допущено из сведений работы [29].

В целом, исходя из данных литературы и настоящего исследования, ситуация выглядит таким образом, что в первые годы после облучения (2–8 лет) в процессе элиминации огромного большинства нестабильных клеток частота транслокаций снижается до какого-то зависимого от дозы уровня, который затем почти не изменяется. При этом после облучения в дозах 1 Гр и ниже уровень транслокаций практически не изменяется [35].

Необходимо еще раз подчеркнуть, что в нашем исследовании количества транслокаций во всех и стабильных клетках значимо не отличались друг от друга, а различия в дозах были обусловлены только ходом полученных ранее кривых доза–эффект, в которых имелись расхождения в частотах транслокаций только при дозах 2 и 3 Гр. При этом различия оценок доз у больного Г.О.И. в численном отношении были минимальны (до 8%). Поэтому, с нашей точки зрения, в отдаленные сроки после облучения, собственно говоря, не очень важно анализируются все клетки или только стабильные, особенно, если полученные дозы были меньше 2 Гр. Да и самих нестабильных аберраций, а соответственно, и нестабильных клеток в определенные сроки становится крайне мало.

На постоянство величины регистрируемых частот радиационно-индуцированных транслокаций могут влиять такие факторы как наличие длительно живущих фракций лимфоцитов или клоновых транслокаций в линиях клеток, берущих начало от соответствующих стволовых клеток [35]. Как считает J.D. Tucker (2008), может быть два подхода к вопросу о клетках с клональными аберрациями: их учет с признанием, что имеет место единичное событие, т.е. одна клетка, или игнорирование этого обстоятельства, признавая каждую транслокацию как независимое событие [36]. В подтверждение последней точки зрения приводится то рассуждение, что, собственно говоря, все лимфоциты, в том числе и нормальные, имеют клональную природу. Задавшись вопросом, какую же стратегию выбрать, автор предлагает при индивидуальных оценках учитывать наличие аномальных клонов, а при популяционном оценивании доз не делать этого. Учитывая данные, полученные в настоящей статье, по-видимому, будет достаточно допустимо не приводить коррекцию на наличие клонов даже при ретроспективных оценках доз у отдельных пострадавших. Разумеется, это относится только к случаям без образования многоклеточных злокачественных клонов. В целом ретроспективные оценки дозы у пациента Г.О.И. были в среднем примерно на 30% ниже, чем первоначальная оценка по частоте дицентриков.

Как уже указывалось, в табл. 4 показаны количественные данные об участии различных FISH-окрашенных хромосом в их транслокациях с контрокрашенными хромосомами, а также общее число транслокаций между FISH-окрашенными хромосомами. Без и с коррекцией на наличие клонов для набора ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом по частоте образования транслокаций с контрокрашенными хромосомами FISH-окрашенные хромосомы располагались в следующем порядке: 1 > 4 > 12 (p < 0.0001). Для набора ДНК-зондов к 2, 3 и 8 парам хромосом без указанной коррекции существенных различий между этими хромосомами не наблюдалось (p = 0.125–0.671), несмотря на установленную разницу относительного содержания ДНК в них. После коррекции по степени участия в этих транслокациях наблюдалось следующее расположение рассматриваемых хромосом: 2 > 8 (p < 0.0001) и 3 > 8 (р = 0.023). Различие между парами хромосом 2 и 3 было незначимым (р = 0.108). Интересно, что последний факт наблюдался и в статье [16].

Также по методу, описанному в работе [34], было осуществлено сравнение между эмпирическими и расчетными частотами участия отдельных FISH-окрашенных пар хромосом в транслокациях, исходя из табличных величин относительного содержания в них ДНК [1]. Были получены противоречивые результаты. Так, при использовании набора ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом без коррекции на наличие клонов доля транслокаций с участием хромосомы 1 соответствовала ее относительной длине, тогда как для хромосом 4 и 12 этот показатель был значимо (при р < 0.05) соответственно выше и ниже расчетных значений. После коррекции на наличие клонов для хромосомы 1 участие в транслокациях было выше ожидаемого, а для хромосом 4 и 12 – ниже ожидаемого. При применении набора ДНК-зондов к 2, 3 и 8 парам хромосом без коррекции на наличие клонов транслокаций с 2 и 8 хромосомами было соответственно меньше и больше предполагаемой частоты, а для хромосомы 3 их количество не отличалось от теоретических ожиданий (при р < 0.05). После проведения коррекции для всех хромосом данного набора различия по ожидаемому количеству транслокаций с контрокрашенными хромосомами отсутствовали. По-видимому, такое расхождение результатов, полученных с использованием разных наборов ДНК-зондов, обусловлено наличием нераспознанного(ых) клона(ов) с участием 1 хромосомы. Возрастание доли транслокаций с участием этой хромосомы автоматически приводит к снижению вклада других хромосом из используемого набора ДНК-зондов. В основе данной точки зрения лежит представление о прямо пропорциональной зависимости величины вероятности индукции двойных разрывов ДНК ее относительному содержанию в отдельных парах хромосом [1], хотя ряд авторов не согласны с этим положением [37–39]. В статье [16] после γ-облучения крови здоровых доноров in vitro и трехцветного FISH-окрашивания с помощью тех же, как и в данной работе, наборов ДНК-зондов существенные различия между эмпирическими и расчетными вкладами отдельных пар хромосом в образование радиационно-индуцированных транслокаций не наблюдались. Таким образом, если производится оценка сравнительного участия разных хромосом в реципрокных транслокациях, то, в отличие от ретроспективной оценки дозы, осуществление коррекции на наличие клональных перестроек становится обязательным. Отклонения же частот участия в транслокациях отдельных хромосом от ожидаемых величин, исходя из содержания в них ДНК, по-видимому, может свидетельствовать о нераспознанных клонах клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в настоящей статье с помощью трехцветного FISH-окрашивания было проведено цитогенетическое исследование культур лимфоцитов периферической крови пациента, подвергшегося радиационному воздействию в дозе 3.2 Гр (оценка по частоте дицентриков) при аварии на Чернобыльской АЭС. Общая длительность данного наблюдения составила приблизительно 10 лет, начиная с около 25 лет после облучения. В различные сроки были применены разные наборы ДНК-зондов. Геномные частоты транслокаций не зависели от выбранного набора и были примерно одинаковы на протяжении всего периода исследования. Для ретроспективного определения дозы использовали калибровочные кривые для частот радиационно-индуцированных транслокаций, полученные ранее в экспериментах с облучением крови здоровых доноров in vitro. В целом средняя величина этой оценки составила приблизительно 2.2 Гр, демонстрируя частичное снижение исходной частоты транслокаций, по-видимому, вследствие элиминации нестабильных клеток, в которых стабильные и нестабильные аберрации хромосом находились вместе.

Хотя ретроспективная оценка дозы была более высокая при анализе только стабильных клеток, однако в чисто численном плане разница с результатами, полученными при анализе всех клеток, была очень небольшой. Поэтому, по-видимому, с практической точки зрения проблема, какие клетки учитывать, является не очень важной. Гораздо более критическим является знание того, какой должна быть величина необходимой коррекции при ретроспективных оценках исходно различных доз, больших 1 Гр, если такая необходимость возникнет.

Относительно наличия клонов клеток с транслокациями хромосом складывается впечатление, что при клинической относительной норме значение этого фактора для ретроспективной оценки дозы также сильно преувеличено. Да, их учет приводит к уменьшению величины оценки дозы, но при дозах больше 1 Гр она уже снижена, а при меньших дозах вероятность появления клона, скорее всего, невелика. Если же клон приобретет черты злокачественности, то при ретроспективной оценке дозы данное обстоятельство придется учитывать. Правда, при этом возникнут совершенно другие медицинские проблемы, на которые будет обращено основное внимание.