1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Радиационная биология. Радиоэкология
  4. T. 61, № 5, 2021

Радиационная биология. Радиоэкология, 2021, T. 61, № 5, стр. 451-459

Матрица хитозана как фотомодулятор для бромелина

С. М. Панкова 1, 2, М. Г. Холявка 1, 3, *, М. С. Кондратьев 4, Ю. М. Вышкворкина 5, А. Н. Лукин 1, В. Г. Артюхов 1

1 Воронежский государственный университет
Воронеж, Россия

2 Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко
Воронеж, Россия

3 Севастопольский государственный университет
Севастополь, Россия

4 Институт биофизики клетки РАН
Пущино, Россия

5 Московский физико-технический институт
Москва, Россия

* E-mail: holyavka@rambler.ru

Поступила в редакцию 02.05.2021
После доработки 26.06.2021
Принята к публикации 30.06.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Показано, что при воздействии УФ-излучения в дозе 151 Дж/м2 активность свободного бромелина (КФ 3.4.22.4) увеличивается на 86%, при использовании дозы 6040 Дж/м2 зарегистрировано снижение каталитической способности на 15%. Изменений размера (радиуса) молекулы энзима не наблюдается в диапазоне доз 151–6040 Дж/м2. После адсорбции бромелина на матрице высокомолекулярного (350 кДа) хитозана активность ферментного препарата, облученного во всем диапазоне используемых нами доз, сохранялась в пределах 97%, после иммобилизации на среднемолекулярном (200 кДа) хитозане – до 89%. Анализ ИК-спектров иммобилизованного бромелина показал, что в характеристических полосах амид I, амид II, амид III не происходит существенных изменений, следовательно, можно констатировать, что матрица хитозана выступает в качестве фотомодулятора для адсорбированного на ней фермента.

Ключевые слова: ИК-спектроскопия, бромелин, хитозан, адсорбционная иммобилизация, УФ-облучение

Высокий бактерицидный эффект коротковолнового УФ-излучения (100–280 нм) открывает широкие перспективы использования его в медицине и фармакологии. Особый интерес представляет изучение механизмов фототерапии для лечения и профилактики кожных заболеваний. Бактерицидный эффект УФ-излучения обусловлен его влиянием на процессы жизнедеятельности клетки. Эритемные дозы УФ-света с длиной волны 250–320 нм стимулируют рост ангиобластов, активизируют образование соединительной ткани, ускоряют процессы эпителизации кожи, что имеет важное практическое значение при лечении медленно заживающих ран и язв. Бактерицидное воздействие ультрафиолета гарантирует создание надежного антимикробного барьера для бактериальных патогенов. Помимо воздействия УФ-облучения в качестве защитного агента в отношении патогенных микроорганизмов могут выступать протеазы [1–4].

Протеолитические ферменты – это группа молекул энзимов, основная функция которых – расщепление пептидных связей, приводящее к деградации поврежденных, неправильно свернутых и потенциально вредных протеинов и, следовательно, обеспечению клетки аминокислотами, необходимыми для синтеза новых белков. Протеазы играют важную роль в качестве сигнальных молекул и участвуют во множестве ферментных каскадов для поддержания жизненно важных процессов в организме [5–7]. Энзимы растений не являются исключением, более того, они обладают уникальными свойствами, такими как высокая стабильность и субстратная специфичность, широкий диапазон pH для проявления каталитической активности. В связи с этим цистеиновые протеазы, в том числе бромелин, являются широко применяемыми в медицине и фармакологии [8–10].

Бромелин (КФ 3.4.22.4) – это сульфгидрильная растительная протеаза, обнаруженная у представителей семейства Bromeliaceae. Наиболее высокую каталитическую активность фермент проявляет при рН 6–8, изоэлектрическая точка составляет 9.5 единиц рН. Температурный оптимум – 62°C [11–14]. В медицинских целях бромелин применяют для подавления процессов агрегации тромбоцитов, увеличения абсорбции антибиотиков. A. Friesen и соавт. (1987) в своих исследованиях подтвердили способность энзима повышать проницаемость тканей для антибиотиков группы пенициллинов и тетрациклинов [15, 16]. Бромелин также используется как противоопухолевое средство, модулятор иммунитета, помогает процессам пищеварения, способствует заживлению ран и улучшает кровообращение [17, 18].

Основным недостатком растворимой формы ферментов является их быстрая инактивация при действии различных факторов окружающей среды, одним из которых является продолжительное воздействие УФ-излучения. Современные методы модификации энзимов, например, адсорбционная иммобилизация на полимерных носителях, позволяют увеличить их стабильность к воздействию различных химических реагентов, физических факторов и предоставляют возможность многократного использования биокатализатора [19, 20]. В этой связи целью нашей работы стало выявление особенностей воздействия УФ-излучения на процессы фотомодуляции свободного и иммобилизованного на матрице хитозана бромелина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования был выбран бромелин фирмы “Sigma” (США), субстратом для гидролиза служил бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы “Sigma” (США), носителями для иммобилизации – два вида хитозана, синтезированных ЗАО “Биопрогресс” (Россия): хитозан пищевой кислоторастворимый среднемолекулярный (Мr = 200 кДа), степень деацетилирования (СД) – 82%, хитозан кислоторастворимый высокомолекулярный (Мr = 350 кДа, СД = 94.85%). Иммобилизацию бромелина на матрице хитозанов осуществляли адсорбционным методом. К 1 г носителя добавляли 20 мл раствора фермента в концентрации 1 мг/мл в 0.05 моль/л трис-глициновом буфере (рН 8.5) для высокомолекулярного хитозана и в 0.05 моль/л трис-глициновом буфере (рН 9.0) для среднемолекулярного хитозана, инкубировали в течение 4 ч с периодическим перемешиванием при температуре 25°С. Полученную смесь центрифугировали 10 мин при 1500 g, осадок промывали 0.05 моль/л трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия бромелина в промывных водах, контроль за содержанием белка осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при 280 нм [21, 22].

Определение количества белка проводили модифицированным методом Лоури. Сущность модификации заключалась в том, что на первом этапе анализа осуществляли разрушение связей и взаимодействий между матрицей носителя и молекулой фермента. Для этого обрабатывали иммобилизованный препарат раствором K,Na-тартрата, приготовленным на 1 моль/л NaOH при 50°С в течение 10 мин [23].

Для определения протеолитической активности бромелина в качестве субстрата использовали бычий сывороточный альбумин (66.4 кДа) в концентрации 10–5 моль/л, растворенный в 0.05 моль/л трис-HCl буфере (рН 7.5), гидролиз субстрата осуществляли в течение 30 мин при 37°С. Далее пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 11 700 g для удаления иммобилизованного бромелина. О протеолитической активности образцов судили по разности концентрации альбумина в растворе до начала реакции гидролиза и в надосадочной жидкости после протекания реакции. За единицу активности свободного и иммобилизованного бромелина принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкмоль бычьего сывороточного альбумина за 1 мин. Для определения каталитической активности образцов мы также применяли метод Лоури, но с другой модификацией – без добавления в реакционную среду сульфата меди [24]. Ранее в процессе сравнения ряда методик определения количества белка в растворе мы установили, что наименьший вклад в окрашивание реакционной среды матрица хитозана вносит при использовании модифицированного метода Лоури (без добавления сульфата меди). Кроме того, данный метод незначительно “реагирует” на отдельные аминокислоты, в частности изолейцин, а его применение позволяет минимизировать вклад в ход реакции молекул самого хитозана, а также процессов связывания бычьего сывороточного альбумина с матрицей хитозана и реакции автолиза бромелина [23].

Процесс УФ-облучения бромелина происходил при непрерывном перемешивании раствора свободного энзима или суспензии иммобилизованного фермента в объеме 4 мл (толщина слоя в середине кюветы – 7 мм) магнитной мешалкой в круглодонной термостатируемой кювете (20 ± 1°С) с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240–390 нм в течение 1, 3, 5, 10, 20, 30 или 40 мин. Доза облучения составила соответственно 151, 453, 755, 1510, 3020, 4530 и 6040 Дж/м2.

Регистрацию ИК-спектров анализируемых образцов осуществляли в Центре коллективного пользования научным оборудованием Воронежского государственного университета с помощью ИК-Фурье спектрометра Bruker Vertex-70 (Германия). Спектры снимали с неориентированных порошковых образцов. Визуализацию аминокислотных остатков – хромофоров для УФ-света – проводили в программе Maestro. Подготовку структуры фермента для докинга выполняли по стандартной для AutodockVina схеме, описанной авторами пакета на сайте: из входного файла PDB были удалены координаты атомов (и сами атомы) молекул растворителя, буфера и лигандов. Перед проведением численных расчетов была выполнена расстановка зарядов на поверхности белков c помощью MGLTools 1.5.6. Центр молекулы и параметры бокса (“ячейки”) мы задавали вручную, добиваясь того, чтобы молекула протеазы полностью была внутри расчетной области пространства. Модель структуры хитозана была нарисована в молекулярном конструкторе HyperChem, последовательно оптимизирована сначала в силовом поле AMBER, а потом квантово-химически в PM3. Лиганд в расчетах докинга имел максимальную конформационную свободу: допускалось вращение функциональных групп вокруг всех одинарных связей. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента при уровне значимости 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После УФ-облучения раствора бромелина в дозе 151 Дж/м2 наблюдалось увеличение его активности на 86% по сравнению с контрольным образцом. При действии дозы 453 Дж/м2 каталитическая способность фермента соответствовала первоначальному уровню и сохранялась в его пределах при дальнейшем УФ-облучении препарата в диапазоне доз 755–4530 Дж/м2. При использовании дозы 6040 Дж/м2 зарегистрировано снижение активности свободного бромелина на 15%.

После иммобилизации бромелина на матрице высокомолекулярного хитозана при УФ-облучении в дозе 151 Дж/м2 зафиксировано снижение активности на 2%, при использовании дозы 6040 Дж/м2 – на 3%. После иммобилизации бромелина на матрице среднемолекулярного хитозана при УФ-облучении в диапазоне доз 151–6040 Дж/м2 детектировано уменьшение его каталитической способности в пределах 11% (рис. 1). Изменение размера молекулы свободного бромелина при действии УФ-света не выявлено во всем диапазоне используемых доз (рис. 2).

Рис. 1.

Влияние УФ-света на удельную каталитическую активность (%) свободного и иммобилизованного на матрице хитозана бромелина: 1 – свободный бромелин, 2 – бромелин, иммобилизованный на среднемолекулярном хитозане, 3 – бромелин, иммобилизованный на высокомолекулярном хитозане.

Fig. 1. Influence of UV light on the specific catalytic activity (%) of free and immobilized on the chitosan matrix bromelain: 1 – free bromelain, 2 – bromelain immobilized on medium molecular weight chitosan, 3 – bromelain immobilized on high molecular weight chitosan.

Рис. 2.

Влияние УФ-света на радиус молекул бромелина.

Fig. 2. Influence of UV light on the radius of bromelain molecules.

Для более детального анализа полученных данных была произведена визуализация хромофоров УФ-излучения для молекулы бромелина (PDB ID: 1W0Q) по отношению к активному центру энзима (рис. 3). В активном центре бромелина находится His 158, в непосредственной близости к нему располагается Tyr 172, который, вероятно, будет принимать участие в фотохимических реакциях, приводящих к активации молекулы бромелина в дозе 151 Дж/м2 и к инактивации фермента при дальнейшем облучении.

Рис. 3.

Хромофоры для УФ-света в молекуле бромелина (PDB ID: 1W0Q): атомы аминокислотных остатков, входящих в их состав, обозначены шарами, активный центр фермента указан стрелками; б – повернутая на 180° вокруг горизонтальной оси форма а.

Fig. 3. Chromophores for UV light in the bromelain (PDB ID: 1W0Q): the atoms of the amino acid residues that make up their composition are indicated by balls, the active site of the enzyme is indicated by arrows; b – rotated 180° around the horizontal axis form a.

Проанализированы связи и взаимодействия между молекулой бромелина (PDB ID: 1W0Q) и матрицей хитозана, образующиеся в ходе иммобилизации фермента (рис. 4). В процессе адсорбции на носителе у бромелина задействованы Trp 180 и Phe 29. При иммобилизации фермента эти хромофоры вступают во взаимодействие с носителем и не принимают участия в фотохимических реакциях, следовательно, матрица хитозана является фотомодулятором и может экранировать УФ-свет.

Рис. 4.

Связи и взаимодействия между молекулой бромелина (PDB ID: 1W0Q) и матрицей хитозана (пунктирными линиями обозначены водородные связи).

Fig. 4. Bonds and interactions between the bromelain molecule (PDB ID: 1W0Q) and the chitosan matrix (the dotted lines indicate hydrogen bonds).

Для более глубокого анализа наблюдаемых эффектов были зарегистрированы ИК-спектры бромелина, иммобилизованного на матрице среднемолекулярного и высокомолекулярного хитозанов, до и после УФ-облучения образцов в дозах 151, 453, 755, 1510, 3020, 4530, 6040 Дж/м2.

Основные изменения на ИК-спектрах бромелина, иммобилизованного на матрице высокомолекулярного хитозана, детектированы при максимальной дозе облучения 6040 Дж/м2. В области 602–618 см–1 пропадает максимум 602 см–1 при использовании дозы 6040 Дж/м2; при облучении дозами 151–4530 Дж/м2 зафиксировано смещение полосы в области 612–618 см–1 в сторону уменьшения значений волновых чисел. Эти изменения соответствуют деформационным колебаниям С–С, С–О, С–N связей. При дозе облучения 1510 Дж/м2 в области 858–865 см–1 зафиксировано расщепление полосы на два пика – 824 и 862 см–1, свидетельствующие об асимметричных валентных колебаниях связей С–С. При дозах 1510 и 4530 Дж/м2 зарегистрированы пики 955 и 956 см–1 соответственно, они обусловлены деформационными колебаниями NH2-групп, следовательно, происходит образование водородных связей в иммобилизованном препарате. При облучении дозой 6040 Дж/м2 детектировано смещение полосы, которая ответственна за валентные колебания С–О групп, с 1060 до 1032 см–1. При увеличении дозы облучения зафиксировано смещение полосы 1321–1316 см–1 в сторону уменьшения волновых чисел, что указывает на изгибание связи N–H и появление деформационного колебания C–N связи. В полосе амид II, соответствующей деформационным колебаниям N–H и C–N связей, выявлено небольшое смещение в области 1555–1549 см–1 в сторону уменьшения волнового числа при дозе облучения 6040 Дж/м2. В области характеристической полосы амид I изменений интенсивности пиков не наблюдалось. При дозах УФ-облучения 151, 453 и 755 Дж/м2 появляются пики 1983, 1984, 1987 см–1, находящиеся в области валентных колебаний двойных связей C=O, С=С и C=N. При использовании дозы 453 Дж/м2 выявлены пики 2178 и 2223 см–1, при дозе 4530 Дж/м2 – пик 2170 см–1, они обусловлены валентным колебанием С≡N. При дозе облучения 453 Дж/м2 в полосе 2875–2878 см–1 зарегистрирован пик 2909 см–1, а при использовании дозы 755 Дж/м2 происходит его расщепление на пики 2916 и 2867 см–1, это обусловлено валентными колебаниями алифатических С–Н связей и может указывать на изменения (деструкцию) матрицы хитозана. О присутствии валентной =NH–С связи свидетельствует полоса 2875–2878 см–1. О наличии антисимметричных валентных колебаний групп N–H, участвующих в образовании водородных связей, указывает появление пика 3436 см–1 после УФ-облучения в дозе 1510 Дж/м2 (рис. 5).

Рис. 5.

ИК-спектры бромелина, иммобилизованного на матрице высокомолекулярного хитозана, до и после УФ-облучения в диапазоне доз 151–6040 Дж/м2.

Fig. 5. IR spectra of bromelain immobilized on a matrix of high molecular weight chitosan before and after UV irradiation in the dose range 151–6040 J/m2.

При иммобилизации бромелина на среднемолекулярном хитозане при использовании дозы облучения 6040 Дж/м2 в ИК-спектре появляются пики 1064, 1552 и 2051 см–1, что соответствует колебаниям гидроксильных групп, симметричным деформационным колебаниям NH$_{3}^{ + }$-группы и колебаниям –СОО– соответственно. Зарегистрировано смещение полосы 1150–1147 см–1 во всем диапазоне использованных доз, что обусловлено изменениями при участии –CH2–O–CH2-фрагментов. В полосе 1255–1261 см–1 детектировано смещение пика в сторону увеличения значений волновых чисел, что связано с деформационными колебаниями C–N связи. В области характеристической полосы амид III при дозах облучения 151 и 3020 Дж/м2 пропадают пики, следовательно, происходят изменения во вторичной структуре белка. В полосе 1377–1378 см–1 при максимальной дозе облучения наблюдается сглаживание пика. Данную полосу характеризуют деформационные колебания N–H связей. В полосе амид II при дозе облучения 755 Дж/м2 выявлено расщепление пика на 1546 и 1590 см–1, указывающее на изменения в бензольном кольце. При дозе 6040 Дж/м2 зарегистрировано смещение пика 1552 см–1, вызванное деформационными колебаниями NH$_{3}^{ + }$-группы. В области характеристической полосы амид I, ответственной за валентные колебания C=О связи в пептидной группе белков, в случае использования доз облучения 453, 3020, 6040 Дж/м2 пропадают пики, что может быть обусловлено реакциями образования/разрыва пептидной связи. На наличие карбонильных групп и валентных колебаний N–H связи в NH$_{3}^{ + }$-группе указывает присутствие полосы 2879–2875 см–1 во всем диапазоне доз. При облучении дозами 151–6040 Дж/м2 наблюдается смещение полос 3287–3257 и 3359–3352 см–1 в сторону уменьшения волновых чисел, данные полосы вызваны антисимметричными валентными колебаниями N–H группы, что свидетельствует об образовании водородной связи фермента с носителем. При использовании доз 1510, 3020 и 4530 Дж/м2 появляются новые пики 3195, 3194 и 3199 см–1, обусловленные валентными колебаниями NH$_{3}^{ + }$-групп в аминокислотах (рис. 6).

Рис. 6.

ИК-спектры бромелина, иммобилизованного на матрице среднемолекулярного хитозана, до и после УФ-облучения в диапазоне доз 151–6040 Дж/м2.

Fig. 6. IR spectra of bromelain immobilized on a matrix of medium molecular weight chitosan, before and after UV irradiation in the dose range 151–6040 J/m2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ ИК-спектров бромелина, иммобилизованного на матрице среднемолекулярного и высокомолекулярного хитозанов, до и после УФ-облучения образцов в дозах 151–6040 Дж/м2, показывает, что изменения в области характеристических полос (амид I, амид II, амид III) незначительны, поэтому можно предположить, что матрица хитозана стабилизирует структуру молекулы фермента и может выступать в качестве фотомодулятора для иммобилизованного на ней бромелина.

Наши экспериментальные данные подтверждают, что ферментативная активность свободного бромелина подвержена изменению в большей степени, чем в иммобилизованном состоянии. Анализ модели адсорбционной иммобилизации фермента показал, что связи и взаимодействия, которые могут образовываться между энзимом и матрицей хитозана, увеличивают устойчивость ферментного комплекса к действию УФ-лучей; нами показано, что при иммобилизации гетерогенного биокатализатора его каталитическая активность сохраняется до ~90% во всем диапазоне используемых доз.

Результаты проведенного исследования могут быть использованы в медицине при комплексном применении бромелина, хитозана и УФ-излучения для ускорения заживления раневой поверхности и защите от патогенных микроорганизмов, а также при подборе условий стерилизации УФ-светом лекарственных препаратов.

Список литературы

  1. Рощупкин Д.И., Артюхов В.Г. Основы фотобиофизики: Учебное пособие. Воронеж: ВГУ, 1997. 116 с. [Roshchupkin D.I., Artyuhov V.G. Osnovy fotobiofiziki: ucheb. posobie. Voronezh: VGU, 1997. 116 р. (In Russian)]

  2. Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Наквасина М.А. и др. Биофизика. М.: Академический Проект, 2009. 294 с. [Artyuhov V.G., Kovaleva T.A., Nakvasina M.A. et al. Biofizika. M.: Akademicheskij Proekt, 2009. 294 р. (In Russian)]

  3. Фрайкин Г.Я. Актуальные направления фотобиологических исследований // Альманах мировой науки. 2018. № 3 (23). С. 36–39. [Frajkin G.Ya. Aktual’nye napravleniya fotobiologicheskih issledovanij // Al’manah mirovoj nauki. 2018. № 3 (23). P. 36–39. (In Russian)]

  4. Ahmad S. Ultraviolet light in human health, diseases and environment // Adv. Experim. Med. Bio. 2017. V. 996. P. 365. https://doi.org/10.1007/978-3-319-56017-5

  5. Gurumallesh P., Alagu K., Ramakrishnan B., Muthusamy S. A systematic reconsideration on proteases // Inte. J. Biol. Macromol. 2019. V. 128. P. 254-267. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.01.081

  6. Kumari A., Kaur B., Srivastava R., Sangwan R.S. Isolation and immobilization of alkaline protease on mesoporous silica and mesoporous ZSM-5 zeolite materials for improved catalytic properties // Biochem. Biophys. Rep. 2015. V. 2. P. 108–114. https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2015.05.009

  7. Ramachandran R., Noorbakhsh F., Defea K., Hollenberg M.D. Targeting proteinase-activated receptors: Therapeutic potential and challenges // Nat. Rev. Drug Discov. 2012. V. 11. P. 69–86. https://doi.org/10.1038/nrd3615

  8. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 597–635. https://doi.org/publication/uuid/E58ABF6D-8C97-4209-810D-A452EE30B2CD.

  9. Yadav R.P., Patel A.K., Jagannadham M.V. Purification and biochemical characterization of a chymotrypsin-like serine protease from Euphorbia neriifolia Linn // Process Biochem. 2011. V. 46. P. 1654–1662. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2011.05.013

  10. Badgujar S.B., Mahajan R.T., Proteolytic enzymes of some laticiferous plants belonging to Khandesh region of Maharashtra, India // J. Pharm. Res. 2009. V. 2. № 9. P. 1434–1437. Available at: http://jpronline.info/article/view/562/482.

  11. Antão C.M., Malcata F.X. Plant serine proteases: biochemical, physiological and molecular features // Plant Physiol. Biochem. 2005. V. 43. P. 637–650. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2005.05.001

  12. Arshad Z.I.M., Amid A., Yusof F. et al. Bromelain: An overview of industrial application and purification strategies // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. V. 98. P. 7283–7297. https://doi.org/10.1007/s00253-014-5889-y

  13. Novaes L.C. et al. Stability, purification, and applications of bromelain: a review // Biotechnol. Progress. 2016. V. 32. № 1. P. 5–13. https://doi.org/10.1002/btpr.2190

  14. Sarkar S., Ahmed M., Mozumder N.H.M.R., Saeid A. Isolation and characterization of bromelain enzyme from pineapple and its utilization as anti-browning agent // Process Engineer. J. 2017. V. 1. P. 52–58. Available at: https://www.researchgate.net/publication/321034752

  15. Friesen A., Schilling A., Hofstetter A., Adam D. Tetracyclin-Konzentration im Prostata-Sekret // Z. Antimikrob. Antineoplast. Chirurgie. 1987. V. 2. P. 61–65.

  16. Maurer H. R. Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use CMLS // Cell. Mol. Life Sci. 2001. V. 58. P. 1234–1245. https://doi.org/10.1007/PL00000936

  17. Jutamongkon R., Charoenrein S. Effect of Temperature on the Stability of Fruit Bromelain from Smooth Cayenne Pineapple // Kasetsart J. (Nat. Sci.). 2010. V. 44. № 5. P. 943–948.

  18. Nathania D.S., Bratadiredja M.A. Review: isolasi dan uji stabilitas enzim bromelin dari nanas (Ananas comosus l.) // Иcтoчник! 2018. V. 16. № 1. P. 374–379. https://doi.org/10.24198/jf.v16i1.17508.g8663

  19. Березин И.В. Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987. 159 с. [Berezin I.V. Biotekhnologiya: Ucheb. Posobie dlya vuzov. V 8 kn. / Pod red. N.S. Еgorova, V.D. Samuilova. Kn. 7: Immobilizovannyefermenty. M.: Vyssh. Shkola, 1987. 159 p. (In Russian)]

  20. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. М.: Изд. центр “Академия”, 2003. 208 с. [Еgorova T.A., Klunova S.M., Zhivuhina Е.A. Osnovybiotekhnologii. M.: Izdat. centr “Akademiya”, 2003. 208 p. (In Russian)]

  21. Логинова О.О., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Физико-химические и кинетические свойства гетерогенного биокатализатора на основе трипсина, иммобилизованного на матрице хитозана // Биофарм. журн. 2015. № 2. С. 13–16. [Loginova O.O., Holyavka M.G., Artyuhov V.G. Fiziko-himicheskie i kinetiche-skie svojstva geterogennogo biokatalizatora na osnove tripsina, immobilizovannogo na matrice hitozana // Biofarmacevticheski zhurnal. 2015. № 2. P. 13–16. (In Russian)]

  22. Логинова О.О., Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Беленова А.С. Разработка методики получения гетерогенного биокатализатора на основе трипсина, иммобилизованного на матрице хитозана // Фунд. исслед. 2013. № 11 (3). С. 484–487. [Loginova O.O., Holyavka M.G., Artyuhov V.G., Belenova A.S. Razrabotka metodiki polucheniya geterogennogo biokatalizatora na osnove tripsina, immobilizovannogo na matrice hitozana // Fundamental’nye issledovaniya. 2013. № 11 (3). P. 484–487. (In Russian)]

  23. Логинова О.О., Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Беленова А.С. Подбор методики количественного определения трипсина, иммобилизованного на матрице хитозана, и его каталитической активности // Вестн. ВГУ. Сер.: “Химия. Биология. Фармация”. 2013. № 2. С. 116–119. [Loginova O.O., Holyavka M.G., Artyuhov V.G., Belenova A.S. Podbor metodiki kolichestvennogo opredeleniya tripsina, immobilizovannogo na matrice hitozana, i ego kataliticheskoj aktivnosti // Vestnik VGU. Seriya: “Himiya. Biologiya. Farmaciya”. 2013. № 2. P. 116–119. (In Russian)]

  24. Folin O., Ciocalteau V. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins // J. Biol. Chem. 1929. V. 73. P. 627–650.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска содержание выпуска

Радиационная биология. Радиоэкология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал