Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 6, стр. 629-634

МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования использовали 14-дневные растения кукурузы (Zea mays L.), выращенные гидропонным способом при температуре 20°C и 12-часовом световом дне и интенсивности освещения 25 Дж/м². Солевой стресс моделировали инкубацией проростков в 150 мМ растворе NaCl в тех же условиях выращивания. Контрольные растения инкубировались в воде.

Активность СДГ определяли в гомогенате листьев кукурузы спектрофотометрическим методом по падению оптической плотности реакционной смеси при длине волны 600 нм в течение 5 мин при 25°С в результате обесцвечивания 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) в ходе его восстановления. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, образующего 1 мкM продукта за 1 мин при 25°С [9].

Содержание белка в пробе определили по методу Лоури [10].

Для получения высокоочищенных препаратов СДГ использовали 3-стадийную схему очистки. Все операции проводили при температуре 4°С. На первой стадии навеску растительного материала (1.0 г) гомогенизировали в соотношении 1 : 5 в среде следующего состава: 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.5, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂, 0.4 М сахароза. Полученный гомогенат фильтровали через 4 слоя марли, затем центрифугировали в течение 5 мин при 1300 g. К супернатанту добавляли кристаллический сульфат аммония до 20% насыщения. Полученный осадок отделяли центрифугированием 20 мин при 12 000 g. В супернатант вносили сульфат аммония до 60% насыщения и вновь центрифугировали 20 мин при 12 000 g. Осадок ресуспендировали в 2 мл среды, содержащей: 10 мМ фосфатный буфер, рН 7.8, 0.01%-ный тритон Х-100, 20 мМ сукцинат натрия.

Полученный ферментный препарат наносили на колонку (1.5 × 20 см), заполненную сефадексом G-25 (“Pharmacia”, Швеция), для освобождения от солей и низкомолекулярных примесей. Элюцию осуществляли 10 мМ фосфатным буфером, рН 7.8, содержащим 20 мМ сукцинат натрия, со скоростью 30 мл/ч. Собранные активные фракции наносили на колонку (1.5 × 15 см) с ДЭАЭ-Sephacel (“Sigma-Aldrich”, США), предварительно уравновешенную 30 мМ фосфатным буфером, рН 7.8, содержащим 30 мМ KCl. Десорбцию фермента осуществляли линейным градиентом концентрации KCl от 0.03 до 0.2 М с 20 мМ фосфатным буфером, рН 6.2, с 20 мМ сукцинатом натрия.

Гомогенность активных фракций СДГ оценивали электрофоретическим методом [1]. Для специфического проявления на активность СДГ использовали тетразолиевый метод со средой следующего состава: калий-фосфатный буфер – 0.1 М, рН 7.5, 0.1 М сукцинат натрия, 0.5 мг/мл нитросинего тетразолия и 1 мг/мл феназинметасульфата [12].

Для выявления молекулярной массы полученных препаратов СДГ использовали гель-хроматографию на колонке (2 × 40 см) с сефадексом G-200 (“Pharmacia”, Швеция) [12]. Свободный объем колонки определяли с помощью голубого декстрана (“Serva”, ФРГ).

Определение величины константы Михаэлиса (К_м) и максимальной скорости (V_max) для изоферментов СДГ из листьев кукурузы проводили по методу Лайнуивера-Берка в системе двойных обратных координат [12].

Определение pH-оптимума проводили по графику зависимости активности фермента от различных значений pH.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из гомогената листьев контрольных растений кукурузы, выращенных в условиях солевого стресса получены гомогенные препараты СДГ в результате проведения 3-стадий очистки. Результаты представлены в табл. 1 и 2.

После десорбции фермента с ДЭАЭ-Sephacel линейным градиентом КCl (30–200 мМ) были получены два препарата в опыте и контроле, обладающих активностью сукцинатдегидрогеназы. Изоферменты, выделенные из гомогената листьев кукурузы, выращенной в обычных условиях, имели удельные активности: 0.623 первый и 1.095 Е/мг белка второй, при этом степень очистки составила 41.33 и 73.00, выход – 15.36 и 16.64% соответственно. Удельная активность СДГ из листьев растений, подвергнутых солевому стрессу, составила 1.035 Е/мг для первого изофермента и 1.095 Е/мг белка для второго, степень очистки 73.93 и 78.21, при выходе – 20.71 и 19.06% соответственно.

Изоферменты СДГ, полученные как из листьев контрольных растений, так и выращенных в присутствии 150 мМ NaCl, отличались по степени сорбции на колонке с ДЭАЭ-Sephacel (рис. 1). ДЭАЭ-Sephacel является слабым анионообменником и имеет положительный заряд. По данным литературы теоретическая изоэлектрическая точка (pI) СДГ равна 6.34, а значения pI зависят от анализируемого изофермента [13]. В среде с pH выше изоэлектрической точки белки проявляют отрицательный суммарный заряд и связываются с анионообменником. СДГ проявляла наибольшую стабильность и каталитическую активность в диапазоне pH от 7.0 до 8.0, что выше pI фермента. Результаты исследования показывают, что СДГ1 контрольных растений и СДГ1 из растений, подвергшихся солевому стрессу, десорбировалась с колонки ДЭАЭ-Sephacel при концентрации KCl 81.0 мМ и 89.5 мМ соответственно. Второй изофермент из контрольных растений элюировался при концентрации 149 мМ KCl, а из растений в условиях солевого стресса элюирование происходило при 166 мМ KCl (рис. 1). Эти различия в величине концентрации для десорбирования изоферментов СДГ из листьев кукурузы предполагают различие их поверхностного заряда. Увеличение концентрации КСl, необходимой для десорбции изоферментов с ионообменника ДЭАЭ-Sephacel, соотносится с изменением их заряда в отрицательную сторону, что является характерным для растений, подвергшихся солевому стрессу, чему способствует также подщелачивание матрикса митохондрий таких растений [14].

Рис. 1.

Профиль элюции с колонки ДЭАЭ-Sephacel изоферментов сукцинатдегидрогеназы из листьев кукурузы: а – контрольные растения, б – растения, подвергшиеся действию 150 мМ хлорида натрия.

Диск-электрофорез в полиакриламидном геле с применением общего проявления белка нитратом серебра подтвердил гомогенность полученных препаратов всех четырех изоферментов. При проявлении наблюдали только одну белковую полосу в каждом образце активных фракций, полученных после очистки на ДЭАЭ-Sephacel (рис. 2а). При проведении специфического проявления препаратов изоформ на активность СДГ, выделенных их контрольных растений и выращенных в условиях засоления, были получены по 2 полосы, с электрофоретической подвижностью для первого изофермента – 0.34 и 2 полосы для второго – 0.23 (рис. 2б). На этом основании можно сделать вывод о том, что в листьях кукурузы после засоления присутствуют изоферменты с одинаковой электрофоретической подвижностью СДГ1 и СДГ2.

Рис. 2.

Электрофорез очищенных фракций СДГ из листьев кукурузы (а) и специфическое проявление на активность (б). 1 – СДГ1 контроль, 2 – СДГ1 NaCl, 3 – СДГ2 контроль, 4 – СДГ2 NaCl.

При проведении гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200 были установлены молекулярные массы выделенных изоформ СДГ из контрольных растений и растений, подвергшихся солевому стрессу. Величина молекулярной массы изоформ из контрольных и опытных растений совпадала и для СДГ1 составила 105 кДа, а для СДГ2 – 134 кДа.

Полученные результаты согласуются с данными предыдущих исследований, согласно которым показано наличие двух изоферментов СДГ в листьях кукурузы [5], в листьях гороха [15], а также в корнях сладкого картофеля [16]. Эти две формы являются конститутивными и различаются по своей структурной организации: первая - гетеродимерный изофермент (СДГ1), а вторая - гетеротетрамерный (СДГ2) [17].

Были изучены кинетические свойства K_м, V_max и pH оптимумы каждого изофермента, полученного из контрольных и опытных растений кукурузы.

Два изофермента СДГ из листьях проростков кукурузы проявляли сходные кинетические свойства как в контроле, так и в проростках в условиях кратковременного солевого стресса. Для изофермента СДГ1 значение константы Михаэлиса составило 1.08 мМ, что незначительно отличалось от K_м фермента, полученного из растений, подвергнутых стрессу – 1.13 мМ (табл. 3). Величины K_м для второго изофермента СДГ в опыте и контроле имели достоверные различия и составляли 1.23 и 1.18 мМ соответственно. Полученные значения K_м для изоферментов СДГ контрольных образцов указывают, что СДГ2 проявляла несколько меньшее сродство к субстрату по сравнению с СДГ1. Эта тенденция сохранялась и у изоферментов, полученных из листьев проростков в условиях солевого стресса. Результаты проведенного анализа кинетической характеристики исследуемых изоферментов свидетельствуют о большем сродстве к субстрату изофермента СДГ1, что, вероятно, обуславливает его большую кинетическую активность.

При расчете V_max для изоферментов СДГ из листьев кукурузы в норме и в условиях засоления анализируемая величина изменялась для обоих форм фермента. Величина V_max как для СДГ1, так и СДГ2 в экспериментальных растениях увеличивалась в 1.17 и 1.27 раза соответственно (табл. 3). Таким образом, данные по V_max для изоформ СДГ свидетельствовали об увеличении каталитической активности при воздействии 150 мМ хлорида натрия на кукурузу.

Изменения величин K_м и V_max обоих исследуемых изоферментов СДГ при воздействии на растения солевого стресса возможно объясняются модификациями их белковых компонентов, обусловленные изменением рН матрикса митохондрий [14], что находит отражение в кинетике реакции [18]. Анализ величины V_max/K_м изоформ СДГ свидетельствует, что наибольшее сродство к субстрату проявляли ферменты растений в условиях воздействия на них солевого стресса. Значения V_max/K_м для СДГ1 и СДГ2 из контрольных растений были в 1.17 и 1.27 раза соответственно ниже, чем у изоформ из растений при воздействии солевого стресса, что свидетельствует о большем сродстве к сукцинату изоформы СДГ2. Кроме того, при повреждении, в том числе и при солевом стрессе, происходит некоторое изменение субстратной специфичности, делая возможными дополнительные метаболические реакции, некоторые из которых имеют потенциальное физиологическое значение [19, 20]. Показано, что в условиях солевого стресса происходит модуляция величины рН цитозоля мембранных органоидов клетки, в том числе за счет перераспределения вакуолярного пула протонов [21]. Изменение значений рН матрикса митохондрий сказывается на конформационных состояниях белковых компонентов изоферментов СДГ, что находит отражение в изменении сродства к субстрату.

Изменение рН влияет на структуру белка, а снижение активности фермента за пределами оптимального рН определяется природой аминокислот в активном центре, который подвергается протонированию и депротонированию, а также конформационными изменениями, вызванными ионизацией аминокислот. Изучение зависимости активности изофермента СДГ от рН среды показало, что достоверных различий между опытными и контрольными образцами по изоферменту СДГ1 нет. Максимальная активность фермента для СДГ1 наблюдалась при рН 7.6 и в контроле и фракциях фермента, полученных из растений, подвергнутых солевому стрессу. Оптимальное значение pH для СДГ2 понизилось с 8.0 pH до 7.8 pH после воздействия солевого стресса в течение 24 ч (рис. 3).

Рис. 3.

pH-оптимум для изоферментов сукцинатдегидрогеназы из листьев кукурузы. 1 – СДГ1 контроль, 2 – СДГ1 NaCl, 3 – СДГ2 контроль, 4 – СДГ2 NaCl.

Таким образом, применение разработанной схемы очистки СДГ, включающей ионообменную хроматографию, позволило получить изоформы исследуемого фермента в высокоочищенном состоянии. Два изофермента СДГ1 и СДГ2 десорбировались с ДЭАЭ-Sephacel при различных концентрациях хлорида калия, что предполагает различие в организации их полипептидов, в частности, показано, что молекулярная масса изоформы СДГ1 составляет 105 кДа, а для СДГ2 – 134 кДа.

Сравнительный анализ полученных значений K_м и значений рН-оптимума изоферментов СДГ из листьев кукурузы в контрольных растениях и при воздействии 150 мМ хлорида натрия, показал незначительное снижение каталитической активности изоферментов, полученных из проростков, инкубированных в условиях солевого стресса. Наблюдаемое увеличение значений K_м указывало на небольшое снижение сродства к субстрату у этих двух изоферментов, что может быть необходимым для протекания дополнительных метаболических реакций при адаптации клеточного метаболизма к условиям стресса [19].