Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 1, стр. 66-73

МЕТОДИКА

Объекты исследования и метод культивирования. В работе использовали альгологическую монокультуру зеленой МВ Micractinium sp. NAMSU A-19 (далее в тексте Micractinium sp.) с ассоциированными гетеротрофными бактериями, ранее выделенную из водных проб затона озера Большая Имандра в непосредственной близости от хвостохранилища апатит-нефелиновой обогатительной фабрики г. Апатиты (Россия). В качестве прокариотного ОФМ использовали аксеничную культуру ЦБ Synechococcus sp. 1Dp66E-1 (далее в тексте Synechococcus sp.), выделеную из ассоциации с гидроидным полипом Dynamena pumila, собранным на сублиторали Кандалакшского залива Белого моря [6]. Выращивание культур проводили в стеклянных колоннах (600 мл) при постоянном освещении (80 мкмоль квантов ФАР/м²·с), температуре 26°С и продувании стерильного атмосферного воздуха на минеральной среде BG-11 [7] с повышенным содержанием фосфора (г/л): N-aNO₃ – 0.74, KNO₃ – 0.9, K₂HPO₄ – 0.181, KH₂PO₄ – 0.089, MgSO₄⋅7H₂O – 0.075, CaCl₂⋅2H₂O – 0.036, лимонная кислота – 0.006, цитрат аммония – 0.006, Na₂ЭДТА⋅2H₂O – 0.001, Na₂CO₃ – 0.02, раствор микроэлементов – 1 мл) в течение 10–12 сут (до стационарной фазы роста). По окончании культивирования клетки отделяли от среды центрифугированием при 1000 g и ресуспендировали в свежей среде BG-11.

Для иммобилизации использовали сорбент на основе хитозана, полученный в лаборатории полимерных материалов НИЦ “Курчатовский институт”. При синтезе сшитого хитозанового сорбента использовался хитозан ChitoClear HQG 800 (Исландия) с молекулярной массой 600 кДа. 2%‑ный водный раствор хитозана перемешивали с 2%-ной уксусной кислотой и добавляли глутаровый альдегид из расчета 1% (в/в) от веса хитозана. Лиофилизация образцов проводилась на установке Martin Christ Alpha 2-4LSC c глубиной вакуума 0.250 мБар в течение 24 ч, перед извлечением образцы выдерживали в вакууме 0.001 мБар в течение 2 ч [8].

Оценка эффективности иммобилизации смешанной культуры ОФМ на сорбенте на основе хитозана. Иммобилизацию клеток ОФМ на сорбенте проводили в стеклянных колбах объемом 100 мл, содержащих 0.050–0.053 г сорбента в форме диска и 30 мл суспензии культур Micractinium sp. и Synechococcus sp., предварительно смешанных в соотношении 2 : 1 (об./об.). Перед началом эксперимента определяли общее содержание хлорофилла в смешанной культуре по методике, описанной ранее [9]. Колбы помещали на термостатируемую качалку (120 об. /мин, 26°С) и инкубировали в течение 7 сут при освещении 40 мкмоль квантов ФАР/м²с. Процесс иммобилизации оценивали по изменению остаточного содержания хлорофилла в суспензии клеток, не прикрепившихся к сорбенту, при инкубации в течение 1, 2, 4, 24, 48, 168 ч. Контролем служила смешанная культура, инкубированная в идентичных условиях, но без хитозанового сорбента.

Эффективность иммобилизации смешанной культуры для каждой длительности инкубации вычисляли по формуле:

где Э_им – эффективность иммобилизации культуры на сорбенте, %; С_хл1 – содержание хлорофилла в контроле (без сорбента), мг/л; С_хл2 – остаточное содержание хлорофилла в суспензии клеток в присутствии сорбента, мг/л.

Оценка сooтношения Micractinium sp. и Synechococcus sp. в составе смешанной культуры в процессе и по окончании иммобилизации. О соотношении ЦБ и МВ в составе смешанной культуры судили по спектрам поглощения суспензии клеток, вычисляя отношение уровней поглощения в области основных максимумов цианобактериального фикоцианина (630 нм) и хлорофилла а (680 нм) ЦБ и МВ. По окончании инкубации (через 7 сут), клетки смешанной культуры десорбировали с поверхности носителя путем механического разрушения сорбента и последующего отделения его остатков от клеток смешанной культуры фильтрованием через сетчатый нейлоновый фильтр с диаметром пор 20 мкм. Соотношение величин поглощения при 630 и 680 нм суспензий десорбированной смешанной культуры сравнивали со значениями в контроле.

Изучение особенностей прикрепления клеток смешанной культуры методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Фрагменты сорбента с иммобилизованными на них клетками из смешанной культуры фиксировали 2%-ным раствором глютарового альдегида, приготовленного на 0.1 М какодилатном буфере с рН–7.2 в течение 1 ч, затем обезвоживали в водных растворах этанола возрастающей концентрации (от 10 до 100%) и помещали на ночь в 100%-ный ацетон. Образцы высушивали при критической точке на установке “DryerHCP-2” (“Hitachi”, Япония), напыляли золотом с палладием на ионно-напылительной установке “IB-3 IonCoater” (“Eiko”, Япония) и исследовали с помощью сканирующего микроскопа JSM-6380LA (“JEOL”, Япония) при ускоряющем напряжении 15 Кв и инструментальном увеличении 60–20000.

Изучение биоизъятия фосфатов и нитратов иммобилизованными на хитозане клетками смешанной культуры. Суспензии клеток Micractinium sp. и Synechococcus sp. смешивали в соотношении 2 : 1 (об./об.). Перед смешиванием плотность суспензий монокультур, определяемая по оптической плотности (ОП) при 680 нм, составляла 0.3 опт. ед. В стеклянные колбы на 250 мл вносили 80 мл суспензии смешанной культуры и 3 образца сорбента массой 0.050–0.053 г в форме диска. Колбы помещали на термостатированную качалку (120 об./мин, 26°С) и инкубировали в течение 8 сут при освещении 40 мкмоль квантов ФАР/м² ∙ с. Контролем служила смешанная культура, которую инкубировали в идентичных условиях, но без хитозанового сорбента. Перед началом эксперимента, а также через 1 и 8 сут отбирали по 3 мл суспензии клеток смешанной культуры, инкубировавшейся с хитозаном и без, затем клетки отделяли от среды центрифугированием при 3000 g. Остаточную концентрацию фосфатов и нитратов в среде оценивали методом ионно-обменной хроматографии на хроматографе Thermo Dionex ICS 1600 HPLC (“Thermo Fisher Scientific Inc”, США) с анионной аналитической колонкой IonPac AS12A.

Статистическая обработка полученных результатов. Представлены результаты двух независимых экспериментов, каждый вариант в трех биологических повторностях. На рисунках представлены средние значения и соответствующие стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При иммобилизации смешанной культуры через 1 ч после погружения хитозанового диска в суспензию наблюдали снижение содержания хлорофилла в суспензии по сравнению с контролем, указывающее на прикрепление значительной доли клеток ОФМ к поверхности хитозанового диска (рис. 1а). Рассчитанная по формуле (1) эффективность иммобилизации варьировала в пределах 40–52%, что свидетельствовало о высокой сорбционной способности испытываемого сорбента на основе хитозана (рис. 1б). В течение 4 ч культивирования более 70% клеток в суспензии сорбировались на хитозане, однако в дальнейшем скорость иммобилизации клеток снижалась. Через 48 ч практически все клетки находились в иммобилизованном состоянии, а рассчитанная эффективность иммобилизации составила 92–97%. Сравнение эффективности иммобилизации смешанной культуры Micractinium sp., Synechococcus sp. и исследованной нами ранее монокультуры Lobosphaera sp. NAMSU 925/2 [10] показало, что тестируемый сорбент проявлял более высокую способность к сорбции исследованной нами смешанной культуры. Несмотря на окончание процесса иммобилизации в течение 2 сут, инкубация была продолжена до 7 сут для оценки прочности прикрепления клеток, их способности к росту и развитию, а также влияния иммобилизации на соотношение клеток ОФМ в смешанной культуре. Известно, что одним из главных недостатков метода пассивной (адсорбционной) иммобилизации клеток микроорганизмов на поверхности различных природных и синтетических носителей является обратимость процесса [1]. Сорбированные на носителе клетки могут легко освобождаться с его поверхности, переходя в суспензию, что затрудняет культивирование и последующий сбор биомассы. Следует отметить, что в эксперименте на протяжении 7 сут мы не наблюдали десорбции клеток смешанной культуры c поверхности полимера, что свидетельствует о существенном преимуществе его использования по сравнению с другими известными носителями [1, 2].

Исследуемый сорбент (рис. 2а) был получен путем сшивания хитозана с молекулярной массой 600 кДа глутаровым альдегидом (рис. 2б) методом криополимеризации [8] и обладал высокопористой структурой. Благодаря наличию значительного количества пор размером от 50 до 200 мкм (рис. 2а), сорбент на основе сшитого хитозана характеризовался большой площадью поверхности, поэтому мог адсорбировать и надежно удерживать значительное количество клеток микроорганизмов (рис. 2г). На первом этапе клетки исследуемой смешанной культуры прикреплялись к поверхности пористого сорбента, а затем диффундировали по системе сообщающихся пор во внутренние полости. При этом клетки смешанной культуры сохраняют способность к активному росту и делению, подтверждаемым видимым увеличением количества иммобилизованной биомассы клеток (рис. 2д).

Известно, что сорбент на основе природного поликатионита хитозана обладал высоким сродством к поверхностным структурам клеток ОФМ, так как положительно заряженные аминогруппы на поверхности полимера могут электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами в составе наружной мембраны ЦБ, а также с карбоксильными и тиоловыми группами полисахаридов, белков и полипептидов, входящими в состав поверхностных структур клеток МВ и ЦБ (рис. 2в) [10, 11]. В водных растворах хитозановые сорбенты были способны к образованию многочисленных межмолекулярных водородных связей, за счет чего прочность связывания их с клеточными стенками микроорганизмов увеличивалась, а комплексы не разрушались даже при экстремальных изменениях рН и ионной силы среды [11].

В ходе иммобилизации проводили оценку соотношения Micractinium sp. и Synechococcus sp. в суспензии не прикрепившихся к сорбенту клеток и сравнивали с их соотношением в смешанной культуре, инкубированной без носителя. В течение первых 48 ч эксперимента соотношение ОП при максимумах поглощения фикоцианина ЦБ (630 нм) и суммарного хлорофилла а МВ и ЦБ (680 нм) в суспензии клеток, не прикрепившихся к сорбенту, и суспензии клеток в контроле значимо не различалась (рис. 3). Следовательно, можно предположить, что клетки МВ и ЦБ сорбировались с одинаковой эффективностью. После 7 сут инкубирования смешанной культуры в присутствии сорбента, соотношение ОП при 630 и 680 нм в суспензии клеток, десорбированных из хитозанового диска, и суспензии клеток в контроле отличалось незначительно, поэтому можно предположить, что иммобилизация на полимере на основе хитозана не оказывала существенного влияние на состав смешанной культуры (рис. 3).

Исследование сорбента с иммобилизованной смешанной культурой проводили с применением метода СЭМ (рис. 4). Одноклеточная ЦБ Synechococcus sp. не образовывала слизистых чехлов и была представлена клетками в форме палочек, длиной 1.5–2.0 мкм и диаметром 0.6–0.8 мкм [12], а одноклеточная МВ Micractinium sp. – сферическими клетками размером 2–3 мкм. Эти характеристики ОФМ (рис. 4а) соответствуют клеткам МВ и ЦБ на поверхности сорбента. Одновременно выявляются бактерии разных морфотипов (кокки, короткие и длинные палочки разного диаметра), возможно, первоначально ассоциированные с МВ. Как видно на рис. 4а ЦБ и гетеротрофные бактерии прикреплены к сорбенту преимущественно не ориентировано. Однако некоторые клетки ЦБ и большинство тонких длинных палочек бактерий прикрепляются полярным концом клетки перпендикулярно к поверхности сорбента. Одиночные клетки ЦБ, МВ и ассоциированных бактерий, а также их скопления обнаружены на внешней поверхности, в поровых каналах и в складчатых структурах сорбента (рис. 4б).

На поверхности и в поровых каналах полимера на основе хитозана, кроме того, наблюдается формирование внеклеточного полимерного матрикса (ВПМ) в виде тяжей, которые объединяют всех участников иммобилизованного сообщества (рис. 4в). На микрофотографии (рис. 4г) видно, что клетки Micractinium sp. и Synechococcus sp., активно заселяя поверхность сорбента, образуют на некоторых участках плотный слой агрегированных клеток, в котором представлены оба фототрофных компонента смешанной культуры. Известно, что продукция ВПМ является одним из ключевых этапов в формировании биопленки, образование которой подтверждается наличием крупных смешанных клеточных агрегатов, прикрепленных к поверхности хитозана, каналов, являющихся необходимой частью структуры биопленки (рис. 4г) [13]. Входящие в состав ВПМ компоненты (экзополисахариды, белки, аминокислоты) способствуют увеличению прочности связывания сообществ микроорганизмов с различными твердыми поверхностями [14] благодаря адгезионному взаимодействию. При иммобилизации ОФМ на поликатионном сорбенте на основе хитозана, электростатическое взаимодействие, возникающее между свободными аминогруппами на поверхности сорбента и карбоксильными группами кислых полисахаридов, входящих в составе ВПМ, способствует еще более прочному связыванию агрегатов клеток с поверхностью носителя, обеспечивая практически необратимую иммобилизацию.

Наряду с изучением сорбционной эффективности полимера на основе хитозана было исследовано влияние иммобилизации на процесс поглощения биогенных элементов клетками ОФМ. Результаты сравнения эффективности биоизъятия нитратов и фосфатов клетками свободной и иммобилизованной на хитозане смешанной культуры Synechococcus sp. и Micractinium sp. представлены на рис. 5. В 1 сут эксперимента количество, как поглощенных нитратов, так и фосфатов иммобилизованными и свободными клетками смешанной культуры практически не отличалось. В течение следующих 7 сут скорость изъятия биогенных элементов клетками смешанной культуры ЦБ и МВ значительно возрастала, при этом эффективность поглощения нитратов и фосфатов у иммобилизованных клеток была выше, чем у свободных. Так после окончании эксперимента клетки смешанной культуры, иммобилизованной на хитозановых дисках, поглотили 189 ± 11 мг/л нитратов и 40 ± 3 мг/л фосфатов, тогда как свободные клетки 150 ± 8 мг/л нитратов и 25 ± 2 мг/л фосфатов.

Увеличение эффективности изъятия биогенных элементов клетками ОФМ, иммобилизованных на различных природных носителях, описано в ряде работ [1, 2, 5, 10] и объясняется увеличением метаболической активности МВ и ЦБ, изменением микроокружения клеток. Известно также, что иммобилизованные культуры более устойчивы к изменениям рН, температуры, ионной силы среды [2, 5]. Основным преимуществом сшитых хитозановых сорбентов в сравнении с другими природными полимерами является их высокая механическая прочность и эффективность иммобилизации клеток [10]. Одним из перспективных способов применения биодеградируемых, нетоксичных полимеров на основе хитозана является их использование в процессе очистки сточных вод от биогенных элементов, позволяющее получать обогащенную биодоступными формами азота и фосфора биомассу ОФМ и использовать ее в качестве удобрения.

Таким образом, сорбент на основе хитозана с молекулярной массой 600 кДа обладал высокой сорбирующей способностью в отношении смешанной культуры Synechococcus sp. и Micractinium sp. с ассоциированными гетеротрофными бактериями. Поликатионный сорбент надежно удерживал клетки ОФМ как на поверхности, так и во внутренних слоях полимера, не препятствуя их росту и делению. В течение 7 сут культивирования клетки смешанной культуры практически необратимо прикреплялись к поверхности полимера, при этом наблюдалось формирование ВПМ, который объединяет все компоненты образующейся на носителе биопленки. Иммобилизация клеток смешанной культуры ОФМ на хитозановом сорбенте способствует увеличению эффективности биоизъятия нитратов и фосфатов клетками. Таким образом, сорбент на основе хитозана может быть успешно использован для иммобилизации ассоциаций и смешанных культур ОФМ с целью применения в различных областях фотобиотехнологии, в том числе для очистки сточных вод и биоизъятия биогенных элементов.

Работа по культивированию ОФМ, изучению методом СЭМ и синтез сорбентов выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-29-25050) с использованием оборудования ЦКП МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории полимерных материалов НИЦ “Курчатовский институт”.

Работа по изучению эффективности иммобилизации ОФМ выполнена при финансовой поддержке Мегагранта правительства РФ (соглашение № 075-15-2019-1882).