Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 6, стр. 551-560

Возобновляемая растительная биомасса (ВРБ), основными компонентами которой являются целлюлоза, гемицеллюлозы и лигнин, составляет основную часть органического материала на Земле и является практически неисчерпаемым источником сырья и энергии [1]. Разработка эффективных способов ее использования является одной из наиболее приоритетных задач современной промышленной биотехнологии. Применяемые в настоящее время подходы для переработки ВРБ включают стадии ее предварительной обработки, ферментативного гидролиза полисахаридов до простых сахаров и их трансформацию в коммерчески востребованные продукты – органические спирты и кислоты, алканы, алкены, фураны, диолы и многие другие органические соединения, которые далее используются в химической промышленности, производстве биотоплива и биополимеров [2–5].

Сдерживающей промышленное освоение процессов конверсии ВРБ является стадия ферментативного получения сахаров, для реализации которой необходимо иметь в наличии соответствующие дешевые и активные ферменты [6].

Различные ВРБ, например, разные виды многолетних и однолетних растений, значительно отличаются друг от друга по компонентному составу и структуре [7]. Для достижения максимальной эффективности ферментативной конверсии конкретного вида ВРБ требуются ферментные препараты (ФП), обладающие оптимальным составом ферментов, необходимых для гидролиза именно для этого вида ВРБ. Тем не менее, производители промышленных ферментов часто предлагают ФП общего назначения, не адаптированные к максимально эффективному гидролизу различных видов ВРБ [8].

Микроскопические мицелиальные грибы являются основным источником коммерческих ФП целлюлаз и гемицеллюлаз, производимых в промышленном масштабе во многих странах мира, в том числе и в России, которые могут быть использованы для биоконверсии ВРБ. Долгое время считалось, что низшие грибы, относящиеся к роду Hypocrea (синоним Trichoderma), являются лидерами по секреции наиболее активных целлюлаз и гемицеллюлаз [9–11], поэтому коммерческие ФП целлюлаз на основе мутантных штаммов T. reesei (H. jecorina) наиболее распространены на рынке ферментов, а большинство исследований и разработок по биоконверсии ВРБ основаны на использовании целлюлаз H. jecorina. Однако такие ФП имеют ряд недостатков, наиболее существенным из которых является относительно низкая активность по отношению к ВРБ [8, 12, 13].

В последнее время стало очевидно, что существует альтернатива ФП H. jecorina. Целлюлазы, продуцируемые грибами рода Penicillium (синоним Talaromyces), как правило, превосходят ферменты H. jecorina по скорости гидролиза и выходу глюкозы из различных ВРБ при одинаковой концентрации белка или активности целлюлазы, что неоднократно было показано различными исследователями начиная с середины 1990 гг. [14, 15]. Секвенирование и аннотация геномов P. decumbens, P. funiculosum и P. verruculosum показало, что эти виды грибов отличаются более богатым набором ферментов, катализирующих расщепление компонентов ВРБ, по сравнению с H. jecorina. Еще одной причиной высокой эффективности целлюлазных комплексов грибов Penicillium является высокая удельная активность их ключевых компонентов, в первую очередь целлобиогидролаз 1 и 2 (ЦБГ1 и ЦБГ2), по сравнению с соответствующими ферментами H. jecorina [15].

Из дикого целлюлозолитического штамма P. verruculosum WA30 методом ступенчатого мутагенеза и последующей селекции был получен высокопродуктивный штамм P. verruculosum В221-151 [16], из которого в дальнейшем также путем мутагенеза был получен реципиентный штамм P. verruculosum В1-537 (ΔniaD), сохранивший высокую секреторную способность до 50–60 г/л внеклеточного белка. Этот штамм является ауксотрофом с дефектом в гене niaD, кодирующем нитратредуктазу, которая принимает участие в ассимиляции нитратного азота. Штамма P. verruculosum 537 (ΔniaD) отличался редуцированным катаболизмом глюкозы за счет случайной мутации в репрессоре CreA, что позволяло культивировать его на среде с глюкозой, а также в режиме с подпиткой глюкозой. Биосинтез ферментов штамма индуцировался целлюлозой и целлоолигосахаридами.

Реципиентный штамм P.verruculosum В1-537 (ΔniaD) сохранял способность продуцировать комплекс внеклеточных целлюлаз, активность которых превосходила активность комплекса штаммов Hypocrea [17]. Целлюлазный комплекс P. verruculosum может быть с успехом использован для биоконверсии ВРБ и превращение ее в глюкозу [15, 18], а использование возможностей экспрессионной системы P. verruculosum позволяло изменять содержание и состав тех или иных ферментов комплекса (вводить в его состав новые ферменты), чтобы регулировать состав ферментного комплекса для максимально эффективной конверсии различных видов ВРБ.

Реципиентный штамм P. verruculosum, таким образом, был использован для создания новых штаммов и получения ФП для эффективного конверсии различных видов ВРБ. Схема действия целлюлазного комплекса приведена на рис. 1.

Строение целлюлозы обуславливает ее высокую химическую стабильность и устойчивость к ферментативному гидролизу. Для эффективного гидролиза целлюлозы требуется совместное действие ферментов эндодеполимераз, эндоглюканаз (ЭГ), которые расщепляют целлюлозные цепи преимущественно на аморфных участках фибрилл целлюлозы. При этом образуются восстанавливающие (В) и невостанавливающие (НВ) свободные концы, представляющие собой субстрат для действия экзо-деполимераз, целлобиогидролаз (ЦБГ1, ЦБГ2), которые последовательно отщепляют остатки целлобиозы от концов полимерной цепи (гидролиз осуществляется по процессивному механизму). ЦБГ могут атаковать как кристаллические, так и аморфные зоны субстрата.

К вспомогательным (синергетическим) ферментам, увеличивающим эффективность действия ферментов базового комплекса на ВРБ, относятся β-глюкозидазы (целлобиазы), литические полисахаридмонооксигеназы (ПМО), а также гемицеллюлазы (преимущественно ксиланазы) [15]. Содержание вспомогательных ферментов в составе базового комплекса P. verruculosum ограничено, то есть лимитировано физиологией гриба [19], поэтому для увеличения гидролитической способности целлюлазного комплекса представлялось целесообразным увеличить уровень секреции вспомогательных ферментов.

β-Глюкозидаза (БГ) осуществляет конверсию целлобиозы и целлоолигосахаридов в глюкозу, что является важным шагом не только для получения глюкозы как конечного продукта ферментативной деструкции целлюлозы, но и для увеличения эффективности процесса ферментативной конверсии целлюлозы ЦБГ и ЭГ, поскольку целлобиоза и целлоолигосахариды ингибируют эти ферменты, в особенности ЦБГ. Глюкоза ингибирует эти ферменты в значительно меньшей степени [15].

ПМО не обладают гидролитической активностью, но играют важную роль в деструкции целлюлозы, окисляя целлюлозную цепь в произвольном месте на поверхности кристалла, что приводит к образованию свободных концевых групп для действия ЦБГ. Кроме того, заряженные группы на образующихся концах способствуют аморфизации целлюлозы и повышают ее доступность для ферментов [15].

Гемицеллюлазы (ксиланазы, КСИЛ) осуществляют деструкцию, входящих в состав ВРБ гемицеллюлаз (ксиланов), что приводит к увеличению степени конверсии сырья и увеличению доступа целлюлолитических ферментов к поверхности субстрата.

β-Глюкозидаза (КФ 3.2.1.21, БГ). Для получения высокоактивного штамма P. verruculosum F10 – продуцента β-глюкозидазы А (БГА) A. niger (GH3, 116 кДа, pI 4.55) использовали реципиентный штамм P. verruculosum B1-537 (ΔniaD). Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии гена bgl1 содержала целевую кодирующую последовательность, связанную с промотором и терминатором “сильного” индуцибельного промотора гена ЦБГ1 (cbh1) – мажорного фермента, продуцируемого P. verruculosum (в качестве сигнальной последовательности использовали сигнальный пептид БГА) [20].

Создание штамма P. verruculosum F10 позволило при культивировании в лабораторных ферментерах достигнуть более 1300 ед./мл β-глюкозидазной активности в культуральной жидкости (КЖ), определенной по скорости гидролиза п-нитрофенил-β-D-глюкозида (пНФГ) в качестве субстрата, и 1700 ед./мл активности целлобиазы (определенной по скорости гидролиза целлобиозы). Это примерно в 25–30 раз выше, чем соответствующие активности в КЖ реципиентного штамма. Сухой ФП F10, полученный лиофильным высушиванием КЖ штамма P. verruculosum F10, содержал ~80% гетерологичной БГА (табл. 1) и 35 300 и 46 700 ед./г БГА и целлобиазной активности соответственно [8]. Препарат содержал также около 3% гомологичной БГ от общего количества секретируемого белка и около 1100 ед./г активности БГ (~600 ед./г активности целлобиазы). В отличие от БГ, продуцируемых штаммами родов Penicillium, Hypocrea и Chrysosporium, БГА являлась “истинной” целлобиазой, то есть ее активность по целлобиозе превышала активность по пНФГ, и уменьшалась в ряду целлобиоза > целлоолигосахариды с увеличиващейся степенью полимеризации последних [21].

Было проведено исследование влияния ФП F10 на результаты конверсии целлюлозосодержащего сырья – отходов резки пергамента под действием ФП B1-537, полученным из реципиентного штамма P. verruculosum B1-537 (ΔniaD) [22]. Для сравнения использовали коммерческий ФП BioACE, полученный на основе штамма-продуцента H. jecorina, основными компонентами которого, как и ФП В1-537 были ЦБГ и ЭГ. ФП BioACE, также как и ФП В1-537, имел низкую активность БГ. В табл. 2 приведены значения удельных активностей использованных ФП по отношению к различным субстратам. Активность по фильтровальной бумаге (АФБ) и микрокристаллической целлюлозе (МКЦ) отражают уровень целлобиогидролазной активности, активность по КМЦ – уровень эндоглюканазной активности, по пНФГ и целлобиозе – БГ и целлобиазную активности, соответственно. ФП В1-537 и BioACE имели сопоставимые по величине значения удельных активностей по АФБ, МКЦ, КМЦ, пНФГ и целлобиозе. ФП F10 характеризовался более низким уровнем активности по отношению к полисахаридным субстратам, однако существенно превосходил по значениям удельной активности по пНФГ и целлобиозе.

В экспериментах по ферментативному гидролизу отходов пергамента использовали смесь ФП В1-537 + ФП F10 и BioACE + ФП F10, Кроме того, для гидролиза использовали также отдельные ФП целлюлазы без добавления ФП F10. На 1 г сухого субстрата вносили 10 или 15 ед. целлюлазной активности (в расчете по АФБ), и 40 ед. ФП F10 (при расчете по пНФГ) при концентрации субстрата в реакционной смеси – 50 г/л.

Результаты ферментативного гидролиза отходов пергамента представлены на рис. 2. Оба препарата целлюлаз (без добавления ФП F10) обеспечивали значительную глубину гидролиза субстрата. Наибольший выход глюкозы наблюдали при действии ФП В1-537 при двух концентрациях препарата. Добавление в реакционную смесь ФП F10 приводило к заметному увеличению выхода глюкозы как при гидролизе ФП В1-537, так и BioACE: за 24 ч – на 20–56%, за 48 ч – на 31–43%, за 72 ч – на 6–15%. Максимальный выход глюкозы в результате ферментативного гидролиза отходов пергамента под действием ФП В1-537 в течение 72 ч составил 38 г/л (15 ед. по ФБ) в присутствии БГ, что соответствовало практически 70%-ной глубине конверсии субстрата.

Присутствие в реакционной смеси избытка БГА позволило снизить дозировку целлюлазных ФП В1-537 и BioACE на 33%: выход глюкозы при гидролизе пергамента ФП в дозе 10 ед. АФБ на 1 г субстрата в присутствии избытка БГА превышал выход глюкозы при внесении ФП 15 ед. АФБ на 1 г субстрата в отсутствии БГА.

Было проведено сравнение эффективности использования смеси ФП B1-537 + ФП F10 при гидролизе различных видов ВРБ с эффективностью целлюлазных ФП, специально созданных для биоконверсии ВРБ (обогащенных БГ), таких как Accelerase 1000, Accelerase 1500, Accelerase DUET (http://genencor.com/fileadmin/user_upload/genencor/documents/GEN-00110_DuetBrochure10-low.pdf), и Cellic CTec-1, Cellic CTec-2 (https://www.novozymes.com/en/advance-your-business/bioenergy/ cellic) [8]. Коммерческие ФП имели, в целом, сопоставимые с ФП В1-537 удельные активности по ФБ, МКЦ и КМЦ, но превосходили ФП В1-537 по активности в отношении пНФГ и целлобиозы, при этом ФП F10 значительно превосходил коммерческие ФП по активности по пФНГ и целлобиозе (табл. 2).

Ферментативный гидролиз ВРБ проводили как коммерческим ФП, так и ФП В1-537 в реакционной смеси при концентрации 10 мг белка/г сухого вещества субстрата; ФП F10 добавляли из расчета 40 ед./г сухого вещества субстрата (концентрация субстрата в реакционной смеси – 100 г/л).

В качестве ВРБ использовали предобработанные с помощью парового взрыва стебли кукурузы, багассу (стебли сахарного тростника), а также измельченную на планетарной шаровой мельнице древесину сосны и осины. Первые два вида ВРБ традиционно получают в промышленных масштабах в Бразилии, США, а также в Юго-Восточной Азии для производства биотоплива 2 поколения (биоэтанола из целлюлозы). Древесина хвойных и лиственных пород является основным крупнотоннажным отходом лесосечного производства, а также деревообрабатывающих производств различного профиля, характерных для России, Европы и Канады.

Выход восстанавливающих сахаров (ВС) после 48 ч гидролиза приведен в табл. 3. Смесь препаратов В1-537 + F10 наиболее эффективно гидролизовала измельченную древесину сосны и осины, по сравнению с использованными коммерческими ФП. При гидролизе предобработанных кукурузных стеблей и багассы смесью препаратов В1-537 + F10 эффективность процесса уступала эффектиности Cellic CТec-2, но была выше эффективности действия остальных коммерческих ФП.

В табл. 3 приведены также результаты гидролиза микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), которая в отличие от других использованных субстратов практически не содержит лигнина и гемицеллюлоз. Глубина гидролиза МКЦ всеми исследуемыми ФП оказалась выше степени гидролиза природных ВРБ. При этом максимальный выход ВС был получен при использовании ФП Cellic CТec-2 и смеси препаратов В1-537 + F10, показавших также и наибольшую эффективность при гидролизе различных видов ВРБ.

Таким образом, создание высокопродуктивного рекомбинантного штамма P. verruculosum F10 – продуцента БГА было важным шагом на пути получения высокоэффективного ФП, предназначенного для биоконверсии различных видов ВРБ и получения из них сахаров.

Возможности экспрессионной системы P. verruculosum можно продемонстрировать на примере получения других продуцентов БГА A. niger. При использовании cbh1 промотора помимо штамма F10, препарат из которого содержал 80% БГ от общего пула секретируемых белков, был получен также рекомбинантный штамм P. verruculsum CV12, который характеризовался меньшим уровнем экспрессии БГА. ФП, полученный из КЖ этого штамма, содержал 24% БГА. При этом в отличие от штамма F10, был полностью сохранен целлюлазный комплекс P. verruculsum (табл. 1).

С использованием конститутивного гистонового промотора hist4, существенно более “слабого”, чем промотор cbh1, был создан еще один рекомбинантный штамм P.verruculosum Hist4-БГА – продуцент БГА A. niger. Полученный из его КЖ препарат содержал 13% гетерологичной БГ и тоже характеризовался сохранением базового целлюлазного комплекса (табл. 1) [23].

Было проведено сравнение эффективности гидролиза измельченной на планетарной шаровой мельнице осиновой древесины различными препаратами – смесью ФП B1-537 + F10, а также ФП CV12 и Hist4-БГ. Полученные результаты по образованию ВС и степени гидролиза субстрата различными ФП были близки и существенно превосходили полученные при воздействии одного ФП В1-537 [24].

Приведенные выше результаты показали существенную роль БГ для увеличения эффективности гидролиза целлюлазного комплекса P. verruculosum. Увеличение синтеза БГ может быть достигнуто с помощью различных подходов, в том числе, основанных на использовании разных промоторов для экспрессионной системы P. verruculosum.

Полисахаридмонооксигеназы (ПМО). Еще одним вспомогательным ферментом для целлюлазного комплекса является ПМО. Ферменты осуществляющие окислительную деструкцию целлюлозы и других природных полисахаридов были открыты в 2010–2011 гг. [15]. Следует отметить, что, как белки, ПМО были известны и ранее, но их ошибочно относили к 61 семейству гликозилгидролаз. После установления принадлежности данных ферментов к классу оксидоредуктаз их классифицировали как семейство AA9 вспомогательных активностей (Family 9 of Auxiliary Activities; http://www.cazy.org/AA9.html).

Характерным свойством всех ПМО является их зависимость от ионов двухвалентных металлов. Как правило, это ион Cu²⁺, который прочно связан в активном центре фермента за счет координации с двумя остатками гистидина. Реакции, катализируемые ПМО, также требуют наличия молекулы кислорода и донора электронов в реакционной смеси. В качестве последнего часто используют галлиевую или аскорбиновую кислоты, а также другие химические соединения, которые являются восстановителями [15]. В природных условиях донором электрона может являться фермент целлобиозодегидрогеназа, которая катализирует сопряженную реакцию окисления целлобиозы (одного из главных продуктов гидролиза целлюлозы), а также фенольные соединения – продукты биодеградации лигнина, являющегося одним из основных компонентов ВРБ.

ПМО осуществляют взаимодействие с гидролитическими ферментами базового целлюлазного комплекса, приводя в итоге к увеличению выхода глюкозы [15]. С использованием гомогенных ферментов было показано, что оптимальное содержание ПМО в составе целлюлазного комплекса должно составлять ~10% [25], причем введение ПМО в целлюлазный комплекс не должно нарушать его целостность и сбалансированность. Для соответствия этим требованиям была создана система экспрессии на основе индуцибельного промотора гена глюкоамилазы gla1 гриба P. verruculosum [26]. Поскольку промотор гена gla1 является более “слабым”, чем промотор гена cbh1, использование такой системы экспрессии позволяет вводить в состав секретируемых рекомбинантным штаммом-продуцентом ферментов ограниченное количество ПМО, не нарушая секрецию базового комплекса целлюлаз. В качестве целевой была выбрана ПМО T. reesei (ПМО-Tr, КФ 1.14.99.54 и 1.14.99.56, АA9, 39 кДа, pI 2,8), кодируемая геном eglIV, посколько фермент обладал большей активностью по сравнению с другими исследованными ПМО [25].

Генетическую трансформацию реципиентного штамма осуществляли с помощью плазмидного вектора, несущего ген eglIV, содержащий промотор гена gla1 и терминатор гена cbh1. В результате был получен рекомбинантный штамм P. verruculosum gla-ПМО-Tr, после культивирования которого в лабораторных ферментерах были получены ФП Gla-ПМО-Tr, содержащие 9–10% гетерологичной ПМО-Tr с сохранением базового целлюлазного комплекса P. verruculosum (табл. 4).

Необходимо отметить, что с помощью экспрессионной системы на основе промотора гена gla1 был получен рекомбинантный штамм P. verruculosum gla-БГА, продуцент гетерологичной БГА A. niger, уровень экспрессии которой также составил около 10% от общего секретируемого белка, при сохранении базового целлюлазного комплекса (состав ФП gla-БГА, полученного в лабораторном ферментере, приведен в табл. 4).

Была исследована способность к биоконверсии осиновой древесины, измельченной на планетарной шаровой мельнице (концентрация в реакционной смеси – 100 г/л), препаратами Gla-ПМО-Tr и Gla-БГА, а также их смесью [26]. В качестве контроля использовали ФП В1-537. Концентрация глюкозы при использовании ФП Gla-ПМО-Tr через 48 ч составила 42 г/л, что было на 10% выше концентрации продукта для контрольных ФП В1-537 (38 г/л), однако несколько ниже, чем для препарата Gla-БГА (52 г/л). При использовании же смеси препаратов Gla-ПМО-Tr и Gla-БГА (1 : 1) и сохранении общей дозировки ферментов по белку концентрация глюкозы достигла 59 г/л, что на 13% выше, чем для препарата Gla-БГА и на 56% выше по сравнению с контрольным препаратом В1-537.

Таким образом, синергетический эффект от введения двух гетерологично экспрессируемых ферментов (ПМО и БГ) в состав целлюлазного комплекса P. verruculsoum при конверсии измельченной осиновой древесины оказался выше, чем от введения какого-либо одного из этих ферментов. Важно подчеркнуть, что использование относительно слабого промотора гена gla1 для экспрессии целевых ферментов позволило сохранить базовый уровень продукции ключевых целлюлаз, что в итоге и привело к заметному росту эффективности препаратов при конверсии растительного сырья.

Помимо описанного выше продуцента ПМО на базе реципиентного штамма P. verruculosum B1-537 (ΔniaD) был получен высокоактивный штамм – продуцент ПМО-Tr, в котором экспрессия целевого гена находилась под контролем cbh1 промотора [27, 28]. Этот штамм P. verruculosum-ПМО-Tr позволил при культивировании в лабораторных ферментерах получить ФП, содержащий 24% ПМО-Tr (содержание базовых целлюлаз в таком ФП несколько уменьшилось, табл. 4).

Было проведено сравнение эффективности конверсии измельченной на планетарной шаровой мельнице осиновой древесины, а также МКЦ с помощью ФП ПМО-Tr и контрольного ФП В1-537, полученного из КЖ реципиентного штамма. За критерий эффективности конверсии принимали выход глюкозы и ВС после 24 ч действия ферментов. Несмотря на пониженное содержание целлюлаз базового комплекса (табл. 4) ФП ПМО-Tr осуществлял конверсию субстратов эффективнее, чем ФП В1-537, не содержащий ПМО. Выход ВС при гидролизе МКЦ препаратом ПМО-Tr был на 11%, а выход глюкозы – на 17% выше, чем в случае контрольного ФП. При конверсии измельченной осиновой древесины выходы ВС для ФП на основе рекомбинантного и исходного штаммов были близки, при этом выход глюкозы под действием ФП ПМО-Tr был на 35% выше по сравнению с ФП В1-537. Таким образом, ФП ПМО-Tr обеспечивал увеличение эффективности конверсии целлюлозосодержащего сырья по сравнению с ФП из P. verruculosum B1-537.

Ксиланазы. Содержание гемицеллюлоз (ксиланов) в различных видах ВРБ значительно варьирует [7], что требует индивидуального подбора состава ФП для наиболее эффективного гидролиза конкретных видов ВРБ. На основе реципиентного штамма P. verruculosum 537 (ΔniaD) были получены несколько рекомбинантных штаммов, продуцирующих мультиферментные комплексы с различным соотношением целлюлазных и ксиланазной активностей.

Ксилан – один из основных компонентов гемицеллюлоз клеточной стенки растений и второй по распространенности природный полисахарид после целлюлозы. Поэтому ФП, предназначенные для гидролиза ВРБ со значительным содержанием ксиланов (например, кукурузные стебли, багасса, осиновая древесина), должны иметь повышенное содержание ксиланаз. Для увеличения ксиланазной активности базового штамма P. verruculosum были выбраны эндо-β-1,4-ксиланаза А P. canescens (КСИЛА, КФ 3.2.1.8, GH10, 31 кДа, pI 8.5) и эндо-β-1,4-ксиланаза 3 T. reesei (КСИЛ3, GH10, 38 кДа, pI 9.1). С использованием cbh1 промотора были созданы штаммы P. verruculosum-КСИЛА и P. verruculosum-КСИЛ3 [23, 28], при культивировании которых в лабораторных ферментерах получали КЖ с активностью ксиланазы около 2000 ед./мл. Содержание гетерологичных КСИЛ в ФП, составило 17–18% (с сохранением ферментов базового целлюлазного комплекса P. verruculosum (табл. 1).

Активность ксиланазы ФП КСИЛА и КСИЛ3 в 1.6–5.3 раза превосходила таковую контрольного ФП, полученного из КЖ реципиентного штамма P. verruculosum В1-537 (ΔniaD) [18] (табл. 5). Активность по отношению к МКЦ (целлобиогидролазная активность) и КМЦ (эндоглюканазная активность) ФП, полученных из рекомбинантных штаммов, по сравнению с ФП из штамма-реципиента уменьшалась. В табл. 5 приведены удельные активности коммерческого ФП Accelerase XY, предназначенного для конверсии ксиланов ВРБ, который имел более высокую удельную активность ксиланазы, по сравнению с ФП КСИЛА или КСИЛ3, однако существенно уступал им по величине удельных активностей по отношению к МКЦ, КМЦ и пНФГ.

Эффективность рекомбинантных ФП ксиланаз была оценена по степени конверсии различных видов ВРБ (выход ВС и глюкозы после 48 ч действия ФП), в качестве которых использовали измельченные на планетарной шаровой мельнице осиновую древесину, сосновую (обесмоленную) древесину и багассу [18]. Концентрация субстрата в реакционной смеси составляла 100 г/л, ФП добавляли из рассчета 5 мг белка/г субстрата. Для наиболее полного проявления потенциала исследуемых ФП и повышения степени конверсии ВРБ в реакционную смесь также дополнительно добавляли рекомбинантный ФП β-глюкозидазы P.verruculosum F10 (40 ед./г субстрата). В качестве контрольного использовали ФП В1-537, полученный из реципиентного штамма рис. 3.

Осиновая древесина характеризуется высоким содержанием целлюлозы (40–55%) и гемицеллюлоз (ксиланов, до 40%), и относительно невысоким – лигнина (18–25%) [6] и, как уже отмечалось, для ее разрушения требуется высокая активность ФП ксиланазы. Действительно, наибольшим гидролитическим эффектом по отношению к измельченной осиновой древесине обладали ФП КСИЛA и КСИЛ3 (рис. 3а). За 2 сут наилучший из этих ФП (КСИЛ3) приводил к образованию примерно 42 г/л ВС и 40 г/л глюкозы, контрольный ФП B1-537 в тех же условиях – 35 г/л ВС и 33 г/л глюкозы.

Состав багассы характеризуется меньшим содержанием целлюлозы, чем у древесных растений (~40%), в багассе много ксиланов (>30%) и относительно мало лигнина (не более 25%) [6]. Наибольшим гидролитическим эффектом в случае измельченной багассы обладал ФП КСИЛ3, при использовании которого получали 42 г/л ВС и 32 г/л глюкозы, в то время как в контроле с ФП В1-537 – 32 г/л ВС и 27 г/л глюкозы (рис. 3б).

Древесина сосны содержит значительное количество целлюлозы (45–50%), до 30% гемицеллюлоз (в основном ксиланов), содержание лигнина составляет 25–35% [6]. Как и в случае багассы наилучшим для гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины оказался ФП КСИЛ3, при использовании которого образовывалось 38 г/л ВС и 35 г/л глюкозы, при показателях в контроле с ФП В1-537 – 32 г/л ВС и 30 г/л глюкозы (рис. 3в).