Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 6, стр. 619-626

МЕТОДИКА

Объекты исследования. В качестве образца ОФ‑ТКО использовали модельный субстрат, который содержал (мас. %): фрукты – 1.4, картофель – 29, капуста – 2.7, картон –3.3, крупа – 19.5, скорлупа яичная – 0.9, хлеб – 7.4, мясо – 15.5, кофе – 0.9, рыба – 4.6, творог – 4.6, чай (заварка) – 10.2. Состав модельного субстрата был выбран, исходя из данных о составе ОФ-ТКО, характерного для России [3]. Предварительно образец ОФ-ТКО был измельчен вручную (нож, ножницы) и гомогенизирован с помощью ручного перемешивания.

Модельный образец ОФ-ТКО имел следующие характеристики: содержание сухих веществ (СВ) – 36% и органических сухих веществ (оСВ) – 84% СВ. Для изучения процесса анаэробного сбраживания ОФ-ТКО разбавляли водопроводной водой до содержания СВ_исх – 29.7% и оСВ_исх – 95.1% СВ.

Образец ОФ-ТКО (150–180 г) подвергали обработке в АВС (“Регионметтранс”, Нижний Новгород, Россия) в течение 2, 4, 6, 8 и 10 мин. Условия обработки были следующие: U = 180 В, I = 52 A, f = 65 Гц, использовались ферромагнитные тела 3.5 × 35 мм в количестве 98 шт.

В качестве инокулята (источника метаногенного сообщества микроорганизмов) использовали анаэробный ил из лабораторного реактора, в котором стабильно протекал процесс анаэробного термофильного сбраживания комбикорма (КК-65). Инокулят имел следующие характеристики: СВ–3%, оСВ–69.8 % СВ, рН водной суспензии 7.78. Инокулят предварительно подвергался дображиванию при (57 ± 1)°С в течение недели.

Постановка эксперимента. Процесс двухфазного термофильного анаэробного сбраживания проводили в стеклянных флаконах объёмом 200 мл. Во флаконы вносили 100 мл инокулята, а также 6 г ОФ-ТКО, обработанного в АВС в течение 2 мин. В качестве контроля (К) использовали ОФ-ТКО, не обработанный в АВС. ОФ-ТКО предварительно помещали в мешочки из перфорированного нейлона и подвешивали над инокулятом, как показано на рис. 1. Соотношение субстрата (твердая фаза в мешочке) к инокуляту (жидкая фаза на дне флакона) в опытных смесях составляло оСВ_{ОФ‑ТКО}/оСВ_{инокулята} (S/X) = 0.81. Для создания анаэробных условий, флаконы продували азотом и герметично закупоривали резиновыми пробками. Флаконы инкубировали без перемешивания при 57°С в течение 34 сут. Регулярно, один раз в сутки, орошали содержащуюся в мешочках ОФ‑ТКО инокулятом путем встряхивания вручную содержимого флакона. Ежесуточно измеряли объем образующегося биогаза. Периодически, раз в 3–4 сут, отбирали пробы образующегося биогаза для анализа содержания СН₄ и СО₂, а также пробы жидкой фазы для анализа содержания ЛЖК. Эксперименты ставили в двух повторностях.

Аналитические методы. Для измерения объёма образующегося биогаза использовали волюметрический метод (вытеснение воды) [16]. Состав биогаза определяли с использованием газового хроматографа GC-2010 Plus (“Shimadzu”, Япония).

Содержание общего углерода (С_общ) и общего азота (N_общ) определяли на элементном анализаторе Vario EL cube (“Elementar”, Германия).

Количество и состав ЛЖК, накапливающихся в жидкой фазе флакона, определяли на хромато-масс-спектрометре GCMSQP2010 Ultra (“Shimadzu”, Япония), созданного на базе хроматографа GC-2010 Plus (“Shimadzu”) и нового сверхбыстрого квадрупольного масс-селективного детектора. Жидкую пробу образца сброженной массы центрифугировали при 4200 об./мин в течение 5 мин и фильтровали через шприцевые фильтры с диаметром пор 0.45 мкм. Пробу объемом 0.2 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра. Испарение анализируемого вещества происходило в потоке газа-носителя (гелий 6.0) при температуре 250°C. Далее, компоненты образца разделялись на капиллярной хроматографической колонке ZB-FFAP в течение 19 мин. Обработку результатов хромато-масс-спектрометрического анализа проводили с использованием программного обеспечения Shimadzu (GCMS Solution ver. 4.11). ЛЖК идентифицировали с помощью базы данных NIST 11. Концентрацию ЛЖК в пробах жидкой фазы флаконов определяли по площадям хроматографических пиков в режиме селективного мониторинга выбранных ионов, относящихся к наиболее интенсивным линиям в масс-спектрах определяемых веществ, методом внутреннего стандарта.

Содержание сухого вещества (СВ) определяли после высушивания образцов до постоянной массы при 105°C. Зольный остаток определяли при сжигании сухого образца в муфельной печи при 650°C. Содержание органического сухого вещества (оСВ) рассчитывали, как разницу между СВ и зольным остатком. Расчет удаленного оСВ (оСВ_уд) осуществляли по формуле:

где оСВ_исх(% СВ) – исходное содержание оСВ в ОФ-ТКО после обработки в АВС (до обработки в АВС – для контрольного образца ОФ-ТКО), оСВ_конечн(% СВ) – содержание оСВ в ОФ-ТКО после окончания эксперимента по двухфазному термофильному анаэробному сбраживанию.

Плотность ОФ-ТКО до и после обработки в АВС определяли согласно ГОСТ Р 55450-2013, основанном на измерении массы ОФ-ТКО в предварительно взвешенном контейнере известной вместимости. Внешний вид образца ОФ-ТКО до и после обработки в АВС оценивали визуально. рН образца ОФ-ТКО измеряли согласно ГОСТ 26423-85, предварительно разбавив ОФ‑ТКО дистиллированной водой в соотношении 1 : 5 по массе. Содержание аммонийного азота определяли фотометрическим методом с реактивом Несслера, согласно ГОСТ 26716-85. Содержание органического азота проводили методом Кьельдаля, согласно ГОСТ 26715-85. Определение содержания жира проводили путем его экстракции петролейным эфиром в экстракционном аппарате Сокслета и последующем взвешивании, согласно ГОСТ 15113.9-77. Измерения проводили в 2‑кратной повторности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние обработки в АВС на физико-химические свойства ОФ-ТКО. В результате обработки в АВС наблюдали изменение внешнего вида образцов ОФ-ТКО. Чем дольше осуществлялась обработка в АВС, тем более гомогенной становилась смесь, при этом цвет образцов изменялся от желто-коричневого до серо-черного (рис. 2). Изменение цвета было вызвано механическим разрушением и, возможно, частичным гидролизом компонентов ОФ-ТКО, а также небольшим увеличением содержания в ОФ-ТКО железа за счет соударения и истирания ферромагнитных частиц в процессе работы АВС, как было показано ранее [13].

Плотность контрольного образца (необработанный, исходный образец ОФ-ТКО) составляла 0.904–0.914 г/см³. После 2 и 4 мин обработки в АВС наблюдали увеличение плотности образцов ОФ-ТКО, которая составила  0.978–1.054 г/см³, в то же время после 6 и 8 мин обработки плотность значительно уменьшилась  (0.768–0.790 г/см³). Таким образом, относительно кратковременная обработка в АВС вызывала незначительное уплотнение образцов ОФ-ТКО, при более продолжительной обработке они становились более рыхлыми. Следует также отметить, что с увеличением продолжительности обработки возрастала температура образцов: после 2 мин до 48–50°С, после 4 мин до 58–60°С, после 6 мин до 72–74°С; после 8 мин до 84–85°С и после 10 мин до 90–93°С. Влажность образцов увеличивалась после 4 и 6 мин обработки в АВС по сравнению с контрольным образцом (ОФ-ТКО без обработки), а после 8 и 10 мин она стала уменьшаться, вероятно, из-за значительного нагрева образцов ОФ-ТКО. Изменение содержания оСВ коррелировало с изменением содержания СВ в обрабатываемых образцах (рис. 3).

Обработка образца ОФ-ТКО в АВС способствовала увеличению рН его водной вытяжки с 4.54 ± 0.02 в контроле, до 5.99 ± 0.01 после 10 мин обработки. Это могло быть вызвано частичным разложением азотистых органических соединений и высвобождением аммонийного азота, который подщелачивает среду. В результате предобработки образца ОФ-ТКО в АВС изменения соотношении общего углерода к общему азоту, существенно влияющего на АС [5, 6], не было выявлено, оно составляло от 13.5 до 14.3. При этом, массовая доля общего углерода в образце составила 50 ± 5% СВ, а общего азота –3.7 ± 0.4% СВ.

Обработка в АВС приводила к незначительному увеличению содержания белков в сухом веществе при увеличении времени обработки в АВС: содержание белка в образце ОФ-ТКО без обработки в АВС составляло в % от СВ – 21.4 ± 1.9, после 4 мин обработки – 23.2 ± 2.0; после 8 – 23.4 ± 2.0 и после 10 мин – 24.0 ± 1.9% СВ. Наблюдаемое повышение после 8 и 10 мин предобработки в АВС, возможно, связано с методом расчета, в котором учитывалось содержание СВ в пробе, а оно, вследствие нагрева и снижения влажности, увеличивалось, то есть происходило концентрирование образца.

Содержание жира в образце ОФ-ТКО уменьшилось в 4.25 раза после 2 мин обработки в АВС. Дальнейшее увеличение времени обработки в АВС не оказывало существенного влияния на содержание жира в образце (рис. 4).

Таким образом, предобработка в АВС образца ОФ-ТКО приводила к снижению содержания жира, увеличению рН, небольшому увеличению содержания белка в расчете на СВ, к изменению влажности и содержанию СВ. Содержание оСВ увеличивалось после 2, 8 и 10 мин предобработки и уменьшалось после 4 и 6 мин по сравнению с контролем. Плотность образца также изменялась, причем уменьшалась после 6 и 8 мин обработки и увеличивалась после 2 и 4 мин. Следовательно, уже после 2 мин предобработки в АВС наблюдали как визуальные изменения, так и изменения физико-химических свойств образцов ОФ-ТКО.

Влияние предобработки ОФ-ТКО в АВС на стабильность, биохимический метановый потенциал и на скорость анаэробного двухфазного сбраживании в термофильном режиме. Для создания двухфазной системы анаэробного сбраживания процессы гидролиза и кислотогенеза пространственно отделяют от процесса метаногенеза, обычно в двух или более реакторах. Удачным примером таких систем являются: Biocel (Нидерланды), SEBAC (США), APS (США), Bekon (Германия), в которых твердые органические отходы помещают в анаэробные реакторы периодического действия и орошают водой (перколятом) для увеличения влажности твердых отходов. Перколят растворяет и вымывает из толщи отхода накапливаемые ЛЖК и рециркулируется обратно в толщу отхода, предварительно проходя очистку в анаэробном метаногенном реакторе (например, биофильтре). Помимо увлажнения твердого отхода, рециркуляция перколята позволяет постоянно инокулировать (вносить) метаногенные микроорганизмы из метаногенного реактора в толщу отхода в твердофазном реакторе, постепенно переводя его на режим метаногенного сбраживания. Таким образом, использование двухфазных систем позволяет избежать проблемы необратимого закисления реакторов за счет избыточного накопления ЛЖК [3–5, 10–12].

В работе пространственное разделение процессов кислотогенеза и метаногенеза было оригинально реализовано в одном реакторе. В толще ОФ-ТКО (твердой фазе), содержащемся в подвешенном мешочке, происходили преимущественно процессы образования ЛЖК, которые вымывались в жидкую фазу, находящуюся на дне реактора (флакона). В жидкой фазе, содержащей метаногенное сообщество микроорганизмов, происходил процесс метаногенеза.

Для анализа влияния предобработки ОФ-ТКО в АВС на характеристики метанового сбраживания использовали образец ОФ-ТКО, обработанный в течение 2 мин. Этого времени было достаточно для существенного изменения физико-химических характеристик (рис. 3, 4), а также довольно высокого повышения температуры отхода (до 48°С), необходимого для проведения термофильного режима анаэробного сбраживания (50–57°С). Результаты, полученные ранее [17], показали, что для жидкофазного анаэробного сбраживания модели ОФ-ТКО наиболее экономически целесообразным являлось время предварительной обработки в АВС, равное 0.5 мин, так как прирост выхода метана при большей длительности обработки был не существенен.

На рис. 5 и 6 представлены среднесуточная скорость выделения и общий объем выделившегося биогаза (смесь метана и углекислого газа). Скорость выделения биогаза при двухфазном анаэробном сбраживании ОФ-ТКО, предварительно обработанного в АВС, в первые сутки эксперимента значительно превышала таковые в контрольном образце без обработки. Это объяснялось созданием более благоприятных условий для микроорганизмов-гидролитиков и бродильщиков в толще ОФ-ТКО в случае предварительной обработки образца в АВС. Гидролитики и бродильщики образуют субстраты (водород и ЛЖК), которые потребляются затем синтрофными бактериям и метаногенами, преимущественно находящимися в жидкой фазе, с образованием биогаза. На 8 сут скорость образования биогаза снижалась, однако содержание метана в нем было одинаково высоким и в контрольном, и в обработанном в АВС образце ОФ-ТКО: для необработанного – 67.6 об. %, для обработанного в АВС – 65.6 об. %. С 12 по 14 сут скорость образования биогаза снова увеличивалась. На 14 сут рН становился щелочным во всех флаконах: для необработанного ОФ-ТКО – 8.45, для обработанного в АВС – 8.03. Эти значения находились за пределами допустимого диапазона рН 6.8–7.4, при котором можно говорить о стабильном протекании процесса анаэробного сбраживания [18]. В то же время в литературе встречаются работы, в которых при более высоких рН (более 7.7) процесс метаногенеза был стабилен [19].

На 21 сут скорость образования биогаза начинала расти, а содержание метана в биогазе достигало максимума 76.3 и 72.3 об. % для необработанного и обработанного в АВС ОФ-ТКО, соответственно. Небольшое увеличение скорости наблюдали на 31 сут, однако при этом содержание метана в газе снижалось: для необработанного ОФ-ТКО – до 57.3 об. %, для обработанного в АВС–до 59.0 об. %. Общее количество образовавшегося биогаза и метана за 34 сут анаэробной ферментации составило: для необработанного ОФ-ТКО –1.54 и 0.84 л/г oСВ_исх, для обработанного в АВС – 1.72 и 0.97 л/г oСВ_исх, соответственно. Таким образом, обработка ОФ-ТКО в АВС способствовала увеличению производительности анаэробной двухфазной ферментации. Так, удельный выход биогаза увеличивался на 11.6%, метана – на 15.8% (табл. 1).

Необходимо отметить, что удаление сухого органического вещества в обработанных в АВС ОФ‑ТКО было ниже (14.6%), чем в контроле (20.3%). Вероятно, это объясняется особенностью методики определения сухого вещества. Так, в результате обработки в АВС часть компонентов ОФ-ТКО, в частности жиры (рис. 4), разлагались на более простые и, вероятно, летучие компоненты, например органические кислоты, которые при нагревании улетучивались и не учитывались в расчете сухого вещества. В то же время, летучие продукты разложения жиров и других компонентов в результате анаэробного сбраживания превращались в биогаз. Разница между удельным выходом биогаза и метана в расчете на удаленное оСВ при сбраживании необработанного и обработанного в АВС ОФ-ТКО была достаточно высокой и составляла 131% для биогаза и 140% для метана (табл. 1).

Концентрация ЛЖК, являющаяся одним из основных индикаторов стабильности процесса анаэробного сбраживания [20], в жидкой фазе была в пределах нормы. Причем и в контрольных, и в опытных флаконах основной ЛЖК была уксусная кислота, а пропионовая и масляная кислоты присутствовали в небольших количествах (табл. 2). Содержание уксусной кислоты на 14 сут в жидкой фазе опыта с обработанным в АВС образцом ОФ‑ТКО составляло 0.6 г/л, что было практически в два раза выше, чем в контрольном образце ОФ-ТКО. Это свидетельствовало о том, что благодаря измельчению и частичному гидролизу, микроорганизмы более полно использовали органическое вещество ОФ-ТКО, обработанного в АВС [13]. На 31 сут анаэробного сбраживания содержание уксусной кислоты снижалось в 2.65 раза для АВС ОФ-ТКО и в 2.49 раз для контрольного образца. Соотношение пропионата к ацетату было значительно ниже 1.4 – уровня, превышение которого свидетельствует о нестабильности процесса анаэробного сбраживания [19]. Таким образом, учитывая, что рН жидкой фазы на 34 сут составлял 8.35 ± 0.11 во флаконах с предобработанными образцами ОФ-ТКО и 8.25 ± 0.25 во флаконах с контрольным образцом (без обработки), процесс двухфазного сбраживания был стабилен.

* * *

В работе впервые исследовано влияние нового метода предобработки ОФ-ТКО в аппарате вихревого слоя (АВС) на ее физико-химические свойства и характеристики двухфазного термофильного анаэробного сбраживания, реализованного в одном реакторе.

Обработка в АВС приводила к нагреванию образца ОФ-ТКО, небольшому увеличению содержания белков и значительному снижению содержания жира в нем, а также увеличению рН среды, вероятно за счет высвобождения аммония. В то же время не наблюдалось четкой зависимости между длительностью обработки в АВС и такими показателями, как плотность, содержание сухого вещества и сухого органического вещества.

Использование двухфазной системы, где имелась возможность разделения в объеме реактора процессов гидролиза и кислого брожения, которые протекают в большей степени в твердой фазе системы (в ОФ-ТКО) и метаногенеза, протекающего в жидкой фазе в нижней части реактора, позволило создать наиболее благоприятные условия для кислотогенного и метаногенного микробных сообществ и провести процесс анаэробного термофильного сбраживания ОФ-ТКО без закисления, часто возникающего в реакторах анаэробного сбраживания [5, 6].

Предварительная обработка ОФ-ТКО в АВС, за счет измельчения и частичного гидролиза компонентов отхода, в частности жиров, улучшала доступ метаногенному микробному сообществу к субстрату, что отразилось на увеличении выхода биогаза и метана на 11.6 и 15.8% соответственно.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-38-00275.