Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 4, стр. 390-400

МЕТОДИКА

Растительный материал. Объектами исследования служили растения томата (Lucopersicon esculentum) сорта Джина и табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун. Семена стерилизовали в 2%-ном растворе гипохлорита натрия (“Лабтех”, Россия) и промывали 3 раза по 10 мин в стерильной воде. Семена проращивали in vitro на агаризованной безгормональной среде Мурасиге-Скуга (МС) [12]. Растения выращивали при температуре 22–24°С и 16-часовом световом дне и освещeнности 2.5 клк. Проростки черенковали 1 раз в месяц.

Микроорганизмы и условия их культивирования. В качестве ассоциативных микроорганизмов использовали штаммы: Pseudomonas aureofaciens BS1393, Pseudomonas fluorescens 142NF, Pseudomonas putida BS3701 (pBS1141, pBS1142), Acinetobacter baumannii 7, Rhodococcus erythropolis S67, метилобактерии Methylovorus mays ВКМВ-2221 (табл. 1), полученные в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН (Пущино, Россия) (табл. 1) [7, 13–16]. Бактерии A. baumannii, R. erythropolis и бактерии рода Pseudomonas выращивали до D₆₆₀ 1.0 при 28°C на роторной качалке (120 об./мин) в колбах Эрленмейера на 750 мл с 200 мл среды LB [17], содержащей бактотриптон (“Difco”, США) – 10 г/л, дрожжевой экстракт (“Difco”, США) – 5 г/л и NaCl – 10 г/л. (“Химмед”, Россия).

Метилобактерии выращивали на среде Канеда (К), содержащей (г/л): KH₂PO₄ – 2.0 (“CarlRoth”, Германия); (NH₄)₂SО₄ – 2.0 (“Химмед”, Россия); NaCl – 0.5 (“Химмед”, Россия); MgSO₄ · 7H₂О – 0.125 (“Химмед”, Россия); FeSO₄ – 0.002 (“Химмед”, Россия); агар – 12.0 (“Difco”, США), с добавлением 1.0% СН₃ОН в качестве источника углерода и энергии [14] до оптической плотности (D₆₆₀) 1.5, на роторной качалке (120 об./мин) в колбах Эрленмейера на 750 мл с 200 мл среды К при 37°С. Для колонизации использовали суспензию бактерий плотностью 2–3 × 10⁵ КОЕ/мл.

В качестве фитопатогенных штаммов использовали бактерии Erwinia carotovora subsp. сarotovora B15 (Horticulture Сentre, Канада) и Pseudomonas syringae, полученный из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино, Россия). Остальные бактерии выращивали в жидкой среде LB.

Колонизация растений ассоциативными бактериями. Семена и молодые побеги томата и табака обрабатывали суспензией ассоциативных бактерий. Для этого семена помещали в жидкую культуру бактерий с титром 10³–10⁵ на 1–2 мин, подсушивали на фильтровальной бумаге и переносили на чашки Петри, со средой МС.

Молодые побеги однократно опрыскивали 1 мл суспензии бактерий с титром 10³–10⁵ и культивировали в стеклянных пробирках. В качестве контроля на среду МС помещали необработанные бактериями семена и побеги, и культивировали при 22–24°С и 16-часовом фотопериоде при освещенности 2 клк. Колонизированные и укорененные растения in vitro переносили в теплицу станции искусственного климата Биотрон.

Биотесты на стабильность ассоциаций. Микробиологическое тестирование различных эксплантов растений (листьев или корней) проводили через 7, 14 и 49 сут после колонизации. Для этого растительный экстракт, полученный путем гомогенизации 1 см² растительной ткани, наносили на поверхность твердой питательной среды LB или K с селективными антибиотиками в чашках Петри и инкубировали при температуре 22–24°С 2 сут, затем проводили подсчет КОЕ на 1 см² площади растительной ткани.

Устойчивость колонизированных растений к нафталину и нефти. Нафталин (“Химмед”, Россия) растворяли в спирте (исходный раствор 100 мг/мл). В расплавленную агаризованную среду МС добавляли нафталин (50–100 мкг/мл) или нефть (0.5–0.7%). Нефть получена с нефтеперерабатывающего завода (“Газпромнефть” – Московский НПЗ”, Москва, Россия). Характеристики вносимой нефти: плотность – 0.868 г/см²; содержание воды – 0.06%; содержание солей – 45 мг/мл; механические примеси – 0.0080%; содержание серы – 1.42%; состав фракций (%): гексановая – 62.29; бензольная – 13.49; спиртобензольная – 11.21. В приготовленные пробирки пересаживали свежечеренкованные растения и проводили наблюдение за ростом растений в течение месяца.

Влияние нафталина на водоемкость, водообеспечение, водный дефицит растений томата. Для исследования влияния нафталина на водный режим [18] листья раскладывали на среду МС с нафталином (3–15 мкг/мл) и без нафталина (контроль), и инкубировали в чашках Петри течение 20 ч при температуре 22–24°С. Затем листья взвешивали (А), отмывали в дистиллированной воде и перекладывали в воду на 2 ч. Через 2 ч листья снова взвешивали (С) и высушивали в сушильном шкафу при температуре 60°С в течение 16 ч. Сухие листья снова взвешивали (D) и проводили расчет по формулам:

где А – начальный вес листьев; С – листья после 2-часовой инкубации на воде; D – листья после высушивания.

Определение перекисного окисления липидов. Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически по тесту с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (“Acros” Индия), основанному на взаимодействии ТБК с конечными продуктами окисления липидов, основную долю которых составлял малоновый диальдегид (МДА) (“Sigma”, США) [19]. Для этого растительный материал (300 мг) растирали в 5 мл 0.1 М Трис-НСl буфера (“Sigma”, США), pH 7.5, с 0.35 М NaCl (“Химмед”, Россия), отбирали 1.5 мл экстракта и добавляли к нему 1.0 мл 0.5%-ного ТБК в 20%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ, “Химмед”, Россия). Смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, затем очень быстро охлаждали во льду и центрифугировали при 12 000 об./мин в течение 5 мин. После этого измеряли оптическую плотность проб при 532 и 600 нм.

Биотесты на изолированных листьях и растениях. Для проверки устойчивости колонизированных растений к фитопатогенам молодые листья инфицировали суспензией бактерий E. carotovorа и P. syringae. В качестве контроля служили листья не колонизированных растений. Фитопатогенными бактериями (суспензия 10³–10⁵ кл./мл) инокулировали черешки листьев колонизированных и не колонизированных растений, помещали их на агаризованную питательную среду МС в чашки Петри и выдерживали их в закрытых емкостях при 24°С и 16-часовом световом дне, через 1–7 сут оценивали степень повреждения. Целые растения заражали уколом иглы, смоченной в суспензии патогенных бактерий. В каждом варианте опыта заражали по 4 листа. В таблицах представлены средние арифметические величины и их стандартные отклонения по 3–5 опытам в 3 биологических повторностях в каждом из них n = 9–15 [7].

Анализ жирнокислотного состава семян томата. Подготовка пробы. Перевод липидов пробы в метиловые эфиры соответствующих высших жирных кислот выполняли методом безэкстракционного последовательного метилирования растворами метоксида натрия и трехфтористого бора в метаноле [20]. Каждый из образцов измельчали в кофемолке и просеивали сквозь сито с ячейками размером 0.7 мм. К навеске 16.0–22.0 мг порошкообразной пробы добавляли раствор 500 мкг маргариновой кислоты в 220 мкл толуола (внутренний стандарт) и 350 мкл 1.0 М метанольного раствора метоксида натрия. Смесь нагревали 20 мин при 70°С, добавляли 400 мкл 15%-ного трехфтористого бора в метаноле и нагревали еще 20 мин при 70°С. К реакционной смеси добавляли 0.7 мл воды и 2 мл перегнанного гептана, и экстрагировали метиловые эфиры жирных кислот в органическую фазу, которую далее анализировали хроматографическим методом.

Хроматография. Анализ выполняли на аналитическом газовом хроматографе НР5890м (“Хьюлетт-Пакард”, США). Использована кварцевая капиллярная колонка размером 15 м × 0.2 мм × × 0.2 мкм с полярной фазой “Супелковакс-10” м (“Supelco”, Швейцария), ввод пробы (0.5 мкл) – с делением потока газа-носителя (1 : 40). Температурная программа анализа – от 120°С (0.5 мин) до 240°С (5 мин) со скоростью 10°С/мин. Температуры испарителя/детектора (ДИП) – 260 и 255°С. Для регистрации сигнала использовали интегратор пиков “НР 3396А” (“Хьюлетт-Пакард”, США). Количественное определение жирных кислот масла семян томата выполнено методом внутреннего стандарта. Внутренний стандарт – маргариновую кислоту (17 : 0) вносили в каждый из образцов исследуемого материала непосредственно перед его химической дериватизацией.

Определение сахаров и оксикислот в томатном соке. Подготовка образцов. К 50 мкл исследуемого сока добавляли 50 мкл водного раствора D-маннита с концентрацией 1.0 мг/мл (внутренний стандарт) и упаривали раствор досуха в вакууме ротационной сушилки “Савант спидвак” (“Savant Ins-trument IN”, США). К сухому остатку добавляли 50 мкл 2%-ного раствора гидрохлорида метоксиамина в пиридине и нагревали при 80°С в течение 15 мин, после чего добавляли 120 мкл чистого бис (N,O-триметилсилил)трифторацетамида и дополнительно нагревали при 80°С в течение 30 мин. Состав смеси полученных триметилсилильных эфиров анализировали методом газовой хроматографии.

Хроматография. Анализ выполняли на аналитическом газовом хроматографе НР5890 (“Хьюлетт-Пакард”, США) со следующими параметрами процесса: использована кварцевая капиллярная колонка SPB-1, размером 20 м × 0.2 мм × 0.2 мкм, газ-носитель – гелий (1.8 мл/мин), метод ввода пробы – с делением потока газа-носителя (1 : 65), объем вводимой жидкой пробы – 1 мкл, температурная программа анализа – от 80°С (0.5 мин) до 310°С со скоростью 10°С/мин, температуры испарителя и пламенно-оинизационного детектора (ДИП) – 280 и 320°С соответственно. Для регистрации сигнала использовали интегратор пиков НР3396А. Для количественной обработки результатов использовали метод внутреннего стандарта с добавлением D-маннита [21].

Биометрические исследования. Для определения влияния ассоциативных бактерий на рост и развитие растений томата и табака и их адаптацию к условиям закрытого грунта, колонизированные растения из стерильных условий высаживали в закрытый грунт станции искусственного климата “Биотрон” ФИБХ РАН (Пущино, Россия). Биометрические измерения проводили еженедельно, отмечая время наступления фенологических фаз.

Статистические методы анализа. Для статистической обработки данных использовали программы Statistica 6.0 и MS Excel 2007. Измерения проводили в трех аналитических и трех биологических повторностях. На графиках и диаграммах приведены средние значения и их стандартные отклонения. Достоверность различий оценивали с использованием непараметрического критерия Мана–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Колонизация растений. Колонизацию растений бактериальными штаммами проводили в условиях in vitro. Стерильные растения однократно опрыскивали суспензией одной из бактерий P. fluorescens, A. baumannii, R. erythropolis, P. aureofaciens, P. putida, M. mays (табл. 1), с титром клеток 10³ – 10⁵. Через 1–2 нед. после черенкования проводили тестирование на установление ассоциативной связи бактерий с растениями in vitro. Затем растения высаживали в теплицу на 7 нед. после колонизации проводили тестирование растений in vitro. Для этого экстракты, полученные из растительных эксплантов, наносили на поверхность питательной среды с селективными антибиотиками в чашках Петри и инкубировали 2 сут при температуре 22–24°С (табл. 2). Через 1 нед. после колонизации томатов бактериями их численность на корнях увеличивалась с 2.4 × 10³ до 2.0 × × 10⁴ КОЕ/г сырой массы, через 7 нед. с 3.2 × 10³ до 3.6 × 10⁴ КОЕ/г сырой массы. В последующих циклах микроразмножения растений содержание бактерий M. mays, P. fluorescens, P. putida, P. aureofaciens, A. baumannii и R. erythropolis в корнях сохранялось стабильно практически на одном уровне в течение всего периода вегетации, что указывало на их прочную ассоциацию с растениями.

Влияние колонизации на рост и развитие растений. Растения, колонизированные штаммами Pseudomonas и M. mays, отличались повышенной скоростью роста по сравнению с контрольными растениями (не колонизированными) (табл. 3). Бутонизация, цветение и плодоношение также начинались раньше у колонизированных растений. К 5 нед. роста в теплице растения, колонизированные М. mays, практически все уже были с бутонами (91%), количество бутонов у растений, колонизированных другими штаммами, было от 40 до 75%, а у контрольных растений – 42%. Цветение томатов наблюдали у 5–10% (от общего количества) растений, колонизированных P. aureofaciens, М. mays и P. putida на 6 нед. после высадки в теплицу, в то время как цветение контрольных растений начиналось только на 7 нед. (табл. 4). Колонизация растений положительно влияла на урожайность растений томата. Число плодов на одном колонизированном растении увеличилось в среднем на 10–20%, по сравнению с контрольными неколонизированными растениями (табл. 4). Средняя масса одного плода у контрольных растений составила 80.4 г. У колонизированных растений масса одного плода была в среднем выше на 2.1–17.7%. Растения томатов, колонизированные исследуемыми штаммами превосходили по урожайности контрольные растения на 14.6–45.9% (табл. 5).

Устойчивость колонизированных растений к нафталину и нефти. В экспериментах по устойчивости растений к нефти и нафталину использовали растения табака. Бактерии штаммов P. putida BS3701, P. fluorescens 142NF содержали гены салицилатгидроксилаз NahG и NahU, которые играют основную роль в деградации токсичных полициклических ароматических углеводородов. [14, 22].

Контрольные и колонизированные P. putida растения были высажены на среды МС с добавлением нафталина 50, 70 и 100 мкг/мл. На среде с концентрацией нафталина 50 мкг/мл растения выращивались в течение месяца. При наблюдении за их ростом было отмечено, что как неколонизированные, так и колонизированные хорошо укоренялись, росли и внешне не отличаются от растений, растущих на среде МС без нафталина. Через 1 сут роста на среде с нафталином в растениях определяли уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ). У контрольных и колонизированных растений, растущих на нафталине, уровень ПОЛ практически не отличался от уровня растений, растущих на среде МС без нафталина (рис. 1).

При концентрации нафталина в среде 70 мкг/мл было показано, что колонизация растений микроорганизмами значительно повышала их устойчивость к этому ксенобиотику. Увеличение уровня ПОЛ на 85–86% по сравнению с растениями, растущими без нафталина, отмечали через 4, 7 сут выращивания на нафталине (рис. 2). У колонизированных P. рutida растений уровень ПОЛ на среде с нафталином незначительно отличался от уровня ПОЛ растений, выращенных на среде МС без нафталина (рис. 2). Через 7 сут культивирования растений на среде с 70 мкг/мл нафталина отмечали пожелтение листьев контрольных растений, в то время как у колонизированных растений листья оставались зелеными. Уровень ПОЛ у контрольных растений на среде с нафталином увеличивался на 160%, что указывало на сильный стресс для этих растений (рис. 2в), в то же время колонизированные растения практически не испытывали абиотический стресс при выращиивании на среде МС с 70 мкг/мл нафталина в течение 7 сут.

При повышении концентрации нафталина в среде до 100 мкг/мл наблюдали потерю тургора листьев контрольных растений. Листья колонизированных растений сохраняли тургор и зеленый цвет. Уровень ПОЛ растений определяли через 7 сут роста на среде с нафталином. При этом уровень ПОЛ у контрольных растений увеличивался на 230% и у колонизированных на 179%, что означало высокую токсичность его для растений обеих групп (рис. 3).

Влияние нафталина на водный режим растений томата. Для определения водного режима растений листья колонизированных и контрольных растений, выросших in vivo, подвергали абиотическому стрессу, выдерживая их в парах нафталина 3–15 мкг/мл в течение 20 ч. Растения, колонизированные P. putida были более устойчивы к стрессу, несмотря на действие нафталина и повышение водного дефицита в листьях до 20% (табл. 6). При повышении концентрации нафталина происходило нарушение метаболизма, листья теряли массу и погибали. У контрольных растений нарушение метаболизма наступало уже при концентрации нафталина 3 мкг/мл и измерение водного режима становилось недоступным.

Определение отношения площади листа к сухой массе наглядно показало, что при повышении концентрации стрессового агента происходило нарастание распада веществ как у колонизированных так и контрольных растений (табл. 7). Концентрации нафталина 10–15 мкг/мл оказались токсичными для клеток, и через сутки наблюдалась гибель листьев при таких концентрациях.

Исследование колонизированных растений, растущих на нефти. Для исследования устойчивости колонизированных растений к нефти растения высаживали на среду с различными концентрациями нефти (0.5–0.7%). Через неделю культивирования колонизированных растений на среде с нефтью на корнях обнаруживали рост бактерий P. putida. Для этого экстракты корней наносили на поверхность питательной среды с селективными антибиотиками и, после образования колоний через 2 сут, проводили подсчет КОЕ P. putida. (Данные не приведены). Предварительно для выполнения эксперимента на поверхность среды МС наносили 0.5–0.7% нефти (от объема среды). На эту среду высаживали контрольные и колонизированные P. putida растения, за которыми наблюдали в течение месяца. Стресс, обусловленный влиянием нефти, действовал на обе группы растений, однако колонизированные растения были более жизнеспособны за счет присутствия на корнях бактерий-нефтедеструкторов. На среде с содержанием нефти 0.5% колонизированные растения сохраняли способность к росту и образованию новых почек в течение времени эксперимента – 27 дней (рис. 4а), а повышение концентрации нефти до 0.7% в среде приводило к полной гибели контрольных растений и частичной гибели колонизированных растений, при этом верхушечные листья колонизированных растений оставались зелеными (рис. 4б).

Устойчивость колонизированных растений к фитопатогенам. Уже через 1 сут после инокуляции на контрольных листьях, зараженных бактериальным штаммом E. carotovora, отмечали разрушение ткани мезофилла. К концу 2 сут поражение площади контрольных листьев составляло 100%. При заражении растений P. syringae признаки повреждения наблюдались через 4–5 сут – листья желтели и покрывались бурыми пятнами. В то же время листья растений, колонизированных P. aureofaсiens и M. mays, оставались без признаков повреждения (рис. 5а). Аналогичные симптомы болезни наблюдались при заражении целых растений. Колонизированные растения оставались неповрежденными в течение всего времени эксперимента, в то время как контрольные растения полностью погибали (рис. 5б).

Анализ жирнокислотного состава масла семян томатов. Семена томатов являются основным побочным продуктом при изготовлении томатной пасты в промышленности, которые составляют около 71–72% от общего производства отходов [23]. Масло семян томатов является отличным источником ценных жирных кислот (ЖК), которое используется в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности [24].

Исследовано влияние колонизации растений микробными штаммами на жирнокислотный состав семян томатов. Результаты относительного содержания индивидуальных ЖК к массе всех ЖК семян приведены в табл. 8. Анализ показал увеличение процентной доли насыщенных ЖК стеариновой (С18:0) от 4.3% в контроле до 5.0–6.3% в опыте (колонизированные растения) и олеиновой (С18:1) от 18.5% в контроле до 19.7–20.1% в опыте, в зависимости от штамма. Суммарное содержание ЖК в биомассе семян (вес./%) было выше у семян колонизированных растений.

Известно, что липиды являются интегральными компонентами клеточных мембран. Среди групп липидов важное место занимают стерины, которые стабилизируют мембраны и контролируют их проницаемость. В растениях стерины в больших количествах обнаруживались в тех органах и тканях, которые интенсивно функционируют и содержат большое число делящихся клеток: меристема, хлоропласты, семена [25]. При стрессовых воздействиях на растение, таких как низкая температура уровень стеринов повышается и тем самым стабилизирует состояние растительного органа [26]. В состав стеринов входит олеиновая кислота. В экспериментах доля олеиновой кислоты в семенах повышалась после колонизации, что указывало на мобилизацию некоторых защитных систем растений.

Анализ сахаров и оксикислот в томатном соке. В томатном соке растений, колонизированными штаммами M. mays и P. fluorescens, обнаружены углеводы – фруктоза и глюкоза, оксикислоты – яблочная и лимонная (табл. 9). Различия в количестве сахаров и оксикислот в колонизированных томатах и контрольных практически не наблюдали.

Таким образом, методы создания стабильной ассоциации растений с микроорганизмами, способными стимулировать их рост, эффективно конкурировать с фитопатогенами и вызывать деградацию чужеродных соединений в окружающей среде, перспективны для восстановления микробных биоценозов и поддержания естественного плодородия почв.

Работа выполнена по Госзаданию № 0101-2014-0046, РК 01201352439 и при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ № 19.08.00375, 18-08-00752, 19-08-00299