Почвоведение, 2023, № 4, стр. 464-481

ВВЕДЕНИЕ

Ежегодно на предприятиях сельского хозяйства, пищевой и деревообрабатывающей промышленности образуется огромное количество отходов с высоким содержанием органических веществ. Часть отходов находит применение, но большая часть сжигается или накапливается, что приводит к серьезным экологическим последствиям. Одно из решений этой проблемы – переработка органических отходов в компосты.

Компостирование – аэробный процесс, при котором благодаря метаболической активности преимущественно разнообразных видов прокариот и грибов происходят глубокие изменения физико-химических свойств исходных субстратов и их трансформация в ценные биоудобрения [3, 6]. В последние годы в исследованиях микробиоты компостов наряду с методами посева на питательные среды стали применять современные молекулярно-генетические подходы [15, 21, 28, 32, 37, 39]. Они позволили выявить значительно большее разнообразие бактерий и архей, чем культуральные методы, как в органических отходах, так и в конечных продуктах компостирования [21, 32, 39]. Показано, что модификация состава бактерий связана с изменением рН органических субстратов уже в начале их трансформации. Выявлены таксономические и физиологические группы прокариот и виды, активные на мезофильной и термофильной стадиях компостирования [3, 10, 20, 21, 23, 35]. Изучена структура сообщества прокариот в компостах в зависимости от состава органических отходов и на разных стадиях их компостирования [3, 10, 15, 28].

Заметно меньше исследований по характеристике разнообразия и роли грибов при компостировании отходов [11, 16, 24]. Вместе с тем именно грибам принадлежит ключевая роль в деградации сложных труднодоступных полимерных соединений, а синергические взаимодействия грибов с прокариотами обеспечивают эффективность этого процесса при переработке лигноцеллюлозных субстратов [4, 38]. Особенно мало работ по изучению микобиоты компостов с применением современных метагеномных подходов, а с их помощью можно получить значительно больше сведений о составе грибов и выявить организмы, которые невозможно или трудно изолировать на питательные среды, в том числе патогенные и условно патогенные виды [11, 24]. Спектры патогенных грибов могут варьировать в зависимости от отходов, а также природно-климатических регионов. Поэтому актуально выяснение состава и плотности популяций патогенных и условно-патогенных видов грибов, которые развиваются в ходе компостирования различных субстратов и могут сохраняться в значимом количестве в компостах. Эти данные необходимы для оценки возможных рисков для здоровья людей при производстве и применении компостов. Молекулярно-генетические подходы позволяют полнее проследить изменения в грибном сообществе на начальной стадии компостирования, установить, что при разложении листвы тополя доминируют 5 родов грибов двух отделов: аскомицетов и базидиомицетов, уточнить роль термофильных видов [16, 24, 41]. Однако необходимы дальнейшие исследования по выяснению динамики микобиоты при полном цикле получения компостов из различных субстратов, в частности, из отходов сельскохозяйственных предприятий. В настоящей работе применяли одновременно метод посева на питательную среду и высопроизводительное секвенирование ITS2 рДНК грибов с биоинформатической обработкой данных для получения более полного представления о сукцессии грибной биоты при трансформации исходных субстратов в компост.

Цель работы – характеристика таксономической и эколого-трофической структуры грибной биоты при компостировании навоза с добавкой соломы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Изучали микобиоту коровьего навоза, соломы пшеницы, исходных компонентов для приготовления компоста. В контейнеры (5.5 л) из пластика размером (11 × 30 × 16 см) вносили и тщательно перемешивали 430 г навоза, 100 г воздушно-сухой соломы и 1000 мл дистиллированной воды. Солому пшеницы измельчали на установке КР-01 Фермер-5 до размеров 0.3–0.5 см. Компостирование субстратов проводили при комнатной температуре (18–23°С) и постоянной влажности 75–80% от полной влагоемкости в течение 60 сут. Влажность поддерживали периодическим добавлением стерильной водопроводной воды. Наблюдали повышение температуры в компостируемых субстратах приблизительно на 15°С в течение первых недель, а затем она выравнивалась до комнатной. Убыль компостируемых субстратов составила 25%. Повторность в опытах трехкратная.

Химические свойства исходных компонентов и компоста определяли по следующим методикам в МГУЛАБ. Элементный состав в образцах исследовали методом ИСП-ОЭС на спектрометре 5110 ICP-OES Agilent. Предварительно пробы разлагали в микроволновой печи Вольта МС-10. Предварительно высушенные при 105°С навески (0.25 г) помещали в автоклав микроволновой печи, к ним приливали 8 мл концентрированной азотной кислоты и 2 мл перекиси водорода, после чего запускали стандартную программу для разложения органогенных образцов. После окончания программы и охлаждения пробы переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили объем до метки дистиллированной водой. Далее в пробе определяли массовые доли элементов по методике М-МВИ-80-2008 [2].

Измерение рН в образцах компоста и исходных субстратов проводили в водной вытяжке по ГОСТ 11623-89 на рН-метре рН-150-МИ (Россия). Электропроводность измеряли в той же вытяжке на кондуктометре HI 2300, Hanna Instruments. Содержания органического вещества определяли классическим гравиметрическим методом при 525°С по ГОСТ 26213.

Полученный компост значительно отличается от исходных субстратов: навоза и соломы – по содержанию органического вещества, элементов минерального питания, рН, показателям электропроводимости (табл. 1). По этим характеристикам он соответствует требованиям к компостам для растениеводства (ГОСТ 33830-2016). Компост обладал способностью повышать супрессивные свойства почв к фитопатогенам. При его внесении в дерново-подзолистую почву в вегетационных опытах с инфекционным фоном Fusarium oxysporum ВКМ F-140 (5 × 10⁶ КОЕ/г) послевсходовая гибель огурцов снижалась в среднем на 13%, а кресс-салата – на 33%.

Выделение и идентификация чистых культур грибов, оценка относительного обилия видов. Отбор и подготовку смешанных образцов из исходных субстратов навоза и соломы (0 сут) и в ходе компостирования их смеси проводили на 10, 20, 40 и 60 сут. Повторность образцов измельченной соломы, коровьего навоза и компостов в посевах 3-кратная, чашек Петри из каждого образца 6-кратная. Навеску образца массой 1 г переносили в пробирку с 10 мл стерильной воды, перемешивали на мешалке Вортекс в течение 5 мин. Поверхностный посев проводили из разведения 1 : 100 и 1 : 1000 на мальт-агар. Для подавления роста бактерий в среду добавляли 4 мл/л молочной кислоты (рН 5.0) или антибиотик стрептомицин сульфат. Чашки Петри инкубировали при комнатной температуре 18–22°С, периодически подсчитывали число колоний разных морфотипов и выделяли для идентификации в чистые культуры. Чистые культуры грибов хранили в пробирках со скошенным мальт-агаром при 5°С.

Рассчитывали общее число колониеобразующих единиц (КОЕ) грибов в 1 г воздушно-сухих образцов соломы, навоза и компоста и КОЕ часто выделяемых видов. Коэффициент вариации данных КОЕ грибов в среднем был около 10%. Представленность видов в изучаемых местообитаниях оценивали по показателю относительного обилия. Относительное обилие оценивали как отношение числа КОЕ данного вида к общему числу КОЕ, выраженное в процентах. Статистическую обработку данных проводили с применением программы Excel 6.0.

Выделенные штаммы грибов идентифицировали с использованием культурально-морфологических и молекулярно-генетических подходов. Описание культур проводили на сусло-агаре и среде Чапека с использованием рекомендуемых для соответствующего таксона определителей [5, 7–9, 12, 13, 19, 26, 27, 29–31, 33, 34, 36] и по генетическим признакам с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и дальнейшего секвенирования ITS-региона рДНК. Современное таксономическое положение видов дано по базе данных Index Fungorum (http://www.indexfungorum.org/Names/Names.asp).

Высокопроизводительное NGS cеквенирование ITS2 рДНК грибов и биоинформатическая обработка данных. Метод ПЦР. Геномную ДНК из образцов соломы, коровьего навоза и компоста выделяли с использованием набора DNeasy PowerSoil Kit в соответствии с рекомендациями производителя (https://www.bio.vu.nl/~microb/Protocols/Manuals/PowerSoil_DNA.pdf). Использовали смешанные образцы (из 9 отдельно отобранных), анализы проводили в двухкратной повторности. Для амплификации гипервариабельного ITS2 участка гена 18S рРНК использовали следующие праймеры: прямой NR_5.8SR – TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATCTCGATGAAGAACGCAGCG, обратный NR_ITS4R – GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCATCCTCCGCTTATTGATATGC в концентрации 5 мкМ. Амплификацию проводили в объеме 25 мкл в смеси, содержащей 5× KTN-mix (Evrogen) 5 мкл, смесь праймеров 2 мкл, 50× SYBR(Evrogen) 0.5 мкл, в амплификаторе в реальном времени CFX96 Touch (Bio-Rad) при следующих условиях: первичная денатурация 3 мин при 95°С; 35 циклов: денатурация 30 с при 95°С, отжиг 30 с при 57°С, элонгация 30 с при 72°С; заключительная элонгация 5 мин при 72°С.

Синтез библиотек для секвенирования методом ПЦР. Амплификацию ПЦР продукта, полученного на первом этапе, с целью баркодирования (индексирования) библиотек проводили в объеме 25 мкл в смеси, содержащей 5× KTN-mix (Evrogen) 5 мкл, смесь праймеров 2 мкл, 50× SYBR(Evrogen) 0.5 мкл, в амплификаторе в реальном времени CFX96 Touch (Bio-Rad) при следующих условиях: первичная денатурация 3 мин при 95°С; 7 циклов: денатурация 30 с при 95°С, отжиг 30 с при 55°С, элонгация 30 с при 72°С; заключительная элонгация 5 мин при 72°С. Для амплификации использовали индексы, рекомендованные производителем: Nextera Index Kit (Illumina).

Секвенирование на платформе Illumina. Ампликоны после второго этапа очищали с использованием магнитных частиц AMPure XP (KAPABiosystems) в следующих соотношениях: 1 : 0.6, где 0.6 – доля AMPure для очистки продуктов ПЦР амплификации гипервариабельного ITS2 участка гена 18S рРНК. Данные очищенные ампликоны являются готовыми библиотеками для мультиплексного секвенирования на платформе Illumina. Библиотеки смешивали между собой и доводили до общей концентрации 2 nM. К отобранным 5 мкл смеси добавляли 5 мкл 0.2 М NaOH и инкубировали в течение 5 мин. К денатурированой ДНК добавляли 990 мкл HTI и 1 мкл 12.5 мМ заранее денатурированого PhyX. Анализ библиотек проводили на секвенаторе нового поколения Illumina MiSeq методом парноконцевого чтения генерацией не менее 10 000 парных прочтений на каждый образец с использованием следующих реактивов: MiSeq Reagent Kit v2 nano и MiSeq v2 Reagent Kit (500 Cycles PE).

Обработка данных. Данные секвенирования обрабатывали программе, написанной с использованием алгоритма QIIME 1.9.1, включающего объединение прямых и обратных прочтений, удаление технических последовательностей, фильтрацию последовательностей с низкими показателями достоверности прочтения отдельных нуклеотидов (качество <Q30), фильтрацию химерных последовательностей, выравнивание прочтений на референсную последовательность, распределение последовательностей по таксономическим единицам (ОТЕ) с использованием базы данных Silva версии 132 и Unite v8. Использован алгоритм классификации операционных ОТЕ с открытым референсом (Open-reference OTU), порог классификации 97%.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Структура грибных сообществ навоза, соломы и компоста по данным культурального метода. Структура сообществ, т.е. показатели видового богатства и численности микроскопических грибов в субстратах для компостирования и получаемом компосте существенно различались (табл. 2). Общее число грибов в соломе составляло 8800 КОЕ/г, в навозе в несколько раз меньше 2400 КОЕ/г. В ходе компостирования численность грибов изменялась следующим образом: исходно в смеси навоза с соломой было 7300 КОЕ/г, к 10 сут их число возрастало до 9800 КОЕ/г, затем снижалось в период повышения температуры на порядок, а к 40–60 сут стабилизировалось на уровне 4500–4900 КОЕ/г компоста.

Метод посева позволил выявить в образцах навоза, соломы и при их трансформации в компост грибы трех отделов: анаморфы Ascomycota, Mucoromycota и дрожжевые грибы из Basidiomycota. Среди аскомицетов это были представители класса Sordariomycetes (порядка Hypocreales – Fusarium spp., Trichoderma atroviride), Eurotiomycetes (Eurotiales – Penicillium spp., Aspergillus spp., Talaromyces spp.), Dothideomycetes (Pleosporales – Alternaria spp., Dothideales – Aureobasidium pullulans), Saccharomycetes (Saccharomycetales – Dipodascus geotrichum). Среди мукоромицетов порядка Mucorales выявлены Mucor spp., Rhizopus stolonifer, среди базидиомицетов – только дрожжевые грибы Filobasidium wieringae, Rhodotorula glutinis из классов Tremellomycetes и Microbotryomycetes соответственно.

Из соломы изолировано больше видов (12), чем из коровьего навоза (5), за счет выявления Aureobasidium pullulans, Alternaria sp., A. alternata, Aspergillus flavus, Fusarium oxysporum, F. sporotrichioides, Talaromyces spp., Penicillium spp., дрожжевых грибов Filobasidium wieringae. Только в коровьем навозе были отмечены Trichoderma atroviride, Mucor circinelloides, Penicillium sp. и P. spinulosum sp. Общим для соломы и навоза был Aspergillus fumigatus, представители родов Trichoderma, Penicillium. Высокие показатели относительного обилия (более 10%) имели A. fumigatus, M. circinelloides, T. atroviride в коровьем навозе, A. alternata, A. flavus, Talaromyces funiculosus, T. variabilis в соломе.

В течение почти 6 нед. трансформации навоза и соломы в компост число видов грибов по данным посевов снизилось по сравнению с исходными субстратами. На 10, 20, 40 сут изолировали из компостируемой смеси 7, 4 и 5 видов соответственно, но к 60 сут их число возросло до 15 видов. В основном это было связано с выявлением Dipodascus geotrichum, Fusarium sporotrichioides, Penicillium spp., Talaromyces spp. на завершающем этапе компостирования (с 40 до 60 сут). В течение всего времени компостирования навоза с соломой выделяли A. fumigatus, M. circinelloides, T. atroviride, Fusarium spp., Penicillium spp. Виды рода Alternaria (A. alternata, Alternaria sp.) присутствовали в образцах с соломой (10³–10⁴ КОЕ/г) и выявлялись на начальных стадиях компостирования, но их число у A. alternata в компосте снижалось до 10² КОЕ/г.

Методом посева выявлены существенные различия в численности КОЕ, видовом составе и, соответственно, в структуре грибного сообщества в исходных субстатах, изменения этих показателей при трансформации смеси навоза с соломой в компост. В компосте уменьшилось разнообразие и численность грибов, характерных для соломы (Alternaria spp., Aureobasidium pullulans, Aspergillus flavus, Talaromyces funiculosus). При сравнении компоста с навозом наблюдали снижение в последнем численности A. fumigatus, M. circinelloides. Установлено, что в компосте разнообразие грибов больше, чем в исходных субстратах, в нем сильно возрастает показатель относительного обилия F. sporotrichioides.

Структура грибных сообществ навоза, соломы и компоста по данным ДНК-баркодинга. В образцах коровьего навоза среди грибов, идентифицированных методом высокопроизводительного секвенирования, есть представители 6 отделов. Преобладали в микобиоте навоза таксоны отдела Ascomycota – 75.6%, затем следуют Basidiomycota – 11.4%, Mortierellomycota – 10.1%, Chytridiomycota – 0.8%, Aphelidiomycota – 1.8%, Rozellomycota – 0.3% (табл. 3).

В микобиоте навоза отдел Ascomycota представлен классами Sordariomycetes, Eurotiomycetes, Pezizomycetes, Dothideomycetes, Leotiomycetes. Грибы класса Sordariomycetes преобладали (36.02% ОТЕ) и были представлены таксонами из порядков Sordariales (33.94%), Chaetosphaeriales (0.88%), Microascales (0.65%), Hypocreales (0.41%), Glomerellales (0.14%). Среди Sordariales сем. Chaetomiaceae выявлены Zopfiella tardifaciens, Zopfiella sp., Mycothermus thermophilus, Botryotrichum atrogriseum, B. spirotrichum, в семействе Lasiosphaeriaceae – Cladorrhinum phialophoroides, Cercophora coronata, Fimetaria sp., Podospora multipilosa, в Insertae sedis – Papulaspora equi, в Chaetosphaeriales сем. Chaetosphaeriaceae Dinemasporium spinificis; в Microascales семейства Microascaceae – Rhinocladium lesnei, Pseudallescheria boydii, Scedosporium prolificans. В Glomerellales отмечен только Colletotrichum hanaui из Glomerellaceae. В Hypocreales идентифицированы Penicillifer diparietisporus и Cylindrodendrum hubeiense из семейства Nectriaceae.

Вторыми по представленности в навозе были грибы класса Eurotiomycetes (15.65% ОТЕ) порядков Chaetothyriales (14.67%, Herpotrichiellacee – Phialophora cyclaminis), Onygenales (0.97%, Incertae sedis – Chrysosporium pseudomerdarium), Eurotiales (0.01%, Trichocomaceae – Thermomyces lanuginosus, Sagenomella oligospora).

Заметно меньше в навозе было грибов класса Pezizomycetes (5.71% ОТЕ) порядка Pezizales, среди которых удалось идентифицировать Ascobolus furfuraceus. Доля грибов класса Dothideomycetes составила 1.06%, они были представлены видами порядка Pleosporales (1.06%) – Didymella aurea, Preussia flanaganii, Alternaria iridiaustralis. Наименьшая доля в сообществе была у видов класса Leotiomycetes (0.31%) порядков Thelebolales (0.28% – Pseudogymnoascus appendiculatus, P. roseus, Pseudeurotium bakeri) и Helotiales (0.03% – Chalara sp. и неидентифицированные таксоны). 17% ОТЕ Ascomycota не были идентифицированы на уровне класса.

Среди Basidiomycota в коровьем навозе преобладали грибы класса Agaricomycetes (10.43%) порядка Agaricales (10.15% ОТЕ), до уровня рода доминирующие грибы не удалось идентифицировать. ОТЕ из Polyporales составили 0.28% (Ceraceomyces microsporus), в Atheliales единичные ОТЕ (Tylospora sp.). В небольшом количестве выявлены ОТЕ класса Tremellomycetes (0.97% ОТЕ), преимущественно из Trichosporonales (0.79%), доли ОТЕ из Filobasidiales и Cystofilobasidiales составили по 0.09%.

Грибы Mortierellomycota представлены исключительно видами класса Mortierellomycetes (8.34% ОТЕ) порядка Mortierellales – Mortierella polygonia, Mortierella spp.).

В микобиоте соломы (табл. 4) отмечены ОТЕ отделов Ascomycota (67.19%) и Basidiomycota (31.8%). В Ascomycota преобладают ОТЕ классов Dothideomycetes (67.1% ОТЕ). ОТЕ из Pleosporales составляют основную часть (65.22%) и включают виды Alternaria metachromatica (49.7% ОТЕ), а также другие виды рода Alternaria (A. iridiaustralis, A. senecionicola, A. dactylidicola, A. rosae, A. kareliniae, A. betae-kenyensis), Pyrenophora tritici-repentis, Bipolaris eleusines, Stemphylium loti, Neoascochyta exitialis, Ascochyta rabiei, Parastagonospora sp., Pseudoophiobolus italicus, Phaeosphaeria tofieldiae. В Dothideales (1.89% ОТЕ) идентифицированы Aureobasidium pullulans, Pyrenochaetopsis pratorum и ряд других.

Значительно меньше в соломе выявлено грибов класса Sordariomycetes (0.97%) порядков Glomerellales (0.53%) с доминированием Colletotrichum spaethianum, а также Xylariales (0.26%), Trichosphaeriales (0.13%), Hypocreales (0.04%), Sordariales (0.01%).

В грибном сообществе соломы отдел Basidiomycota представлен классом Agaricomycetes (24.79%) с видом Tylospora sp. Следующими по представленности были виды класса Tremellomycetes (5.47%), преимущественно из Tremellales – Vishniacozyma carnescens, F. stepposum, Dioszegia spp., Bulleromyces albus. Из Filobasidiales (0.09%) – Filobasidium spp. и Cystofilobasidiales (0.09%) – Udeniomyces puniceus. Доля ОТЕ таксонов класса Microbotryomycetes составила 1.51%, все ОТЕ принадлежали Sporidiobolales (Sporobolomyces spp.). В Cystobasidiomycetes (0.04% – Symmetrospora coprosmae) и Wallemiomycetes (0.01% – Wallemia sebi) было обнаружено по 1 виду.

После 20 сут компостирования навоза с соломой (табл. 5) доля представителей отдела Ascomycota в грибном сообществе составила 52.1%, Basidiomycota – 44.8%, Mortierellomycota 1.3%, Chytridiomycota 0.2%, Rozellomycota 1.0%, Aphelidiomycota 0.6%. Структура доминирования в сообществе грибов изменилась, возросла доля Basidiomycota класса Agaricomycetes (38.17%), преимущественно Agaricales (36.96%) – Coprinus cordisporus, C. annuloporus, Coprinellus marculentus, C. subdisseminatus, Cuphophyllus sp. В Polyporales (1.14% ОТЕ) идентифицирован Ceraceomyces microsporus, в Atheliales (0.07%) – Tylospora sp. Tremellomycetes (6.69%) представлены преимущественно Trichosporonales (6.55%) – Trichosporon spp., Apiotrichum scarabaeorum, Saitozyma podzolica, Filobasidiales (0.07%) – Solicoccozyma terricola; в Microbotryomycetes (0.14%) обнаружен только Leucosporidium escuderoi из Leucosporidiales.

Ascomycota включают ОТЕ преимущественно Sordariomycetes (18.93% ОТЕ), Pezizomycetes (6.32%), Dothideomycetes (4.04%), Eurotiomycetes (2.63%), Leotiomycetes (0.49% ОТЕ). 18.1% ОТЕ не были идентифицированы в аскомицетах. Sordariomycetes включают Sordariales (17.45% – Zopfiella spp., Mycothermus thermophilus, Botryotrichum spirotrichum, Papulaspora equi, Cladorrhinum phialophoroides, Podospora spp., Remersonia thermophile, Conlarium sp., Gelasinospora saitoi, неидентифицированные таксоны), Hypocreales (0.92% – Paracremonium binnewijzendii), Microascales (0.21% – Pseudallescheria boydii, Rhinocladium lesnei), Pleurotheciales (0.14% – Sterigmatobotrys uniseptata), Chaetosphaeriales (0.07% – Dinemasporium spinificis), Coniochaetales (0.07%), Glomerellales (0.07% – Colletotrichum gloeosporioides).

Pezizomycetes представлены исключительно Pezizales (6.32% – Ascobolus spp., Scutellinia vitreola).

В Dothideomycetes (4.04%) идентифицированы из порядка Pleosporales (3.69%) Didymella aurea, Preussia flanaganii, Alternaria iridiaustralis, Bipolaris eleusines), в Capnodiales (0.28%) не удалось идентифицировать таксоны, Botryosphaeriales (0.07% – Phyllosticta paracapitalensis).

В Eurotiomycetes (2.63%) преобладают ОТЕ из Chaetothyriales (1.70% –Phialophora cyclaminis), Onygenales (0.93% – Chrysosporium pseudomerdarium).

Leotiomycetes (0.49% ОТЕ) представлены только Thelebolales – Pseudogymnoascus roseus, P. appendiculatus, Pseudeurotium bakeri.

В Mortierellomycota обнаружены ОТЕ только из Mortierellomycetes (1.28%), в порядке Mortierellales определены виды Mortierella polygonia, M. gamsii, Mortierella sp., M. alpina.

В Chytridiomycota (доля ОТЕ Chytridiomycetes 0.21%) не удалось идентифицировать таксоны.

В микобиоте компоста (табл. 6) представители отдела Ascomycota составляют 30.6%, Basidiomycota – 68.8%, Mortierellomycota – 0.4%, доли Chytridiomycota, Rozellomycota, Aphelidiomycota не превышают 0.1%. Среди Ascomycota преобладали грибы класса Sordariomycetes (16.18% ОТЕ), с меньшим числом ОТЕ – Pezizomycetes (4.84%), Dothideomycetes (4.50%), Eurotiomycetes (1.77%), Leotiomycetes (0.14%). 3.2% ОТЕ не удалось идентифицировать на уровне класса.

В Ascomycota, классе Sordariomycetes большая часть ОТЕ принадлежит порядку Sordariales (15.09%), выявлены грибы Zopfiella spp., Mycothermus thermophilus, Papulaspora equi, Podospora spp. и неидентифицированные таксоны, в Hypocreales Paracremonium binnewijzendii, Fusarium concentricum, Hypomyces khaoyaiensis, в Microascales Pseudallescheria boydii, Rhinocladium lesnei. В классе Pezizomycetes (4.84% ОТЕ) порядок Pezizales представлен видами Ascobolus sp., Scutellinia vitreola.

В Dothideomycetes доминируют грибы из Pleosporales (4.36% ОТЕ) – Didymella aurea, Alternaria iridiaustralis, с низким процентом ОТЕ (<0.1%) Capnodiales, Botryosphaeriales (Phyllosticta paracapitalensis).

В Eurotiomycetes преобладают виды из Chaetothyriales (1.29%) – Phialophora cyclaminis, Onygenales составляют 0.41% – Chrysosporium pseudomerdarium. Единичные ОТЕ отмечены в Eurotiales (0.07%).

В Basidiomycota доминируют Agaricomycetes (66.37%), преимущественно из Agaricales (65.89%), с преобладанием ОТЕ Coprinellus marculentus, C. subdisseminatus, Coprinus cordisporus, с меньшим числом ОТЕ Coprinellus pallidus, Coprinus annuloporus. Меньшее число ОТЕ обнаружено в Polyporales (0.34%) – Ceraceomyces microsporus и Sebacinales (<0.07%). Tremellomycetes в Basidiomycota составляют 2.45% ОТЕ и включают Trichosporonales (2.38%) с видами Trichosporon spp., Apiotrichum scarabaeorum и Filobasidiales (0.07%) с видом Solicoccozyma terricola.

Mortierellomycota включает ОТЕ из класса Mortierellomycetes (0.41%) порядка Mortierellales – Mortierella polygonia, M. indohii.

ОБСУЖДЕНИЕ

ДНК-баркодинг позволил обнаружить грибы из отделов Ascomycota, Basidiomycota, Mortierellomycota, Chytridiomycota, Rozellomycota, Aphelidiomycota (табл. 7), культуральный метод – Ascomycota, Basidiomycota, Mucoromycota. Совпадение видов, выявленных при применении метода посева и ДНК-баркодинга, было незначительным, хотя все порядки (за исключением Saccharomycetales в Ascomycota и Mucorales в Mucoromycota), обнаруженные культуральным методом, были выявлены и с помощью ДНК-баркодинга (табл. 8). Только единичные виды были установлены одновременно обоими методами. Это базидиомицет Filobasidium wieringae из Filobasidiales, представители аскомицетов порядков Pleosporales (Alternaria spp.) и Dothideales (Aureobasidium pullulans) в Dothideomycetes, Eurotiales (Penicillium spp., Aspergillus spp.) в Eurotiomycetes. Возможно, это связано с тем, что в посевах большая часть колоний вырастает из спор, которые трудно поддаются разрушению при подготовке ДНК для генетического анализа.

Оба метода показали, что по составу грибов компост сильно отличается от исходных субстратов, а исходные субстраты отличаются между собой по комплексам обнаруженных в них грибов. Они продемонстрировали, что в соломе и на начальном этапе компостирования соломы с навозом часто встречаются аскомицеты порядков Pleosporales (Alternaria spp.) и Eurotiales (Penicillium spp., Aspergillus spp.). Метод посева выявил значительно меньше видов в грибных сообществах изучаемых субстратов, чем ДНК-баркодинг. По результатам посевов доминирующие в навозе виды Mucor circinelloides и Trichoderma atroviride отсутствуют в соломе, где наблюдается большее разнообразие эпифитных и фитопатогенных аскомицетов Alternaria spp., Aspergillus spp., Aureobasidium pullulans, Talaromyces spp., базидиомицетных дрожжей Filobasidium wieringae. Прослежены изменения в числе КОЕ и операционно-таксономических единиц таксонов разного уровня при трансформации навоза с соломой в компост. Посевами на среды показано уменьшение при компостировании численности грибов, характерных для соломы (Alternaria spp., A. pullulans, A. flavus, T. funiculosus) и обильно представленных в навозе A. fumigatus, M. circinelloides, рост числа КОЕ в компосте таких видов, как D. geotrichum, базидиомицетных дрожжей. Численность и разнообразие видов, согласно культуральному методу, уменьшались в компостируемых субстратах до 40 сут, но на завершающей стадии, в компосте, видовое богатство грибов вновь возрастало.

ДНК-баркодинг позволил выявить значительно большее число видов грибов как в исходных субстратах, так и в компосте, и рельефнее показал динамику таксономической структуры грибного сообщества при компостировании навоза и соломы (табл. 9). Она выражается в существенном увеличении доли базидиомицетов (преимущественно Coprinus spp., Coprinellus spp.) и снижении таксонов других отделов в ходе этого процесса, в первую очередь доминирующих в исходных субстратах аскомицетов. Так, в навозе доля ОТЕ аскомицетов в сообществе составляла 75.6% от всех обнаруженных ОТЕ грибов (преимущественно Sordariomycetes), в соломе 68.2% ОТЕ (преимущественно из класса Dothideomycetes). Доля ОТЕ базидиомицетов с преобладанием Agaricomycetes в навозе и соломе составила 11.4 и 31.8% соответственно. После 20 сут компостирования субстратов доли ОТЕ Ascomycota и Basidiomycota в микобиоте составляли 52.1 и 44.8%, а в компосте (через 60 сут) таксоны отдела Basidiomycota значительно преобладали (68.8%) над Ascomycota (30.6%). В работе Нехера с соавт. [24] при компостировалии навоза с добавками лигноцеллюлозных субстратов (древесной щепы, бумаги, сена, соломы) с помощью метода высокопроизводительного секвенирования наблюдали близкую смену преобладающих таксонов грибов, только на начальном этапе были зигомицеты, затем следовали аскомицеты и на конечном этапе – базидиомицеты.

Число ОТЕ отделов Mortierellomycota, Chytridiomycota, Rozellomycota и Aphelidiomycota, которые были обнаружены в коровьем навозе, уменьшилось на порядок уже к 20 сут. Оно не превышало 12 ОТЕ в компостируемых субстратах, а в компосте выявлено не более 2–3 их ОТЕ. До уровня рода и вида представители Chytridiomycota, Rozellomycota и Aphelidiomycota не идентифицированы. Это зооспоровые грибы, и логично уменьшение их численности в компосте, местообитании заметно менее влажном, чем свежий навоз.

В отличие от метода посева общее разнообразие выявленных видов грибов ДНК-баркодингом было больше в исходных субстратах, чем в компосте. В целом есть виды с разными показателями численности в компосте и в исходных субстратах. Так, Zopfiella spp., Phialophora cyclaminis, Mycothermus thermophilus присутствовали в навозе и в компосте, Didymella aurea, Alternaria iridiaustralis – в навозе, соломе и компосте. Этот факт отмечали и ранее [6, 11, 16, 24], но есть определенная специфика, связаная с особенностями состава грибов в исходных субстратах и условиями компостирования.

Помимо изменения таксономической структуры микобиоты при компостировании навоза и соломы произошли значимые перестройки в составе эколого-трофических групп грибов. Число ОТЕ термофильных видов Thermomyces lanuginosus, Mycothermus thermophiles, Remersonia thermophile несколько возросло в компосте, что можно объяснить повышением температуры субстратов в начальный период компостирования. Увеличилось число КОЕ термотолерантных видов родов Aspergillus, Talaromyces, что наблюдали и другие исследователи [11, 24]. В грибном сообществе соломы разнообразны виды родов Bipolaris, Colletotrichum, Alternaria, Pyrenophora, Stemphylium, Ramularia, Parastagonospora, Neoascochyta, Didymella, которые представляют опасность как фитопатогены или потенциальные фитопатогены. В компосте их существенно меньше или они отсутствуют. В компосте снизилось число ОТЕ и разнообразие эпифитных видов родов Cladosporium, Vishniacozyma, Filobasidium, Sporobolomyces, Aureobasidium pullulans, которые составляли типичный компонент микобиоты соломы. Базидиальный дрожжевой гриб Filobasidium wieringae, обнаруженный с помощью обоих использованных методов, широко распространен на поверхности и в тканях многих растений, откуда он попадает в компостируемые субстраты [14]. Наблюдали уведичение числа ОТЕ грибов родов Coprinus, Coprinellus, Ascobolus, Podospora, Zopfiella, или оно было сходным с таковым в навозе [18]. Zopfiella spp., имеющие значимые показатели ОТЕ в навозе, в смеси навоза и соломы на 20 сут, а также в компосте, известны и как копрофильные аскомицеты, так и ассоцианты многих растений, в том числе эндофиты [22, 40]. Coprinus spp. и Coprinellus spp. – наиболее известные как копрофильные виды, встречаются в разнообразных местообитаниях, таких как почвы газонов и пастбищ, навоз копытных, остатки трав и упавшие стволы деревьев в лесах [17]. Они развиваются на поздних стадиях разложения древесных остатков, участвуя в трансформации их в гумусовые соединения [25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сукцессонные изменения структуры комплексов грибов в субстратах при компостировании выражаются в существенном увеличении представленности базидиомицетов, способных к разрушению труднодоступных органических соединений, таких как лигноцеллюлоза, и в снижении доли доминирующих в исходных субстратах аскомицетов, использующих более простые и легкодоступные соединения.

Относительное обилие КОЕ, обнаруженное методом посева, показывает на интенсивность спорообразования того или иного вида, так как большая часть колоний при посевах на питательные среды вырастает из спор. Исходя из этого, можно отметить активное спорообразование ряда видов на определенных этапах компостирования. Это очень важно для оценки потенциальных рисков для здоровья человека, так как многие обнаруженные анаморфные аскомицеты образуют токсины, а их споры служат причиной аллергических реакций и микозов у людей с ослабленной иммунной системой [9]. Так, Aspergillus fumigatus имел высокие показатели относительного обилия, составляющие 53% после 10 сут компостирования. Этот гриб имеет уровень опасности для человека BSL-2, это основной возбудитель аспергиллезов, типичных ингаляционных микозов, сопровождающихся аллергическими реакциями разных проявлений [1]. Из воздуха эти споры благодаря малым размерам (2.5–3.0 мкм) попадают в легкие и вызывают легочные аспергиллезы. А. flavus имеет тот же уровень опасности, что и A. fumigatus, и является основным агентом аллергических бронхиальных аспергиллезов [9]. Dipodascus geotrichum имеет меньший по сравнению с аспергиллами уровень опасности BSL-1 и может поражать как кишечный тракт человека, так и вызывать бронхолегочные микозы. Виды рода Fusarium являются широко известными продуцентами токсинов (трихотеценов, зеарелона, фумонизинов). A. alternata также продуцирует микотоксины и может вызывать аллергию и астму у детей [10]. Микотоксины способны долго сохраняться в субстрате, даже после потери грибами-продуцентами жизнеспособности, и могут попадать в почву, а затем и в растения с биоудобрениями [1]. Это свидетельствует о том, что при компостировании отходов для поддержания нужных санитарно-эпидемиологических условий и качества биоудобрений необходим микологический контроль. Анализ микобиоты может внести ценный вклад при проверке готовности компоста для внесения в почву в качестве биоудобрения. Компост является не только ценным сбалансированным органическим удобрением, но и может существенно повышать супрессивность почв к фитопатогенным микроорганизмам.

Полученные данные указывают, что характеристика грибных сообществ изучаемого экотопа будет значительно полнее и детальнее при их изучении методами посева и метабаркодинга.