Почвоведение, 2023, № 3, стр. 370-379

ВВЕДЕНИЕ

Сокращение поступления парниковых газов, преобладающим из которых является диоксид углерода, в атмосферу, является одной из важнейших задач по смягчению глобальных изменений в биосфере, потепления климата [4, 35]. Мероприятия по уменьшению эмиссии СО₂ и усилению его связывания (стока) должны предварять проверенные данные по ассимиляции углерода в растительной биомассе, дыханию растений, разложению органического вещества почв и фитомассы – опада, корней и крупных древесных остатков (КДО). Недоучет потока СО₂, возвращающегося в атмосферу при разложении КДО, может привести к завышенным оценкам долговременного связывания атмосферного СО₂ в наземных экосистемах [26, 32]. Надежные данные по эмиссии СО₂ особенно важны при оценке его нетто-стоков в лесных биогеоценозах, запасы древесных остатков в которых достигают максимальных величин, в сравнении с другими экотопами [13]. Это – один из трех крупнейших по величине резервуаров углерода в лесных экосистемах, наряду с почвенным органическим веществом (ОВ) и древостоем [21]. КДО (называемые в литературе дебрисом, от английского слова “debris”) подразделяют на сухостой, пни и стволовую древесину (валежную и зависшую) с диаметром более 2.5 см [22, 31].

Наиболее весомой фракцией дебриса (КДО) являются сухостой и валеж, различающиеся по отсутствию и наличию прямого контакта с поверхностью почвы и, соответственно, с почвенной микробиотой. По степени разложения валеж и другие КДО подразделяют на 4 или 5 стадий разложения [13, 25]. При этом вклад КДО является наименее изученным среди всех известных источников формирования гумусовых веществ почв и эмиссии СО₂ в атмосферу [5].

Окислительную конверсию древесных остатков осуществляют сложные сообщества грибов, бактерий, насекомых и других организмов при доминирующей роли дереворазрушающих базидиальных макромицетов [29, 30]. Изменения в таксономической структуре сообщества организмов-деструкторов в зависимости от стадии деструкции КДО не всегда дают информацию о возможных трендах в разложении или накоплении тех или иных С- и N-субстратов [27, 31]. В то же время именно величина пула биомассы грибных и бактериальных деструкторов является параметром, определяющим скорость разложения растительных остатков, и поэтому ее надо знать для оценки интенсивности циклов биофильных элементов [15, 34]. Помимо размеров пула биомассы организмов-деструкторов, важна их активность, о которой можно судить по выделению СО₂ при разложении КДО.

Хотя работы по определению СО₂in situ все шире используются различными исследовательскими группами [15], скорости выделения СО₂ слишком вариабельны, чтобы их можно было описывать относительно простыми моделями. При этом оценка вклада КДО в потоки СО₂ напрямую наталкивается на ряд серьезных методических трудностей [26]. Изучение роли КДО в депонировании и эмиссии углерода затруднено из-за длительности их разложения (от десятков до нескольких тысяч лет), что создает сложности для постановки длительных полевых опытов. Представляется перспективной оценка активности этого процесса в образцах валежа в контролируемых лабораторных условиях, и для этого можно применить модификацию метода субстрат-индуцированного дыхания (СИД), предложенную специально для изучения скорости разложения растительных остатков [15].

Постановка таких экспериментов позволяет параллельно со скоростью разложения КДО оценить и активность денитрификации и азотфиксации. Циклы С и N в наземных экосистемах тесно сопряжены. Знание интенсивности процессов азотного цикла важно, так как обеспеченность азотом существенно влияет на пулы бактериальной и грибной биомассы и ее метаболическую активность. Наши данные [6] указывают на увеличение азотфиксирующей активности микробного сообщества КДО при сдвиге от стадий I и II к стадии III. Это дало возможность говорить о разложении КДО как о процессе с положительной обратной связью, то есть ускоряющемся во времени вследствие благоприятного сдвига в C : N питательного субстрата [25]. В то же время сложнее оценивать влияние этого процесса на углеродный цикл при угнетении азотфиксации в случае поступления азотных соединений в экосистему, например, в виде атмосферных осадков [24, 28].

Представляется логичным изучать процессы биогеохимической трансформации КДО в связке биомасса организмов-деструкторов – дыхательная активность деструкторов – конверсия органического вещества древесных остатков в направлении приобретения свойств почвенного органического вещества. Для этого определяли следующие показатели для стадий I–V разложения КДО: 1) дыхательную активность сообщества деструкторов при разложении КДО в контролируемых условиях; 2) величину биомассы деструкторов; 3) кинетические характеристики дыхания деструкторов, полученные путем математической аппроксимации кривых выделения СО₂ при разложении ОВ в составе КДО; 4) химический состав вещества КДО. Эти данные соотносили с соответствующими показателями для верхнего гумусового горизонта почвы. Предположили, что сравнительный анализ активности выделения CO₂, микробной биомассы, ее физиологического состояния, скоростей денитрификации и азотфиксации, а также химического состава КДО позволит выделить качественные сдвиги в сообществах деструкторов в зависимости от стадий разложения КДО, давая, таким образом, качественно новую информацию о закономерностях функционирования сообщества деструкторов КДО и скоростях разложения древесных остатков.

Цель работы – определение активности выделения диоксида углерода, азотфиксации, денитрификации, физиологического состояния биомассы деструкторов на разных стадиях разложения крупных древесных остатков ели и в дерново-подзолистой почве.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований. Образцы КДО ели обыкновенной (Picea abies L.), представляющих все 5 стадий разложения ее валежа, отбирали в климаксном ельнике кисличном на мониторинговых площадках в Центрально-лесном государственном природном биосферном заповеднике (ЦЛГБЗ, Тверская область, подзона южной тайги). К стадии I были отнесены КДО с отсутствием явных признаков разложения древесины, II – со слабыми признаками разложения, III – с размягченным наружным слоем и крепкой сердцевиной, IV – размягченной древесиной, включая сердцевину, V – с разложением до состояния трухи. В заповеднике ведется мониторинг продуктивности лесных экосистем, погодных условий, микобиоты и почвенных характеристик [8, 12, 13]. Образцы отобрали буром в четырехкратной повторности (с четырех разных поваленных деревьев для каждой из пяти стадий разложения). Параллельно отбирали и образцы дерново-подзолистой почвы из гумусового горизонта AEL. Свежеотобранные образцы КДО и образцы гумусового горизонта AEL хранили в течение нескольких суток при 4°C до начала инкубационных экспериментов. Химические и физические характеристики этой почвы приведены ранее [7, 11, 12].

Определяли активность выделения CO₂ (базальное дыхание) бактериями и грибами при инкубации в лаборатории образцов КДО и почвы и ряд других индексов микробиологической активности: СИД, характеризующее общую микробную биомассу; метаболический коэффициент, равный отношению базального дыхания к СИД, отражающий физиологическое состояние микроорганизмов [1]; актуальную и потенциальную азотфиксацию (после внесения дополнительного источника углерода, глюкозы) и актуальную денитрификацию.

Лабораторные эксперименты. Навески дебриса и почвы массой 1 и 5 г, соответственно, помещали в 120 мл герметичные стеклянные флаконы с резиновыми пробками перед началом предынкубации. Прежде чем начать определения базального дыхания и микробной биомассы, образцы подвергали предварительной инкубации (акклиматизации) в течение 3 сут при 22°С и 60% полной влагоемкости (для горизонта AEL абсолютная влажность составляла 29%, для материала КДО – свыше 100%) с целью активизации микробного сообщества [19]. Основную инкубацию начинали немедленно по окончании предварительной и проводили при тех же величинах температуры и влажности. Скорости выделения углекислого газа определяли по накоплению за определенные промежутки времени, периодически отбирая газовые пробы с последующим определением концентрации СО₂ на инфракрасном газоанализаторе IRGA Li-820 (LiCor, США), с последующей вентиляцией атмосферы внутри сосудов в течение 30 мин. Влажность поддерживали периодическим (2–3 раза в месяц) внесением необходимых количеств деионизированной воды.

Эмиссию СО₂ при разложении органических веществ КДО и почвы (гумусовый горизонт AEL) (базальное дыхание микроорганизмов, разлагающих эти субстраты), нормированную на начальное содержание углерода (C–CO₂(t)/C₀), аппроксимировали с помощью одинарной экспоненты с константой:

где k₁ – константа скорости разложения лабильного пула; A₁ – доля лабильного пула, A₂ – доля устойчивого пула; при этом A₂ = 1 – A₁. При разложении органического вещества КДО пул А₂ характеризует закрепление ОВ опада в виде устойчивых продуктов гумификации [2, 17]. При разложении ОВ почвы и КДО пул А₂ рассматривали как стабильное органическое вещество почвы, не подвергающееся разложению в ходе инкубации. Длительность инкубации составила 627 сут.

Запасы микробной биомассы в почве и в крупных древесных остатках определяли методом СИД, разработанным для почв Андерсоном и Домшем [14]. Метод СИД основан на определении начального дыхательного отклика почвенного микробного сообщества в первые 2–4 ч после внесения глюкозы. Глюкозу вносили в образцы почвы (в дозе 4 мг C/г почвы) и КДО (36 мг C/г КДО). Концентрация глюкозы для образцов КДО была увеличена на порядок, чтобы вызвать в них достоверный дыхательный отклик [15]. Объем вносимого раствора подбирали с таким расчетом, чтобы влажность образцов не превышала 70% полной влагоемкости. Коэффициенты пересчета от измеряемых величин СИД к величинам запасов углерода биомассы в разлагающихся КДО пока еще не установлены экспериментально. Поэтому использовали интенсивность СИД, а не приведенные величины микробной биомассы. Ведь в случае, если пересчетные коэффициенты одинаковы для всех стадий разложения КДО, относительные величины СИД будут не менее информативными, чем величины биомассы. Если пересчетные коэффициенты разные, необходимы дополнительные уточняющие исследования для их определения.

Углерод и азот почве и крупных древесных остатках, а также изотопное соотношение ¹³С определяли на масс-спектрометре Delta plus IRMS (Thermo Fisher Scientific, Германия).

Определение актуальной активности азотфиксации проводили ацетиленовым методом [10]. Навески почвы и дебриса разной степени разложения КДО (1.0 г) помещали в пенициллиновые флаконы объемом 13 мл в шестикратной повторности. Флаконы закрывали резиновой пробкой. В 3 флакона из каждого образца вводили ацетилен (1 мл) для измерения азотфиксации, оставшиеся 3 флакона использовали для определения эндогенного выделения этилена (контроль). Флаконы инкубировали в термостате при 28°С в течение 1 сут. Шприцем отбирали пробу (1 мл) и определяли количество образовавшегося этилена на газовом хроматографе Кристалл-2000 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором и колонкой, заполненной Porapak N 80/100 (длина колонки 1 м, внутренний диаметр 3 мм, газ-носитель гелий).

Определение потенциальной активности азотфиксации проводили при помощи одного из вариантов ацетиленового метода [10]. Навески КДО разной степени разложения (1.0 г) и почвы помещали в пенициллиновые флаконы объемом 13 мл, добавляли раствор глюкозы (в расчете 1% глюкозы от массы навески). Флаконы закрывали резиновой пробкой, вводили ацетилен (1 мл) и инкубировали в термостате при 28°С в течение 1 сут. Отбирали пробу (1 мл) и определяли количество образовавшегося этилена. Измерение проводили на газовом хроматографе Кристалл-2000 (Россия). Активность азотфиксации выражали в нмоль С₂Н₄/(г сут).

Для определения актуальной денитрификации навески дебриса – КДО (1.0 г) и почвы помещали в пенициллиновые флаконы, герметично закрывали резиновыми пробками и продували аргоном в течение 1 мин, вводили 1 мл ацетилена и инкубировали при температуре 28°С. Измерение концентрации закиси азота проводили в трехкратной повторности на 5-е сут на газовом хроматографе Кристалл-2000 (Россия) с детектором электронного захвата и колонкой, заполненной Porapak N 80/100 (длина колонки 1 м, внутренний диаметр 3 мм, газ-носитель азот). Объем вводимой пробы 1 см³ [10].

Статистическую обработку данных результатов проводили при помощи программы Statistica 6. Скорость выделения углекислого газа определяли в четырехкратной повторности. Скорости процессов азотного цикла исследовали в трехкратной повторности. Каждая повторность для почвы или КДО представляла смешанный образец, приготовленный из пяти малых образцов; расстояния между точками отбора малых образцов не менее 1 м. Группировку по достоверности различий определяли методом Тьюки при P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Активность базального дыхания, биомасса и метаболический коэффициент сообщества деструкторов на разных стадиях разложения КДО. Данные, обобщенные в табл. 1, дают представление об активности грибных и бактериальных деструкторов в ходе последовательных пяти стадий разложения КДО. Максимальные значения базального дыхания выявлены для стадий III и IV. К конечной стадии (V) активность разложения КДО снижалась, и активность эмиссии СО₂ практически не отличалась от таковой на начальном этапе (стадия I). Наибольшие величины СИД (соответственно и биомассы деструкторов) установлены в образцах КДО на стадии разложения IV. Эта же стадия деструкции КДО характеризовалась интенсивным базальным дыханием (около 20 мкг С–СО₂/(г ч)) и максимальной из всего ряда пяти стадий относительной величиной вклада лабильного углерода в общий пул разлагаемых С субстратов (около 2/3). Интенсивность СИД в почве (14 мкг С–СО₂/(г ч)) не отличалась от таковой для сообществ деструкторов КДО стадий I, II и V. То есть только по данным об активности СИД можно было бы сделать ложный вывод о “сходстве свойств” сообществ деструкторов на ранних стадиях разложения КДО и почвы. Это служит дополнительным аргументом в пользу комплексного изучения свойств экосистемы с привлечением максимально доступного количества индексов активности, качества, устойчивости и т.д. [2].

Метаболический коэффициент – один из широко используемых индикаторов экологической устойчивости/нарушения в экосистемах – был высоким на ранних стадиях разложения КДО, достигая максимума (0.78) на стадии III. К стадиям IV и V он значительно (примерно вдвое) уменьшался, при этом все еще не достигая значений, характерных для биоты почв (0.14). Иначе говоря, по этому показателю сообщества деструкторов КДО приобретают черты почвенного сообщества, или, учитывая разницу в величинах qCO₂, почти почвенного. Маловероятно, что высокое значение метаболического коэффициента на ранних стадиях разложения КДО по сравнению с таковым для почвы объясняется каким-то природным стрессом [1, 18]. Скорее, его следует отнести на счет неполного отклика на внесение глюкозы деструкторов КДО, учитывая большое разнообразие медленнорастущих видов именно на ранних стадиях их разложения [24].

Константы разложения лабильного пула ОВ и величины δ¹³С на разных стадиях разложения КДО. Данные долговременного инкубационного эксперимента по определению кинетики разложения ОВ КДО и почвы показали, что константы разложения лабильного пула ОВ варьируют для КДО в пределах примерно одного порядка – от 0.71 × 10^–3 (стадия V) до 2.90 × 10^–3/сут (стадия II). Величины доли лабильного пула ОВ – A₁ находятся в интервале от 9.4% (стадия I) до 65.9% (стадия IV разложения КДО). Для почвы кинетические константы были внутри диапазона значений для разных стадий разложения КДО, составляя 3.21 ×  10^–3/сут и 17.4% для А₁ соответственно. То есть гумусовый горизонт подзолистой почвы характеризовался относительно высокой константой разложения ОВ и невысокой долей лабильного пула С в составе почвенного ОВ. По имеющимся данным по разложению растительного опада в хвойных лесах можно предполагать, что, наоборот, кинетика разложения ОВ в почве должна быть менее интенсивной, чем у растительных остатков [2]. Вероятно, это было связано с особенностями разложения крупных древесных остатков: а) более медленным разложением древесины по сравнению с фракциями опада, обогащенными низкомолекулярными легкоразлагаемыми субстратами (листва, хвоя, кора, тонкие корни); б) более медленным освоением организмами-деструкторами больших объемов стволовой древесины (особенно на ранних стадиях) по сравнению с более тонкими ветвями, даже в случае сходного химического состава; в) повышенной концентрацией в КДО хвойных деревьев фенолсодержащих веществ, обладающих микробостатическими или микробоцидными свойствами [33].

Еще одной интересной особенностью разложения КДО было значимое (на 1.3‰) уменьшение содержания тяжелого изотопа ¹³С в составе органических веществ в ряду стадий I–IV – с ‒25.0 до –26.3‰. На стадии V уровень обогащения органических веществ тяжелым изотопом ¹³С снизился до такой же величины, что и в собственно почвенном ОВ (–26.9‰). Это хорошо согласуется с литературными данными. В работе Чена с соавт. [20] показан примерно такой же диапазон сигнатур для КДО (–27.4…–25.4‰), как и в настоящем исследовании. Они наблюдали, как было установлено и в наших экспериментах, лишь незначительные изменения в содержании ¹³С на ранних стадиях разложения КДО, а резкое уменьшение (на 1.6‰) – только при переходе от стадии IV к V. Значения сигнатур для почвы и растительных субстратов являются результатом усреднения δ¹³С для разнообразного набора органических веществ как с высоким (пектины, сахара, аминосахара, гемицеллюлоза), так и низким (целлюлоза, лигнин, липиды) относительным содержанием изотопа ¹³С, а также разных величин δ¹³С для тех или иных таксонов организмов-деструкторов [20]. Поэтому величина δ¹³С является важным показателем для характеристики сходства и различий органического вещества в компонентах экотопов.

По совокупности характеристик биоты деструкторов и органического вещества можно сделать вывод о том, что между стадиями разложения КДО III и IV происходит наиболее существенное (критическое) их изменение (рис. 1). Это выразилось в уменьшении по сравнению с ранними стадиями разложения КДО величин метаболического коэффициента и константы разложения k₁; в значимом уменьшении δ¹³С (фактически до уровня почвенной сигнатуры); в увеличении СИД, базального дыхания, доли доступного углеродного субстрата (А₁) в составе разлагаемого ОВ. Тем не менее, даже на последней стадии разложения органическое вещество КДО обладает меньшей устойчивостью, чем органическое вещество дерново-подзолистой почвы. Об этом можно судить по величинам констант разложения ОВ, скоростей дыхания организмов-деструкторов, доли лабильного пула С [2]. Константа разложения ОВ для почвы превышала таковую для стадии V примерно в 4.5 раза, а скорость базального дыхания и пул лабильного органического углерода, наоборот, были меньше примерно в 4 и 2.5 раза соответственно.

Активность азотфиксации и денитрификации для сообщества деструкторов КДО. В отличие от выделения СО₂ максимальная активность азотфиксации наблюдалась на более ранней стадии разложения II, при этом наибольшая биомасса микроорганизмов, дающих отклик на внесение легкоразлагаемого субстрата (глюкозы), сформировалась на стадии IV (табл. 2).

В ряду стадий разложения КДО от I до V было выявлено уменьшение соотношения C : N с 1274 (I) до 152 (V), то есть примерно на порядок. При этом различия между С : N в живой (здоровой) древесине и в КДО стадии разложения I были статистически недостоверными (соотношение C : N в здоровой древесине ~1330, данные не показаны в табл. 2). В целом в ряду стадий разложения с I по V содержание азота в разлагающихся КДО в расчете на их единицу веса увеличивается на порядок. Максимальное относительное увеличение содержания азота происходило при переходе от стадии IV к V (в 3.4 раза). При переходе от стадии II к III относительное содержание азота увеличивалось в 1.8 раза.

Данные по динамике изменения как содержания N как такового, так и соотношения C : N в КДО, во-первых, вполне соответствуют известным трендам на относительное обогащение органического вещества азотом при гумификации [9]; во-вторых эта тенденция хорошо согласуется с феноменом усиления азотфиксации на стадии разложения III [16, 25]. Финские авторы обнаружили, что для стадии III в большинстве случаев характерен максимум и в количестве копий nifH генов, и в потенциальной активности азотфиксации. В настоящем исследовании величины как актуальной, так и потенциальной азотфиксации были максимальными уже на стадии II; кроме того, выделяется и второй (дополнительный) пик активностей азотфиксации для сообщества стадии IV. Такое расхождение можно объяснить следующими причинами: 1) нестрогой привязкой максимума к стадии разложения, тем более что стадии определяются органолептически, то есть с высокой степенью субъективизма; 2) различиями в экофизиологических условиях (температурно-влажностный режим, таксономическая структура сообщества деструкторов, различия в содержании азота [35]).

Возможно, привязка максимума азотфиксации к стадиям II–III связана с началом продукции CH₄, который окисляется метанокисляющими бактериями, являющимися в то же время и азотфиксаторами [25]. Кроме того, в азотфиксации могут принимать участие и археи-метаногены, ведь при достаточном уровне влажности быстрое потребление грибами кислорода может приводить к созданию локальных анаэробных условий и развитию анаэробной группировки прокариот, в том числе, и метаногенов [3]. Для разложения КДО ели обыкновенной финскими авторами была показана взаимовыгодная кооперация между грибами-деструкторами, продуцирующими метан, и метанотрофными бактериями, играющими роль азотфиксаторов при разложении древесины. Согласно этой гипотезе, дефицит азота может восполняться за счет этой синергии [25]. В работе канадских авторов максимум потенциальной активности азотфиксации приходился на стадию III [16]. В то же время прямую корреляцию между обилием генов nifH и активностью азотфиксации удается обнаружить не всегда [25].

Активность денитрификации возрастала в ряду стадий разложения КДО от I по V, достигая к стадии V величин, сходных с таковой в почве. Вероятно, это связано с усилением почвенных свойств к стадии разложения V и, соответственно, с увеличением потребности в регулировании относительного избытка азота за счет газообразных потерь N в процессе денитрификации, то есть именно таким способом, который присущ микробиоте почв.

Что касается границы качественного перехода между КДО и почвой, то по дыхательной активности, величине метаболического коэффициента (см. выше), величинам активности азотфиксации и денитрификации, полученным в настоящем исследовании и известным по литературным данным [16, 23, 25], можно условно говорить лишь о постепенном, сложно регулируемом процессе перехода на протяжении II, III и IV стадий. Резкий переход (более чем троекратное уменьшение) между стадиями III и IV наблюдается только для соотношения C : N в составе КДО.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В серии лабораторных экспериментов изучены особенности процессов циклов углерода и азота при разложении крупных древесных остатков (КДО валежа ели). Гипотеза о том, что сравнительный анализ активности выделения CO₂, микробной биомассы, ее физиологического состояния, скоростей денитрификации и азотфиксации в образцах валежа ели, а также химического состава этого валежа позволит выделить качественные сдвиги в сообществах деструкторов в зависимости от стадий разложения КДО, оказалась верной. По уменьшению величины метаболического коэффициента, константы разложения k₁, сигнатуры δ¹³С, а также по увеличению СИД микробной биомассы, базального дыхания, доли доступного С субстрата в составе разлагаемого ОВ, можно сделать вывод о том, что на границе между стадиями разложения КДО III и IV происходит наиболее существенное изменение свойств КДО и, видимо, сообщества их деструкторов. Основной поток эмиссии СО₂ при разложении КДО ели обыкновенной также связан со стадиями разложения III и IV. В отличие от эмиссии СО₂, максимальная активность азотфиксации наблюдается на более ранней стадии II, а наибольшая биомасса организмов, дающих отклик на внесение легкоразлагаемого субстрата (глюкозы), формируется на стадии разложения IV. По величинам активности азотфиксации и денитрификации можно условно говорить о постепенном, сложно регулируемом процессе приближения свойств КДО и соответствующих бактериальных и грибных сообществ на протяжении стадий II, III и IV к таковым для почвы. Резкий переход (более чем троекратное падение) наблюдается только для соотношения C : N в составе КДО между стадиями разложения III и IV. На стадии разложения V эмиссия СО₂ существенно снижается. Тем не менее, даже на этой последней стадии разложения органическое вещество КДО отличается меньшей устойчивостью, чем органическое вещество подзолистой почвы.