Почвоведение, 2021, № 9, стр. 1124-1132

ВВЕДЕНИЕ

Структура порового пространства вокруг корней имеет большое значение для роста и развития растения, обеспечения питательными веществами, формирования гидрофизических свойств почвы, газопроницаемости и среды обитания микроорганизмов [6, 20]. Требования растений к почвенным условиям могут выражаться через такие физические параметры, как плотность, объемное распределение пор по их диаметрам и соотношение воды и воздуха внутри пор. Известно, что растения хорошо развиваются в почве с плотностью в диапазоне от 1.15 до 1.45 г/см³ и пористостью в диапазоне от 45 до 50% [1]. Однако отмечено, что корневые волоски увеличивают агрегацию почвы [11] и тесно связаны с формированием ризосферы [7]. Структура порового пространства также может определять биоразнообразие микробного сообщества. В частности, такой параметр, как связность пор был предложен в качестве объяснения биоразнообразия микроорганизмов в почве [6]. Отмечалось, что агрегаты с большей площадью поверхности и большей пористостью наиболее благоприятны для развития микробиоты [18].

Цель работы – исследовать процесс формирования корневой системы ячменя, визуализированный с помощью метода рентгеновской компьютерной микротомографии, и соответствующие количественные изменения физических параметров структуры почв и бактериального ценоза прикорневого пространства в ходе прорастания семени.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Для проведения эксперимента создавалась искусственная модель семенного ложа из агрегатов двух типов почв:

– чернозема южного (Calcic Chernozem – WRB) [9]. Место отбора проб – Соль-Илецкий район, Оренбургская область 51°58′12″ N, 55°19′15″ E. Почва отнесена к тяжелосуглинистой по содержанию физической глины (<0.01 мм) – от 51.8 до 59.1%;

– дерново-подзолистой почвы (Albic Glossic Retisols, Loamic, Cutanic – WRB) [9]. Место отбора проб – Московская область, с. Ельдигино 56°07′23″ N 37°48′16″ E. Почва отнесена к тяжелосуглинистой по содержанию физической глины (<0.01 мм) – от 51.8 до 59.1%.

В пластиковые бюксы, объемом 3 см³, прозрачные для рентгеновских лучей микротомографа и обладающие минимальной степенью поглощения, сопоставимой с водой, помещались почвенные агрегаты (5–3 мм) таким образом, чтобы создать 2 слоя, различающихся по плотности почв. Нижний слой утрамбовывался поршнем до плотности 1.2 г/см³, верхний – состоял из агрегатов и не уплотнялся дополнительно (равновесная плотность – 0.7 г/см³). На границе слоев располагалось семя ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Михайловский.

Предварительно для исследуемых семян устанавливались значения всхожести (она составляла 92%) и энергии прорастания составляли (61%) в соответствии с требованиями методики ГОСТ [3, 4]. Внутри бюкса на протяжении всего эксперимента поддерживалась оптимальная влажность, близкая к наименьшей влагоемкости (НВ). Растения первоначально поливали сверху, избыток гравитационной воды свободно стекал через воронкообразное отверстие, после чего добавляли по 0.5 мл каждые 48 ч для поддержания воды на уровне, близком к НВ. Контроль влажности проводился с помощью взвешивания образцов. Температура в помещении составляла 26°С, прорастание семян происходило в условиях темноты.

На протяжении периода прорастания с первых по седьмые сутки через равные промежутки времени проводилась томографическая съемка с помощью рентгеновского микротомографа Bruker Sky Scan 1172G (Бельгия). Настройки съемки и реконструкции для образца данного типа и диаметра неоднократно опробованы в ряде аналогичных исследований [8, 12, 15, 19], но в данном случае они скорректированы в сторону ускорения процесса съемки из-за быстрого роста корней. Время съемки для одного сегмента занимало 10 мин. В процессе реконструкции и воссоздания объемной структуры с четко различимыми рентген-контрастными фазами удалось разделить почву, поровое пространство и биологические объекты (зерно с проростком и корнями). Реконструкция – отдельный этап томографического исследования, при котором теневые проекции пересчитываются в набор горизонтальных томографических срезов по заранее выставленным настройкам. В процессе модельного эксперимента получено около 2000 томографических срезов для каждого образца, с разрешением 16.1 мкм и размером 1000 × 1000 пикселей. В микротомографах SkyScan вертикальное разрешение равно горизонтальному, что позволяет сгенерировать вертикальные томографические срезы без математического пересчета. Цифровые шумы скорректированы программными фильтрами (Median, Smoothing). Автоматическая сегментация фаз в таких условиях оказалась частично работоспособной – методом Оцу [13] можно успешно сегментировать только почву. По этой причине в исследовании использована ручная сегментация, что с высокой степенью достоверности позволило разделить перечисленные выше рентген-контрастные фазы.

Помимо визуализации объемной структуры проросшего семени рассчитывали объем семени и корней на каждом этапе исследования при помощи программного обеспечения Bruker CT analyzer (CTan), а также общую пористость почвы.

Состав микробного сообщества реконструировали по микробным маркерам (жирным кислотам и их производным – жирным гидроксикислотам и альдегидам), которые определяли после кислого метанолиза почвенных образцов молекулярным методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС). Анализ проводили на ГХ-МС системе “HP-5973 Agilent Technologies” (США). Подробно методика анализа описана в [14, 17]. Анализировали следующие образцы: контрольный – исходная почва, в которой не производилось выращивание ячменя; почва из образцов с прорастающим семенем ячменя на пятые и седьмые сутки. Измерения проводили в трехкратной повторности. Образцы, в которых проводился отбор проб для микробиологического исследования разбирались. Отделялось около 1.5 г почвы в зоне корней. В основном это были агрегаты, которые пронизаны корнями. Воздушно-сухой образец растирался в фарфоровой ступке пестиком с резиновым наконечником. Из этой почвы отбирались навески для микробиологичсекого анализа.

Определение влажности в образцах проводилось на приборе анализатор влажности МХ-50 (Япония), термогравиметрическим методом.

Содержание органического углерода определялось на экспресс-анализаторе АН-7529 (Измеритель, Беларусь) методом сухого сжигания в потоке кислорода. Определение плотности твердой фазы – пикнометрическим методом, определение плотности агрегатов методом парафинирования [5]. Гранулометрический состав почвы – методом лазерной дифракции Analysette 22 (Fritsch, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 1 представлены некоторые свойства исследуемых почв. По содержанию органического вещества обе почвы относятся к малогумусным.

На рис. 1 показано томографическое изображение контрольного образца модели семенного ложа без семени в вертикальном срезе. Отчетливо различимы рыхлый надсеменной и уплотненный подсеменной слои. Были рассчитаны значения томографической пористости, которые составили для черноземной почвы для контрольного образца – 34.9%, в образце на пятые сутки – 19.7%, на седьмые сутки – 24.1%, для дерново-подзолистой почвы для контрольного образца – 37.8%, в образце на пятые сутки – 37.8%, на седьмые сутки – 38.2%.

Рис. 1.

Томографическое изображение модели семенного ложа в вертикальном срезе: А – чернозем южный, тяжелосуглинистый, Б – дерново-подзолистая тяжелосуглинистая почва.

На рис. 2 изображена визуализация объемной структуры проросшего семени в черноземе южном. В самом низу образца корни упираются в часть лизиметрической установки для сбора воды, которая имеет форму воронки. На третьи сутки корневая система только начинает формироваться (объем составляет 14%), к седьмым суткам он увеличивается в 3 раза (45%). При этом доля семени уменьшается почти в 2 раза (с 81 до 42%). В дерново-подзолистой почве энергия прорастания больше – на третьи сутки объем корней занимает уже 22%, увеличиваясь к седьмым суткам практически в 3 раза (до 61%). При этом доля семени уменьшилась при прорастании в дерново-подзолистой почве немного более чем на половину (с 50 до 31%).

Рис. 2.

Томографическая объемная реконструкция прорастающего зерна ячменя на плотном зерновом ложе: А – на третьи, Б – на седьмые сутки.

Таким образом, несмотря на близкие значения плотности двух исследованных почв и плотности их твердой фазы, дерново-подзолистая тяжелосуглинистая почва оказалась более благоприятной для начальных этапов прорастания семени ячменя, при этом корневая система в обеих почвах к седьмым суткам увеличивает свой объем в 3 раза. Однако потери доли семени в дерново-подзолистой почве меньше, чем в черноземе.

Основной тренд развития, прослеживающийся на всем этапе роста растения, – корни успешно осваивают почвенное пространство, почвенное сложение не оказывает определяющего влияния. Биологические программы роста и необходимость освоения пространства, заложенные в семени, в начальный период, по-видимому, играют главенствующую роль. Это подтверждает график распределения соотношения толщины корней и основных диапазонов пор. Как видно из рис. 3, наибольший объем порового пространства представлен порами <0.17 мм, тогда как наибольшая доля объемов корней сосредоточена в диапазоне от 0.17 до 0.27 мм, что указывает на способность корней прорастающего семени изменять поровое пространство почв, формировать собственные пути для развития корней диаметром от 0.1 до 0.24 мм.

Рис. 3.

Соотношение распределений объемов пор почвы (1) и корней (2) по диаметрам на седьмые сутки в дерново-подзолистой почве.

Для того, чтобы определить, какой биологический фактор играл главенствующую роль на разных этапах прорастания, в двух почвах определили динамику их ризосферного микробного сообществa.

В составе сообществ ризосферы методом ГХ-МС реконструировано 39 (в черноземе) и 37 (в дерново-подзолистой почве) бактериальных видов, принадлежащих к пяти филумам – Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Cyanobacteria. Видовой состав и численность микробного комплекса представлен в табл. 2.

По биоразнообразию наиболее многочисленно был представлен филум Proteobacteria. Далее по количеству видов следовали Actinobacteria и Firmicutes (рис. 4, А) в черноземе и Bacteroidetes в дерново-подзолистой почве (рис. 4, Б). Исходя из экологических принципов, это свидетельствует о том, что именно эти филумы были наиболее устойчивы и адаптационно пластичны. Наиболее отличался в двух почвах по количеству видов филум Firmicutes, который в дерново-подзолистой почве был в 2 раза меньше, чем в черноземной.

Рис. 4.

Биоразнообразие бактерий (%) в филумах: А – чернозем южный, тяжелосуглинистый, Б – дерново-подзолистая тяжелосуглинистая почва.

Кроме того, был проведен анализ динамики таксономического состава микробиологического сообщества. По мере роста семени в черноземной почве происходит увеличение количества анаэробных видов из разных филогенетических групп (рис. 4), в том числе тех, для которых известна способность гидролизовать целлюлозу в анаэробных условиях (табл. 2). В частности, об этом свидетельствует существенное увеличение численности в черноземном образце облигатно анаэробного вида Desulfovibrio sp. с такой ферментативной активностью [16]. По-видимому, уменьшается количество кислорода, увеличивается содержание углекислого газа (изменяется окислительно-восстановительный потенциал) и доминантными в процессе разрушения оболочки становятся анаэробы. Об изменении газового режима в сторону увеличения содержания СО₂ в образцах с черноземом свидетельствует рост численности таких видов, как Anabaena sp. – анаэробной фототрофной бактерии, то есть осуществляющей анаэробный фотосинтез и Bifidobacterium sp. – анаэроба, требующего высокого содержания (10%) СО₂ в среде. Консорциум анаэробных фототрофов с другими видами бактерий описан как взаимовыгодная ассоциация [2]. Повышено относительно других видов и содержание Propionibacterium jensenii, анаэробного вида, способного за счет выделения большого количества пропионовой кислоты изменять pH среды, что определяет его антифунгальные свойства [10] и, следовательно, регулирующую роль в формировании сообщества.

В образцах дерново-подзолистой почвы наблюдалось обилие численности анаэробного азотфиксатора Clostridium pasteurianum, анаэробного гидролитика Ruminococcus sp. и аэробного нитрификатора Nitrobacter sp. Увеличение этих видов свидетельствует о первоначальном разрушении целлюлозной оболочки зерна и процессов фиксации и преобразовании азота в микробиоте прорастающего семени, необходимого для формирования С/N соотношения. Наблюдалось также увеличение численности Cellulomonas sp. на пятые сутки, с последующим уменьшением на седьмые. Этот вид является представителем факультативно анаэробных целлюлозолитиков, как и другой представитель филума Actinobacteria, Pseudonocardia sp. – активный целлюлозолитик с комплексом целлюлозолитических ферментов. В таком же количестве, как и в черноземной почве, представлен и анаэробный фототрофный вид Anabaena.

Таким образом, как в черноземной, так и в дерново-подзолистой почве при прорастании семени ячменя формируется специфическое сообщество микроорганизмов, которое обеспечивает разрушение целлюлазной оболочки за счет аэробно-анаэробного консорциума бактерий, в которой первичные анаэробные виды (Clostridium pasteurianum) для дерново-подзолистой почвы и вторичные анаэробы (Desulfovibrio sp.) для черноземной обеспечивают не только разрушение оболочки, но и фиксацию азота в анаэробных условиях (анаэробный фототроф Anabaena).

Обращаясь к результатам, которые получены томографическим методом, можно связать увеличение численности анаэробных видов бактерий с существенным (в 3 раза раза) увеличением доли корней в системе семя–корневая система, что приводит к повышению выделения экссудатов корневой системой, стимулирующих развитие определенных видов микроорганизмов, которые связаны с этими органическими соединениями трофическими потребностями. С другой стороны, дыхание повышенной биомассы корней приводит к увеличению содержания углекислого газа и уменьшения концентрации кислорода. Эти физические факторы определяют изменение экологических факторов почвенной среды и соответствующего взаимосвязанного отклика микробного сообщества.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микротомография позволяет количественно охарактеризовать структуру порового пространства почвы, определив показатели пористости, диаметра и объема пор, распределение пор по размерам, а также количественно оценить параметры формирования корневой системы. Такие, как толщина корней, доля объема корней, длина корней, что весьма важно для оценки функционирования агрофизической динамической системы прорастающие корни–поровое пространство.

Корни осваивают уплотненное (до 1.2 г/см³) поровое пространство, формируя собственные ходы, при этом показатель томографической пористости к седьмым суткам в черноземе южном уменьшается с 34.9 до 24.1%, в дерново-подзолистой почве меняется незначительно с 37.8 до 38.2%.

В изученный период в составе микробного сообщества в ризосфере Hordeum vulgare L. складывается специфический гидролитический комплекс микроорганизмов, способных к активной, преимущественно анаэробной, деструкции сложных органических соединений (растительных остатков, семенной оболочки, углеводов корневых выделений) и обладающих антагонистической активностью к фитопатогенам.

Томографические и микробиологические исследования показали взаимосвязанность происходящих процессов. Первые позволили заглянуть внутрь почвы при прорастании семени, а результаты изучения динамики таксономического состава сообщества микроорганизмов дали возможность получить новые данные о формировании газового режима, порового пространства и особенностей изменения плотности почвы при посеве семян зерновых культур.