Океанология, 2023, T. 63, № 1, стр. 160-168

ВВЕДЕНИЕ

Содержание органического углерода в теле планктонных животных и взвешенных в толще воды частицах – один из фундаментальных параметров, необходимых при изучении потоков энергии на разных трофических уровнях, оценках вторичной продукции, расчетах продукционно-деструкционных характеристик планктонных сообществ и вертикальных потоков вещества в водных экосистемах. Существующие в настоящее время методы измерения С_орг с помощью автоматических CHN анализаторов и анализаторов общего органического углерода позволяют получать надежные оценки содержания С_орг в теле планктонных животных. Однако, для мелкоразмерной фракции зоопланктона (коловратки, копеподы с длиной тела менее 1 мм, а также яйца, науплиусы и младшие копеподитные стадии крупных копепод) эти анализы трудоемки, поскольку для измерения необходим отбор пробы, содержащей от нескольких десятков до сотен особей. Такие же проблемы возникают при измерении содержания органического углерода в фекальных пеллетах зоопланктона, размер которых, как правило, не превышает 1 мм. Данные по содержанию углерода в пеллетах необходимы при исследовании процесса биоседиментации, поскольку пеллеты являются важнейшим компонентом “биологического насоса” в водных экосистемах [31]. Таким образом, применение стандартных методов имеет существенные ограничения, и во многих работах используются литературные данные для отдельных объектов или зависимости содержания С_орг от веса и размера тела животных.

В 80-х годах прошлого века для измерения органического углерода в мелкоразмерной фракции пресноводного зоопланктона был предложен метод высокотемпературного сжигания (ВТС) в присутствии катализатора с использованием разработанного специально для этих целей оборудования [21, 27]. Этот метод позволял измерять до 0.01 мкг С_орг в пробах и был успешно применен для индивидуального измерения С_орг в теле разных видов коловраток и пресноводных копепод. В работе [32] этот метод был также применен для измерения индивидуального содержания С_орг фекальных пеллет морского зоопланктона. Однако, в дальнейшем метод ВТС практически не использовался в практике гидробиологических исследований, что, возможно, связано со спецификой оборудования, необходимого для проведения анализов.

Целью настоящей работы была адаптация метода ВТС для стандартных коммерческих анализаторов общего органического углерода, таких как Shimadzu TOC-VCPH, для определения содержания углерода в мелкоразмерных объектах зоопланктона.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материал для исследования был собран в 3 экспедициях Института океанологии РАН на НИС “Академик Мстислав Келдыш” (АМК) в Карское море в 2019–2021 гг. (табл. 1).

В качестве объектов для измерения С_орг были использованы яйца, науплии, первые копеподитные стадии копепод, мелкоразмерные копеподы Oithona similis, а также фекальные пеллеты, собранные сразу после поимки зоопланктона.

Зоопланктон отбирали сетью Джеди (диаметр входного отверстия 37 см, ячея фильтрующего конуса 180 мкм), облавливая верхний перемешанный слой. Сразу после поимки зоопланктон наркотизировали фильтрованной морской водой, насыщенной углекислым газом. Обездвиженных животных под бинокуляром сортировали по видам и стадиям и отсаживали в фильтрованную через GF/F фильтры. Для каждого анализа в зависимости от размера объекта отбирали от 20 до 30 экземпляров. Яйца копепод отбирали из опытов по определению продукции яиц Calanus glacialis и C. finmarhicus.

Для сбора фекальных пеллет (ФП) зоопланктон собирали специальной сетью с диаметром входного отверстия 80 см и ячеей фильтрующего конуса 500 мкм, оборудованной сетным стаканом объемом 1 л. Сразу после лова, из пробы под бинокуляром отлавливали наиболее многочисленные виды копепод (Calanus glacialis, C. hyperboreus), эвфузиид (Thysanoessa raschii) и аппендикулярий (Oikopleura vanhoeffeni). Животных инкубировали в 50–100 мл нефильтрованной морской воде при температуре –0.5°С в течение 1–2 часов. ФП собирали пипеткой со дна сосудов и нескольких часов содержали в фильтрованной через GF/F фильтры морской воде в термостатированной камере при температуре –1.5°С. Непосредственно перед анализом отобранные объекты трижды промывались в изотоническом растворе, приготовленном на основе деионизированной воды, измерялась их длина и диаметр (при увеличении ×150).

Определения С_орг проводили методом ВТС, модифицированным для измерений на анализаторе общего органического углерода Shimadzu TOC-VCPH. Модификация метода состояла в том, что исследуемые образцы биоты и ФП вводились в водном растворе непосредственно в камеру сжигания анализатора с использованием приставки для ручного ввода и микродиспенсера со стеклянным капилляром (Drummond Microdispenser). В стандартной приставке для ручного ввода было расширено входное отверстие до диаметра стеклянного капилляра. Герметичность узла ввода обеспечивалась одетой на капилляр хроматографической резиновой прокладкой. Окисление образцов происходило в сжигательной трубке прибора, заполненной платиновым катализатором, при температуре 680 °С, что обеспечивало полноту окисления пробы и существенно (на порядки) увеличивало чувствительность измерений. Перед началом каждой серии измерений проводилась калибровка прибора с использованием стандартных водных растворов гидрофталата калия. Калибровочный диапазон построенной градуировочной кривой составлял 10–5000 нг С.

Для измерения содержания органического углерода в зоопланктоне (С_зп) и ФП (С_фп), от 2 до 6 экземпляров с помощью микродиспенсера объемом 30 мкл вводили в камеру сжигания анализатора. После каждого анализа для оценки фоновых значений С_орг проводили измерение в пробе воды, отобранной из того же сосуда, в котором находились животные.

Параллельно с измерением С_фп проводилось определение содержания хлорофилла “а” в ФП (Хл_фп). 4–6 предварительно измеренных ФП после четырехкратного промывания в фильтрованной морской воде помещались в 2 мл 90% раствора ацетона и инкубировались 24 часа в темноте при температуре 4°С.

Для сравнения метода ВТС со стандартным методом в камере сжигания твердых образцов были проведены 2 серии параллельных определений. В первой было измерено содержание С_зп в копеподах Oithona similis. Из одной пробы было отобрано 20 экз. для измерения методом ВТС и 3 повторности по 90 экз., помещенных в 20 мл фильтрованной морской воды, для измерения С_зп в камере сжигания твердых образцов. Последние фильтровались на прокаленные при температуре 500°С GF/F фильтры. В качестве бланка использовали фильтры, через которые было профильтровано 20 мл фильтрованной морской воды. Измерения С_зп методом ВТС проводилось в пяти проворностях по 3 экз. в каждой. Во второй серии по такой же схеме измерялось С_фп пеллет, собранных в опытах по питанию копепод Calanus glacialis на культуре диатомовых водорослей Thalassiosira weissflogii. 5 особей четвертой копеподитной стадии C. glacialis инкубировались в 100 мл сосуде с культурой диатомовых водорослей T. weisflogii. ФП отбирались каждые 10 мин и после четырехкратного промывания в фильтрованной через GF/F фильтры морской воде содержались в термостатированной камере при температуре –1.5°С. Из отобранных ФП, 3 повторности по 70 ФП фильтровались на прокаленные при температуре 500°С GF/F фильтры для последующего измерения С_фп стандартным методом в камере сжигания твердых образцов. Измерения С_фп методом ВТС проводилось в пяти проворностях по 3 пеллеты. Одновременно отбирали ФП для измерения хлорофилла “а” (Хл “а”). Для определения С_орг и Хл “а” в культуре T. weissflogii, аликвоты культуры водорослей объемом 5 мл отфильтровались на прокаленные GF/F фильтры. Одни фильтры помещали в 5 мл 90% раствора ацетона и инкубировали 24 часа в темноте при температуре 4°С, другие – высушивали и хранили при –20°С. Концентрация С_орг измерялась на анализаторе Shimadzu TOC-VCPH. Концентрация Хл “а” в экстрактах измерялась флуоресцентным методом [17] на флуорометре Trilogy Turner Designs. Содержание Хл “а” в ФП рассчитывалось по формуле [8] Хл_фп = (Хл “а” + 1.52Феопигмент).

Все анализы были выполнены на борту судна. В работе были использованы данные о биомассе фитопланктона в единицах органического углерода (С_фит, Суханова И.Н., личное сообщение) и концентрации Хл “а” [2, 3] в слое фотосинтеза.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание органического углерода в теле планктонных животных. Содержание С_зп в копеподах Oithona similis, измеренное стандартным методом (1.11 ± 0.08 мкгС экз^–1, n = 3) и методом ВТС (1.15 ± 0.47 мкгС экз^–1, n = 5) достоверно не различалось (Манн–Уитни тест, p = 0.65). Результаты измерений С_зп в яйцах, науплиусах и в теле младших возрастных стадий разных видов копепод методом ВТС приведены в табл. 2.

Выявлена положительная корреляция между С_зп и размером животного (рис. 1), которая описывается уравнением регрессии С_зп = 4.24L^1.84, r² = 0.85, n = 46.

Рис. 1.

Зависимость содержания органического углерода (С_зп) от размера тела планктонных животных (L). L. m. – Limnocalanus macrurus, C. sp. – Calanus sp., O.s. – Oithona similis, Ps. – Pseudocalanus spp.

Содержание органического углерода в ФП зоопланктона. С_фп в ФП, отобранных в эксперименте, измеренное стандартным методом (0.16 ± ± 0.04 мкгС экз^–1, n = 5) и методом ВТС (0.22 ± ± 0.04 мкгС экз^–1, n = 3) достоверно не различалось (Манн-Уитни тест, p = 0.18). В пересчете на единицу объема, С_фп составляло 28.4 ± ± 0.40 мкгС мм^–3, Хл_фп – 0. 91 ± 0. 31 мкг мм^–3, а соотношение С_фп/Хл_фп = 31.1. Усвояемость органического углерода (U), рассчитанная с учетом соотношения C/Хл = 74.9 ± 12.3, полученного для культуры Thalassiosira weissflogii, как U = [(C/Хл – – С_фп/Хл_фп)/C/Хл] × 100 [20], составляла 58%. Близкие величины усвояемости (35–66%) были получены разными методами в опытах по питанию копепод на культурах планктонных водорослей [5, 30]. Эти данные свидетельствуют о том, что в наших опытах разрушения Хл “а” до нефлуоресцирующих продуктов в процессе пищеварения не происходило.

Содержание органического углерода в ФП, собранных в полевых условиях, изменялось от 9.4 до 102.9 мкгС мм^–3 (табл. 3). С_фп разных видов зоопланктона, пойманных одновременно (Calanus glacialis и Limnocalanus macrurus на станции 6242_2, C. glacialis и C. hyporboreus на станции 7020, C. glacialis и Oikopleura vanhoffeni на станции 7026), достоверно не различалось (Манн-Уитни тест, р = 0.17–0.46). При этом соотношение С_фп/Хл_фп для одного вида на разных станциях различалось более чем на два порядка (табл. 3).

В зависимости от концентрации Хл “а” в слое фотосинтеза, выделяются две группы значений С_фп/Хл_фп: при концентрации Хл “а” < 1 мг м^–3 , С_фп/Хл_фп изменяется в широком диапазоне от 10 до 720, при концентрации >1 мг м^–3 диапазон изменчивости существенно уже, а значения не превышают 15 (рис. 2).

Рис. 2.

Соотношение органического углерода и хлорофилла “а” в фекальных пеллетах зоопланктона (С_фп/Хл_фп) при разной концентрации хлорофилла “а” в слое фотосинтеза (Хл “а”).

Максимальные значения (542.1 и 726.1) были получены в заливах архипелага Новая Земля на ст. 6274 (залив Медвежий) и на ст. 6905 (залив Благополучия), минимальные (3.2–5.6) – на станциях, выполненных в Карском бассейне в июне 2021 г. вскоре после освобождения акватория ото льда [11].

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенной работы показали, что измерения органического углерода в малой выборке мелкоразмерной фракции зоопланктона и ФП методом ВТС можно выполнять с использованием стандартных коммерческих анализаторов органического углерода. Наши оценки С_зп в яйцах и в теле разных видов мелкоразмерного зоопланктона сопоставимы с величинами, полученными ранее для этих видов стандартным методом на большом количестве отобранных для анализа животных (табл. 4).

Прямые измерения содержания органического углерода ФП мезозоопланктона, собранных в разных районах Мирового океана, свидетельствуют о значительной изменчивости значений С_фп, превышающей порядок величин (табл. 5).

По нашим данным, диапазон изменений С_фп в Карском море составляет 9–103 мкгС мм^–3. Высокая степень изменчивости С_фп обусловлена, главным образом, различиями в составе съеденной пищи, и, в меньшей степени, ее концентрации [32]. Для преимущественно растительноядных видов зоопланктона соотношение С_фп/Хл_фп при известной величине усвояемости может быть использовано для расчета соотношения C/Хл в съеденной пище и оценки вклада в рацион зоопланктона автотрофных водорослей [9]. Необходимым условием для такого расчета является отсутствие значительной деградации Хл “а” до нефлуоресцирующих продуктов в кишечнике планктонных животных. Возможность разрушения Хл “а” в процессе пищеварения неоднократно обсуждалась в литературе, однако, до сих пор, этот вопрос остается открытым [8, 24]. Результаты наших экспериментов свидетельствуют в пользу отсутствия заметного разрушения Хл “а” в кишечнике копепод.

Принимая среднюю величину усвояемости для растительноядного зоопланктона при питании естественной взвесью равной 70% [20], мы рассчитали соотношение C/Хл в съеденной пище на исследованных станциях. При высокой концентрации Хл “а” в весенний период (>1 мкг/л, станции 7016–7023, 7043, 83 АМК) это соотношение в среднем было равно 15.7 ± 5.2 и достоверно не отличалось от соотношения C/Хл в фитопланктоне на этих станциях (20.0 ± 1.7, Манн-Уитни тест, р = 0.20). Максимальные рассчитанные величины C/Хл пищи для этих же видов зоопланктона (1800–2400) были получены в заливах архипелага Новой Земли (станции 6274, 76 АМК; 6905, 81 АМК), где концентрации Хл “а” составляла около 0.1 мкг/л, а соотношение C/Хл фитопланктона – 23–42. По данным [4], в заливе Благополучия, характеризующимся высокой концентрацией минеральной взвеси, зоопланктон активно потреблял органо-минеральные агрегаты, образованные при участии глинистых минералов. Такие агрегаты, обладая сильно выраженными сорбционными свойствами, аккумулируют растворенные органические молекулы и бактерии и могут служить важным источником органического углерода для зоопланктона [28]. Эти результаты показывают, насколько сильно может меняться состав пищи в зависимости от трофических условий. Во время весеннего цветения фитопланктона на шельфе Карского моря в 2021 г. [11], основу рациона массовых видов копепод составляли планктонные водоросли. В заливах Новой Земли, при низкой биомассе фитопланктона, зоопланктон, по-видимому, переключается на использование альтернативных источников пищи.

Соотношение С_фп/Хл_фп, можно использовать не только для получения информации об источниках потребляемого органического углерода в конкретной ситуации, но и для оценки суточных рационов зоопланктона в естественных условиях на основании измерений содержания фитопигментов в кишечнике [8]. Обычно, для таких расчетов используется среднее для Мирового океана соотношение C/Хл фитопланктона (в большинстве случаев, равное 50) или измеренное соотношение взвешенного органического углерода взвеси и Хл “а” [например, 1, 8, 23, 33]. Расчет через С_фп/Хл_фп связан с высокой трудоемкостью сбора большого количества ФП, необходимого для измерения С_фп стандартным методом. Очевидно, что при этом существенно снижается достоверность результатов. С такой же проблемой сталкиваются и при оценке вертикальных потоков ФП и их вклада в общий поток органического углерода. При большом диапазоне изменчивости содержания органического углерода ФП из седиментационных ловушек, который составляет от 0.01 до 0.15 мгС мм^–3 [35], во многих работах [например, 17, 19, 22, 35, 36] для расчетов принимаются средние величины С_фп, полученные в разных районах. Высокая чувствительность метода ВТС дает возможность более точно оценить роль ФП разного происхождения в вертикальном переносе взвешенного органического углерода и проследить изменения потока ФП на разных глубинах [10, 32].

В целом, полученные результаты показали, что метод ВТС, адаптированный для стандартных анализаторов органического углерода, не только существенно снижает трудоемкость пробоподготовки, но и позволяет получить дополнительную информацию о масштабах изменчивости содержания органического углерода в зоопланктоне и ФП. Применение этого метода при исследовании питания зоопланктона в естественных условиях и его роли в процессах биоседиментации существенно повышает достоверность результатов.

Благодарности. Авторы благодарят команду НИС “Академик Мстислав Келдыш” за помощь в работе.

Источники финансирования. Работы выполнены в рамках госзадания № FMWE-2022-0004.