Журнал общей биологии, 2022, T. 83, № 6, стр. 419-433

Ген cyt b мтДНК

Конечное выравнивание содержало 112 последовательностей полного гена cyt b мтДНК общей длиной 1140 п.н. Выравнивание не содержало инделей, из 64 (5.6%) полиморфных сайтов 48 (4.2%) были парсимониально-информативными. Соотношение транзиций/трансверсий (R) составило 7.42. На основании данного выравнивания был описан 41 гаплотип (табл. 1). Для марала и изюбря не было выявлено ни одного общего cyt b гаплотипа.

Для анализа филогенетических отношений гаплотипов благородных оленей восточной группы подвидов была построена медианная сеть (рис. 1). На сети выделяются две большие группировки, в одну из которых вошли гаплотипы марала и гаплотипы якутских благородных оленей. Два гаплотипа из Якутии – 75YAK и 1051K (“Якутия 1”) –заняли обособленное положение на сети, тогда как гаплотипы 209K и 79YAK (“Якутия 2”) оказались близкими к гаплотипам марала 206К и 208К из диких популяций Иркутской области и Красноярского края (табл. 1, рис. 1). При этом в распределении якутских гаплотипов на сети географической закономерности не выявлено – в обеих группах встречаются гаплотипы из Центральной и Южной Якутии. Примечательно, что гаплотип 209К был найден как у благородного оленя из Якутии, так и у дикого марала из Иркутской области. У алтайских маралов из дикой природы и из обоих оленеводческих хозяйств обнаружены близкие или идентичные гаплотипы. Близкими к ним оказались гаплотипы маралов из Саяно-Шушенского заповедника (717К, 718К; табл. 1, рис. 1).

Рис. 1.

Медианная сеть гаплотипов восточных подвидов благородного оленя на основании 112 последовательностей полного гена цитохрома b (1140 п.н.). Белым цветом отмечены гаплотипы марала, черным – гаплотипы изюбря, серым – гаплотипы благородного оленя из Якутии. Черточки обозначают мутации, размер кружков пропорционален частоте гаплотипов, длина ветвей пропорциональна генетическим дистанциям.

Вторая группировка включает гаплотипы изюбря, а также несколько гаплотипов марала из оленеводческих хозяйств (“маралы 2”). При этом гаплотипы изюбря формируют две гаплогруппы – “изюбри 1” и “изюбри 2”, разделенные достаточно большим числом мутаций (n = 7), однако гаплотипы из этих двух групп часто принадлежат животным из одного и того же района (табл. 1, рис. 1). Генетическая дифференциация (Fst) оказалась наименьшей между выборками марала и изюбря и наибольшей между выборками изюбря и благородного оленя из Якутии (табл. 2).

Для выяснения филогенетического статуса благородных оленей из исследуемой выборки мы сравнили полученные последовательности с уже имеющимися данными из Генбанка. В общем выравнивании полного гена цитохрома b (1140 п.н.) 150 последовательностей (112 – полученных в ходе данного исследования, 38 – из Генбанка) обнаружено 96 (8.4%) вариабельных сайтов, 65 (5.7%) из которых были парсимониально-информативными. Соотношение транзиций/трансверсий (R) составило 4.74. Всего в выравнивании было описано 72 гаплотипа.

На основании 72 cyt b мтДНК гаплотипов было построено ML древо с использованием модели HKY+G (рис. 2). В качестве внешних групп использованы гаплотипы cyt b мтДНК лани Dama dama, пятнистого оленя C. nippon, норвежского C. e. atlanticus и бухарского C. e. bactrianus благородных оленей. При этом гаплотипы лани и благородного оленя Европы и Центральной Азии (C. e. atlanticus и C. e. bactrianus) образовали внешние группы по отношению к гаплотипам пятнистого и восточных подвидов благородного оленей. Гаплотипы пятнистого оленя образовали отдельный кластер по отношению к гаплотипам марала и изюбря с высокой (84%) поддержкой. Последние также с высокой вероятностью (97%) разделились на два кластера, один из которых включал гаплотипы большинства маралов, американских вапити и гаплотипы благородных оленей из Якутии (рис. 2). При этом гаплотипы группы “Якутия 1” (75YAK и 1051K) оказались близки к гаплотипам американских вапити, в то время как гаплотипы группы “Якутия 2” (209K и 79YAK) представляют собой отдельную обособленную кладу. Второй крупный кластер включил в себя гаплотипы изюбря, близких ему китайских подвидов, а также часть гаплотипов алтайского и семиреченского маралов (рис. 2, “маралы 2”). При этом гаплотипы маралов из одних и тех же локалитетов (из двух оленеводческих хозяйств) попали в оба кластера.

Рис. 2.

Филогенетические древо cyt b гаплотипов, построенное на основании 150 последовательностей (1140 п.н.). У каждого узла указаны значения бутстрэп-поддержки для ML алгоритмов (1000 повторов). Генетические дистанции рассчитаны с помощью модели HKY+G.

Гаплотипическое разнообразие (Ϧ) оказалось наименьшим для выборки благородного оленя из Якутии и одинаковым для выборок марала и изюбря (табл. 3). Нуклеотидное разнообразие (π) – наибольшее для выборки марала и одинаково для выборок благородного оленя из Якутии и изюбря. В целом показатели генетического разнообразия немного выше для марала, чем для изюбря, при сходных размерах выборок (табл. 3).

Микросателлиты

Мы проанализировали 112 образцов восточных подвидов благородного оленя по 12 микросателлитным локусам. Наиболее вариабельным оказался локус Haut14 (18 аллелей), наиболее консервативным – локус CSSM22 (4 аллеля). Для локуса BM1818 отмечены высокие частоты нуль-аллелей (0.41), которые спровоцировали отклонение от равновесия Харди–Вайнберга по данному локусу. Для локусов CSSM14 (0.10), BM757 (0.11) и OheQ (0.10) частоты нуль-аллелей также относительно высоки. Однако исключение локусов с высокими частотами нуль-аллелей не повлияло на характер результатов, поэтому в дальнейший анализ мы включили все локусы.

Отклонения от равновесия Харди–Вайнберга по пяти локусам были отмечены в выборке марала с Фермы 1 (BM757, BM1818, BM4107, OheQ и BMS745). Также отклонения от равновесия Харди–Вайнберга отмечены в выборке из Якутии (BM757, Haut14, Rt1 и OheQ).

Из 127 аллелей, обнаруженных в общей выборке, 40 были приватными (характерными только для определенной выборки, популяции или подвида). Было обнаружено 17 приватных аллелей для марала, 18 для изюбря и 5 для благородного оленя из Якутии.

Показатели генетического разнообразия имели самые высокие значения для выборки изюбря и самые низкие для выборки благородного оленя из Якутии (табл. 4). Внутри выборки марала особи из разных локалитетов имели сходный уровень генетического разнообразия. При этом индекс фиксации (F) был выше для выборки марала c Фермы 1, дикого марала и выборки благородного оленя из Якутии, и ниже для выборки марала с Фермы 2 и изюбря (табл. 4). Однако небольшие размеры выборок благородного оленя из Якутии и дикого марала не позволяют делать достоверные выводы об уровне инбридинга в этих популяциях.

Анализ в программе STRUCTURE с использованием метода Эванно показал наиболее вероятное разделение общей выборки на два кластера (К = 2, рис. 3а). При этом генотипы марала с Фермы 1 относились к одному кластеру с высокой вероятностью, близкой к 1, тогда как генотипы маралов с Фермы 2 и из дикой природы отличались большей гетерогенностью. Генотипы изюбря сформировали отдельный кластер, обладающий высокой гомогенностью. Генотипы из Якутии демонстрируют смешанные черты и наибольшую гетерогенность выборки.

Рис. 3.

Результат анализа выборки благородного оленя в STRUCTURE: а–в – для пяти выборок, где а – для К = 2, б – для К = 3, в – для К = 4; г – для четырех выборок (К = 3) (без Фермы 1). По оси абсцисс – генотипы, по оси ординат – вероятность принадлежности к одному из кластеров. Применена модель генетического смешения (admixture) со скоррелированными частотами аллелей в популяциях.

Метод анализа главных компонент на базе индивидуальных генетических дистанций показал отсутствие ярко выраженных группировок (рис. 4). Часть генотипов марала (преимущественно с ферм) образует несколько обособленное облако, тогда как большая часть генотипов диких маралов, а также часть генотипов с ферм, расположены довольно близко к генотипам изюбря. В распределении генотипов благородного оленя из Якутии нет географической закономерности, хотя очевидно родственные генотипы 1051к–1053к расположены рядом. При этом различия по Fst между тремя выборками выражены слабо: наименьшая дистанция между выборками марала и изюбря (Fst = 0.037, p ≤ 0.001), наибольшая между выборками изюбря и благородного оленя из Якутии (Fst = 0.051, p ≤ 0.001), различия между выборками марала и благородного оленя из Якутии имеют промежуточное значение (Fst = 0.047, p ≤ 0.001). Различия по Fst между отдельными локалитетами внутри выборки марала сравнимы с различиями по Fst между двумя подвидами и благородным оленем из Якутии (табл. 5). Самые высокие различия наблюдаются между выборками дикого марала и благородного оленя из Якутии, самые низкие – между маралами с двух ферм.

Рис. 4.

Метод анализа главных компонент на базе индивидуальных генетических дистанций. Номера на рисунке соответствуют номерам особей из табл. 1. Крестиками отмечены генотипы изюбря, белыми кружками – генотипы марала, серыми кружками – генотипы благородного оленя из Якутии.

Филогенетические отношения восточных подвидов благородного оленя России

Согласно имеющимся данным по филогении р. Cervus, восточные подвиды благородного оленя образуют отдельную кладу, которая генетически ближе к пятнистому оленю, чем к европейскому благородному оленю (Randi et al., 2001; Pitra et al., 2004; Lorenzini, Garofalo, 2015; Doan et al., 2018, 2021). Топология построенного древа согласуется с этими данными – ветвь европейского благородного оленя является внешней по отношению к кластерам пятнистого и восточного благородного оленя (рис. 2).

Анализ исследуемой выборки по гену цитохрома b мтДНК показал генетическую неоднородность, свойственную маралу (рис. 1, 2). Большинство маралов с Алтая, из Красноярского края и Иркутской области вошли в одну кладу с маралами из Китая и Монголии, а также благородными оленями из Якутии и американскими вапити. Эта клада соответствует кладе Е3 по Доан с соавторами (Doan et al., 2018), гаплотипы из которой были широко распространены на территории Евразии до максимума последнего оледенения, а также попали в Северную Америку в процессе ее заселения благородным оленем (Doan et al., 2021). Однако нами также были обнаружены гаплотипы алтайского марала (“маралы 2”), которые вошли в одну кладу с гаплотипами изюбря, причем помимо животных с ферм такие гаплотипы были найдены у семиреченского марала C. e. songaricus из Генбанка (№ HQ191429 – гаплотип 11F, № KJ025072 – одноименный гаплотип; рис. 2). Любопытно, что те же гаплотипы из Генбанка заняли аналогичную позицию внутри клады изюбрей (Е3) на филогенетическом древе в работе Доан с соавторами (Doan et al., 2018), что подтверждает положение группы “маралы 2”. При этом распределение по группам “маралы 1” и “маралы 2” не имеет географической закономерности – в разные кластеры вошли олени из одних и тех же локалитетов (алтайский марал с Ферм 1 и 2). Подобное расположение клады “маралы 2” может свидетельствовать как об интрогрессии митохондриальной ДНК марала, так и о следах предкового полиморфизма (Avise, 2000; Абрамсон, 2007). В случае благородного оленя оба сценария представляются возможными, так что вопрос требует дальнейшего изучения с использованием ядерных маркеров. Благородные олени, отнесенные к подвиду C. e. songaricus, близки алтайскому маралу C. e. sibiricus (в том числе несут общие гаплотипы), что подтверждает искусственность разделения данных подвидов (Данилкин, 1999).

Выборка благородного оленя из Якутии также демонстрируют ярко выраженную гетерогенность без географической привязки гаплотипов. Олени из группы “Якутия 1” оказались близки американским вапити (рис. 2). О сходстве некоторых якутских и американских гаплотипов уже упоминалось ранее (Кузнецова и др., 2012). В данном случае мы можем предполагать сохранение в Якутии предковых гаплотипов, которые были характерны для благородных оленей, участвовавших в колонизации Северной Америки (Doan et al., 2018, 2021), однако подобные утверждения, безусловно, требуют подтверждения на основе анализа древних образцов. Благородные олени из группы “Якутия 2” оказались родственны маралам из Иркутской области и Красноярского края (был найден один общий гаплотип), что, судя по всему, определяется географией их ареала. Так, река Лена с богатыми пойменными местообитаниями является основой для расселения благородных оленей вдоль ее русла в Южной Якутии. Она начинается западнее оз. Байкала, являющегося для них изолирующим фактором. При этом на территориях западнее Байкала обитает марал, так что долина р. Лены выступает для него в качестве естественного экологического коридора, который тянется от границ ареала далее на восток по пределам Южной Якутии. Эта часть ареала благородного оленя в пределах Южной Якутии изолирована Становым нагорьем и Становым хребтом от ареала изюбря, который распространен в бассейне Амурa. Однако эта географическая изоляция не полная, и по долинам таких рек, как Витим и Олекма, вполне возможна их естественная взаимная интрогрессия.

В целом, по мтДНК олени из Якутии ближе к маралу, несмотря на небольшие различия в генетической Fst дифференциации между благородными оленями из Якутии и обоими подвидами (рис. 1, 2, табл. 2). Это подтверждает имеющиеся данные о большем сходстве благородного оленя из Якутии и марала по морфометрии тела (Егоров, 1965; Степанова, Аргунов, 2016a), однако противоречит данным по морфометрии рогов, которые у благородного оленя из Якутии сходны с рогами изюбря (Степанова, Аргунов, 2016a).

Изюбри сформировали более гомогенный кластер, хотя исходная выборка также образовала две группы (“изюбрь 1” и “изюбрь 2”; рис. 1). Такое разделение нельзя объяснить географическими закономерностями – в разные группы вошли гаплотипы из одних и тех же районов исследования. Родственными изюбрю оказались китайские подвиды C. e. wallichi, C. e. kansuensis и C. e. macneilli, что согласуется с литературными данными (Кузнецова и др., 2012; Lorenzini, Garofalo, 2015). Несколько последовательностей редкого подвида C. e. alashanicus (alxaicus) (Северный Китай, Монголия) несли идентичный с изюбрем гаплотип, что также может свидетельствовать об искусственности его подвидового статуса.

Несмотря на общепринятость выделения подвидов марал и изюбрь, существуют сомнения в истинности этого разделения, во многом обусловленные клинальностью морфологических признаков (Данилкин, 1999). Однако, несмотря на очевидную близость этих двух подвидов, порядок ветвления на филогенетическом древе (наличие двух кластеров с высокой бутстрэп-поддержкой, где кластер изюбря является внешним по отношению к кластеру марала и американских вапити) указывает на целесообразность существующего разделения (рис. 2). Невысокий уровень Fst-дифференциации может свидетельствовать о недавнем разделении подвидов (табл. 2).

В отличие от результатов по мтДНК, микросателлитный анализ выявил отсутствие ярко выраженных группировок внутри исследуемых выборок. Анализ с помощью алгоритма STRUCTURE показал наличие двух кластеров, однако только выборки марала с Фермы 1 и изюбря показали высокую степень гомогенности (рис. 3а). При дальнейшей кластеризации выборки на К = 3 и К = 4 только выборка с Фермы 1 оставалась однородной (рис. 3б, в). Учитывая небольшое поголовье, условия содержания (огороженные вольеры, малое количество самцов, допущенных к размножению) и фактическое отсутствие потока генов, в данном хозяйстве могут сохраняться редкие аллели, не столь распространенные в популяции дикого марала, что может влиять на характер кластеризации выборки. Для того, чтобы нивелировать это влияние, мы провели кластеризацию выборки без генотипов с Фермы 1 (рис. 3г). В результате при оптимальном К = 3, выявленном с помощью метода Эванно, видно выделение трех кластеров, к одному из которых с высокой вероятностью принадлежат генотипы изюбря, тогда как генотипы марала принадлежат к другому кластеру с более низкой вероятностью. Гетерогенность, присущая маралу (особенно дикому), свидетельствует о неполной дифференциации подвидов. Якутия образует отдельный, обособленный и четко дифференцированный кластер (рис. 3г).

Как и в случае мтДНК анализа, Fst-дифференциация была ниже между выборками марала и благородного оленя из Якутии, однако в целом различия между выборками невелики, хотя и достоверны (табл. 5). Графическое представление индивидуальных генетических дистанций на плоскости с помощью анализа главных компонент подтверждает слабую дифференциацию подвидов по микросателлитным маркерам. В целом различия по микросателлитным локусам оказались гораздо менее выраженными, чем по цитохрому b, что можно объяснить вкладом самцов, которые при расселении активно перемещаются по речным местообитаниям на границе ареалов, что приводит к смешению генофонда популяций двух подвидов.

Генетическое разнообразие восточных подвидов благородного оленя России

Благородные олени из Якутии продемонстрировали наиболее низкие значения показателей генетического разнообразия внутри исследуемой выборки, как по цитохрому b, так и по микросателлитам, что объясняется невысокой численностью популяции, которая начала увеличиваться лишь в последние десятилетия (Степанова, Охлопков, 2009; Степанова, Аргунов, 2016б). Уровень гаплотипического разнообразия (Ϧ) исследуемых оленей высок (0.946; табл. 3), что характерно для восточных подвидов благородного оленя: 0.981 (Ludt et al., 2004) и 0.995 (Кузнецова и др., 2012) (табл. 3). Показатели нуклеотидного разнообразия (π = 0.010; табл. 3) низкие относительно средних значений, характерных для европейского благородного оленя (π = 0.020; Skog et al., 2009), но, видимо, это типично для восточных подвидов (π = 0.002 в среднем для пяти популяций семиреченского марала C. e. songaricus; Zhou et al., 2015).

Результаты микросателлитного анализа показали достаточно высокий уровень аллельного разнообразия (A_R) (4.562–5.891; табл. 4), находящийся в пределах характерных для благородного оленя значений (2.52–6.76) (Niedziałkowska et al., 2012; Zhou et al., 2015; Zachos et al., 2016; Golosova et al., 2021). При этом он сходен с уровнем аллельного разнообразия популяций семиреченского марала (4.13–4.78; Zhou et al., 2015) (табл. 4). Ожидаемая гетерозиготность (H_e) (0.553–0.626; табл. 4) также имела средние для благородного оленя значения (разброс средних значений от 0.258 до 0.741 для восточных подвидов благородного оленя и от 0.33 до 0.83 для западных) (Polziehn et al., 2000; Kuehn et al., 2003; Dellicour et al., 2011; Niedziałkowska et al., 2012; Krojerova-Prokešova et al., 2015; Zhou et al., 2015; Zachos et al., 2016; Golosova et al., 2021). Однако к сравнению показателей генетического разнообразия из разных исследований следует относиться с осторожностью, так как использование разных наборов микросателлитных локусов дает разные результаты.

Наблюдаемая гетерозиготность (H_o), которая для большинства выборок ниже, чем ожидаемая (H_e), и значения индекса фиксации (F) свидетельствуют о наличии определенного уровня дефицита гомозигот в исследуемых выборках (табл. 4). Мы также обнаружили отклонения от равновесия Харди–Вайнберга в двух выборках из пяти, причем в выборке марала из Фермы 1 они могут быть связаны с неслучайным скрещиванием животных в условиях мараловодческого комплекса. Отклонения от равновесия Харди–Вайнберга в выборке из Якутии могут свидетельствовать о присутствии эффекта Валунда (дефицит гетерозигот, вызванный подразделенностью популяции и фактическим отсутствием панмиксии) (Wahlund, 1928; Allendorf, Luikart, 2007).