Журнал неорганической химии, 2023, T. 68, № 3, стр. 393-400

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что ионы редкоземельных элементов (РЗЭ) не являются биометаллами, однако могут проявлять биологическую активность. Некоторые соли РЗЭ используют при лечении определенных заболеваний, радиоактивные изотопы способны оказывать антираковое действие, воздействуя на злокачественные образования [1–3]. Соединения РЗЭ могут влиять на свертываемость крови, предотвращая образование тромбов, и обладают противовоспалительными свойствами. Ионы РЗЭ не являются агрессивными при воздействии на человеческий организм, так как они не обладают окислительными свойствами, к тому же имеют гидратную оболочку, что понижает их активность [5–8].

Соли лантаноидов, их комплексы и наночастицы успешно используются при лечении костных заболеваний. Известно, что включение ионов лантаноидов в структуру гидроксиапатита делает его перспективным в инженерии костного материала, в том числе изменяет антимикробную активность. Замещение оказывает значительное влияние на структуру, растворимость и термостойкость [9–11].

При росте числа костных заболеваний в медицине ежегодно используются десятки тысяч имплантов и эндропротезов, которые делятся на два типа: биоинертные и биоактивные. Ко вторым относятся два вида материалов на основе фосфата кальция: гидроксиапатит (ГА) и β-трикальцийфосфат, которые обладают хорошей биосовместимостью, биорезорбируемостью и остеоиндуктивностью с человеческим костным скелетом. Чистый ГА, как правило, не используется в имплантатах, так как такой материал является хрупким, а также он обладает низкой степенью остеоиндукции, т.е. плохо активизирует появление новой костной ткани. Поэтому на практике используют ГА, легированный путем введения в его структуру ионов металлов, которые изменяют свойства материала, в том числе его биоактивность и биорезорбируемость [12–16].

Наночастицы ГА, легированные лантаноидами, могут использоваться в качестве люминесцентных меток и стать альтернативой органическим флуорофорам, так как они более стабильны и имеют больший срок службы. Такие материалы позволяют исследовать ткани при работе в области хирургии, костной инженерии и процессе восстановления тканей [17, 18].

Известно, что лантаноиды обладают высоким сродством к ГА. Это связано с тем, что лантаноиды (Ln³⁺) имеют близкие ионные радиусы с ионами Ca²⁺, с этим связана их биологическая активность. РЗЭ ингибируют образование остеокластоподобных клеток и процесс резорбции костной ткани. При этом лантаноиды оказывают биологическое воздействие на организм, вследствие чего подавляется рост бактерий и изменяется структура наружной клеточной мембраны, отвечающая за проницаемость клеток [2, 19].

Например, ГА, легированный La³⁺, обладает высокой прочностью, а также поддерживает адгезию остеобластов; ГА, легированный Y³⁺, является биосовместимым, поддерживает пролиферацию клеток, способствуют ускоренному росту фибробластов и лучшей адгезии остеобластов по сравнению с незамещенным гидроксиапатитом [19, 20].

Цель настоящей работы – получение и изучение гидроксиапатита, допированного ионами РЗЭ (La³⁺, Y³⁺).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез гидроксиапатита осуществляли методом мокрой химии [21]. Для приготовления исходных растворов использовали нитрат кальция Cа(NO₃)₂ и двузамещенный фосфат аммония (NH₄)₂HPO₄ квалификации “ч. д. а.”, а также водный раствор аммиака NH₄OH. Синтез проводили при 23–25°С в соответствии с уравнением:

К раствору Са(NO₃)₂ объемом 250 мл с концентрацией 0.136 моль/л добавляли по каплям (со скоростью 4.5–5.0 мл/мин) при быстром перемешивании 250 мл раствора (NH₄)₂HPO₄ с концентрацией 0.080 моль/л, в который предварительно был введен концентрированный раствор аммиака (5 мл). Затем величину рН полученного раствора доводили до 9.00 ± 0.05 и оставляли его для кристаллизации на 7 сут. Полученный осадок отфильтровывали с помощью водоструйного насоса, а фильтрат сохраняли для проведения химического анализа. Осадок промывали дистиллированный водой (V = 50 мл) и этанолом для улучшения дисперсионных характеристик, высушивали в сушильном шкафу при температуре ~110°C в течение суток, измельчали с помощью ступки и пестика и помещали в эксикатор для удаления оставшейся несвязанной воды. Далее полученный порошок переносили в маркированный бюкс и взвешивали. Синтез гидроксиапатита, замещенного ионами РЗЭ, проводили описанным выше способом с использованием неорганических солей кальция и фосфора. Ионы Lа³⁺и Y³⁺ вводили в раствор, используя хорошо растворимые соединения Lа(NO₃)₃ · 6Н₂О и Y(NO₃)₃ · 6Н₂О.

Было проведено два эксперимента: первый – введение соли Lа(NO₃)₃ · 6Н₂О, второй – введение соли Y(NO₃)₃ · 6Н₂О. Для получения гидроксиапатита с примесью РЗЭ (РЗЭ/(РЗЭ + Cа²⁺) от 1 до 5 мас. %, шаг 1%) в раствор, содержащий Са(NO₃)₂, вводили 0.1 М раствор РЗЭ в количестве, соответствующем заданному процентному содержанию.

Далее к раствору Са(NO₃)₂, содержащему также ионы РЗЭ (Lа³⁺ и Y³⁺), добавляли по каплям (со скоростью 4.5–5.0 мл/мин) раствор (NH₄)₂HPO₄ при быстром перемешивании, рН полученного раствора доводили до необходимого значения (9.00 ± 0.05) и оставляли для кристаллизации на 7 сут.

Полученный осадок измельчали с помощью ступки и пестика и помещали в эксикатор для удаления оставшейся несвязанной воды, после чего порошок переносили в маркированный бюкс и взвешивали.

Рентгенофазовый анализ полученных образцов проводили на дифрактрометре ДРОН-3 с использованием метода Дебая–Шеррера (CuK_α-излучение, λ = 0.154 нм, интервал углов 2θ 5°–60°).

Первоначальную обработку спектров осуществляли с помощью программного пакета DIFWIN 1 (https://www.updatestar.com/ru/topic/ difwin). На основе полученных дифрактограмм определяли углы брэгговских отражений, а также их относительную интенсивность. Для установления фазового состава полученных образцов применяли качественный и количественный анализ с использованием программы MATCH! 3, в которой проводили сравнение межплоскостных расстояний и относительных интенсивностей дифракционных максимумов с соответствующими значениями из картотеки для каждой фазы [22].

По дифрактограммам полученных фаз рассчитывали размеры кристаллитов по формуле Дебая–Шеррера:

где d – размер кристаллитов; k – постоянная Шеррера, коэффициент формы частиц; λ – длина волны; β – ширина пика на полувысоте; θ – угол дифракции.

На основе данных дифрактограмм рассчитывали параметры кристаллической решетки образцов с помощью программного пакета “Рентгеноструктурный табличный процессор” (RTP), сетевая база природных минералов (“Mineralogy Database”, http://webmineral.com).

ИК-Фурье-спектроскопию образцов проводили на спектрофотометре ФСМ-2202. Для получения спектров образец в виде порошка смешивали с порошком KBr в соотношении 1 : 100, далее с помощью таблетпресса получали таблетку, которую помещали в кювету спектрофотометра. Спектры фиксировали в программе FSPEC, область записи спектров – от 400 до 4000 см^–1, общее число сканирований – 32. Обработку спектров осуществляли в программе ORIGIN 2021.

Морфологию твердых фаз изучали с помощью микроскопа серии XSZ-107 и видеоокуляра TOUPCAM при 160-кратном увеличении. Микрофотографии получали с помощью программы TOUPVIEW.

Определение катионов редкоземельных металлов, содержащихся в твердых фазах синтезированных образцов, проводили методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (АЭС с ИСП) [23]. Градуировочные растворы готовили последовательным разбавлением стандартного раствора. В плазму последовательно вводили следующие растворы: нулевой, градуировочные растворы в порядке возрастания концентрации, холостой раствор и анализируемые растворы. После анализа всех растворов с помощью программного обеспечения проводили коррекцию фона.

Для изучения устойчивости образцов в электролитах их растворяли в 0.01 М HCl (рН 2) и в ацетатном буфере (рН 5.5). Процесс проводили при интенсивном перемешивании, T = 298 K, при этом фиксировали изменение концентрации ионов Сa²⁺ (рСа), а также величину рН среды на иономере И-160МИ через определенные промежутки времени (τ = 0–40 мин, через 1 мин). На основании полученных данных строили кинетические зависимости рСа = f(τ) и рН = f(τ) и рассчитывали скорости растворения образцов [24].

В надосадочных жидкостях после полного отделения твердой фазы потенциометрическим методом измеряли рН и концентрацию ионов Са²⁺. Фотометрическим методом определяли остаточные концентрации фосфат-ионов в растворе в виде молибденовой сини (РД 52.24.382-2006, нормативные документы по определению “массовой концентрации фосфатов и полифосфатов”) на приборе КФК-2.

Определение ионов La³⁺, Y³⁺ в растворе в кислой среде с арсеназо(III). Концентрацию ионов La³⁺ и Y³⁺ определяли на спектрофотометре ЮНИКО-1201 при длине волны λ = 650 нм и толщине кюветы l = 3 см, рН 1.8–2.0. Измерения повторяли трижды и по средним величинам оптической плотности строили градуировочный график d = f(c(РЗЭ)).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1а представлены дифрактограммы ГА без добавок и с добавлением ионов La³⁺. Видно, что полученная фаза является гидроксиапатитом. На дифрактограмме присутствуют рефлексы при 25.8° (002), 28.9° (210), 31.8° (211), 32.9° (300) и 34.0° (202), что подтверждает наличие фазы гидроксиапатита для образца без РЗЭ. Дифрактограммы образцов с добавлением ионов La³⁺ подобны дифрактограмме гидроксиапатита без РЗЭ, но при этом наблюдается смещение характеристических углов в сторону бóльших значений. Такое явление может свидетельствовать о процессе изоморфного замещения в структуре ГА ионов Ca²⁺ (1.14 Å) на ионы La³⁺ (1.17 Å) и, как следствие, искажении кристаллической решетки и ее параметров [11].

На рис. 1б представлены дифрактограммы чистого ГА и образцов ГА, синтезированных в присутствии ионов Y³⁺. Дифрактограммы полученных образцов подобны, т.е. представляют фазу гидроксиапатита. На дифрактограммах образцов с добавлением ионов Y³⁺ наблюдается смещение характеристических углов, что может свидетельствовать о процессе замещения ионов Ca²⁺ (1.14 Å) на ионы Y³⁺ (1.12 Å) в структуре гидроксиапатита.

На основе полученных дифрактограмм расчетным методом определены параметры кристаллической решетки синтезированных образцов (табл. 1).

Исходя из данных табл. 1, для La–ГА и Y–ГА наблюдается увеличение параметров решетки по сравнению с незамещенным ГА. Большее увеличение параметра а по сравнению с параметром с связано с тем, что ионы лантана занимают преимущественно позицию Ca(2) в структуре гидроксиапатита [1, 3]. Параметры решетки Y–ГА изменяются в меньшей степени, чем La–ГА, вследствие меньшей разницы между радиусами ионов иттрия и кальция, чем в случае иона лантана. Методом однофакторного дисперсионного анализа с использованием программы STATIC 2 установлено, что для всех замещенных образцов по сравнению с чистым ГА действие фактора статистически значимо.

По дифрактограммам с использованием формулы Дебая–Шеррера были вычислены средние размеры кристаллитов (табл. 2). Видно, что образующиеся соединения находятся в нанокристаллическом состоянии, что повышает возможность их применения в медицине, например, для адресной доставки лекарственных препаратов, а добавка ионов РЗЭ, как правило, не влияет на размеры кристаллитов синтезированных образцов. С помощью программы STATIC 2 был проведен однофакторный дисперсионный анализ, который показал, что действие фактора статистически недостоверно. Расхождение между выборками по среднему значению статистически незначимо.

Для установления группового состава синтезированных образцов была использована ИК-Фурье-спектроскопия. На рис. 2а представлены спектры синтезированных образцов гидроксиапатита без РЗЭ и с различным содержанием ионов La³⁺ и Y³⁺. Широкая полоса при 3340–3600 см^–1 относится к деформационным колебаниям группы OH^–, полоса в области 1590–1690 см^–1 характеризует деформационные колебания H–O–H структуры H₂O. Также присутствуют валентные колебания малой интенсивности в области 1360–1410 см^–1, соответствующие колебаниям связи P=O, и широкая интенсивная полоса в интервале 900–1100 см^–1, характеризующая валентные колебания связи P–O, при 550–620 см^–1 фиксируются деформационные колебания связи P–O–P. В спектре присутствуют также полосы при 880, 960 (ν₂), 1080 (ν₃), 565 (ν₄) см^–1, соответствующие колебаниям группы ${\text{PO}}_{4}^{{3 - }}.$ Следует отметить, что спектры имеют схожий вид.

В ряде ИК-спектров отмечается существование полосы в области 2300–2400 см^–1, соответствующей колебанию иона ${\text{CO}}_{3}^{{2 - }}.$ Наличие в структуре ГА карбонат-ионов связано с поглощением гидроксиапатитом в ходе синтеза углекислого газа из воздуха, вследствие этого ионы ${\text{CO}}_{3}^{{2 - }}$ могут локализоваться в кристаллической решетке в положении фосфат-ионов (В-типа). ИК-спектры всех синтезированных образцов имеют одинаковый вид, это свидетельствует о замещении именно катионного, а не анионного положения в структуре ГА.

Полученные в ходе синтеза твердые фазы исследованы методом оптической микроскопии с целью изучения их морфологии. На микрофотографиях (рис. 3а) видно, что кристаллы ГА без ионов РЗЭ имеют грани неправильной формы, наблюдаются острые сколы, но при этом частицы имеют четкий контур и небольшой разброс по размерам. Что касается образцов, содержащих ионы РЗЭ, то они, как правило, имеют менее четкий контур кристаллов. Такой контур проявляется у образцов с 5%-ной добавкой (рис. 3в, 3д), подобные изменения частиц характеризуют процессы изоморфного вхождения РЗЭ в структуру гидроксиапатита.

Для образцов, содержащих ионы РЗЭ, характерно объединение частиц, т.е. добавка РЗЭ в виде ионов способствует образованию агрегатов, этот эффект наиболее выражен для образцов с 5%-ной добавкой ионов РЗЭ. Такое поведение объясняется агломерацией частиц, имеющих некомпенсированные заряды, которая происходит при изоморфном замещении ионов кальция в структуре ГА ионами РЗЭ, имеющими заряд +3.

Методом АЭС с ИСП было определено и рассчитано содержание ионов РЗЭ в твердых образцах. На основании результатов химического анализа и АЭС с ИСП предложены структурные формулы синтезированных образцов замещенных гидроксиапатитов (табл. 3).

Видно, что ионы РЗЭ, введенные в процентном соотношении к кальцию, почти полностью переходят в твердую фазу и замещают ионы кальция в структуре гидроксиапатита, образуя тем самым легированные твердые фазы La–ГА и Y–ГА.

С помощью химического анализа были определены концентрации ионов кальция, фосфат-ионов, а также ионов РЗЭ (табл. 4). На основе полученных данных установлено, что соотношение Ca/P, являющееся важной характеристикой синтезированных образцов, уменьшается для замещенных РЗЭ ГА. Полученные методом химического анализа данные по содержанию ионов РЗЭ в растворе после отделения осадка подтверждают, что ионы РЗЭ входят в состав твердой фазы. Наблюдается также увеличение содержания ионов РЗЭ в осадке при росте их концентрации в исходном растворе.

Таким образом, соотношение Ca/P в синтезируемых соединениях уменьшается по сравнению со стехиометрическим значением, равным 1.67 и характерным для гидроксиапатита. Это подтверждает процесс изоморфного замещения ионов Ca²⁺ на ионы РЗЭ в структуре ГА. По правилу Гольдшмидта, явление изоморфизма возможно при условии, что разница между радиусами взаимозамещающихся ионов не превышает 15%. При сравнении радиусов Ca²⁺ (1.14 Å) и замещающих ионов La³⁺ (1.17 Å) и Y³⁺ (1.12 Å), взятых по Гольдшмидту, видно, что они имеют близкие значения и их разница не превышает 15%. Таким образом, можно сделать вывод, что они удовлетворяют правилу Гольдшмидта и изоморфизм для данных ионов возможен [25, 26].

Биоактивность материалов на основе гидроксиапатита является важной характеристикой, так как при растворении материала из структуры высвобождаются неорганические ионы, способствующие формированию неорганической составляющей костного матрикса, что благоприятствует формированию костной ткани. Растворение синтезированных образцов проводили в ацетатном буфере (рН 4.5) и 0.01 М растворе соляной кислоты (рН 2.0).

По полученным кинетическим кривым C(Са²⁺) = f(τ) (рис. 4) установлено, что насыщение ионами кальция происходит приблизительно на 15-й мин процесса растворения. При этом ГА, синтезированный без добавления ионов РЗЭ, обладает большей растворимостью по сравнению с образцами с добавками РЗЭ. С введением ионов РЗЭ в кристаллическую структуру ГА происходит уменьшение растворимости последнего. Это может быть связано с взаимным влиянием ионов Ca²⁺ и РЗЭ, приводящим к увеличению параметров элементарной ячейки и уменьшению их способности к растворению и диссоциации.

Кроме того, для изоморфных соединений La–ГА и Y–ГА существует энергетический выигрыш. Согласно закону диагональных рядов Ферсмана, энергетический выигрыш имеет место, если в кристаллическую решетку вместо иона низкого заряда входит такой же (или близкий) по размеру ион того же знака, но более высокого заряда. Вторая причина – поверхностная адсорбция фосфат-ионов за счет неполной компенсации положительных зарядов при изоморфном замещении.

Таким образом, синтезированные ГА, содержащие в своем составе La³⁺, Y³⁺, могут ингибировать и подавлять действие остеокластов и тем самым препятствовать разрушению костной ткани. В соответствии с этим материал на основе ГА, легированного РЗЭ, может оказывать положительное действие при его использовании в костной инженерии.

При исследовании растворимости синтезированных образцов в соляной кислоте (рН 2.0), которая моделирует активную резорбцию, наблюдаются различные зависимости. Насыщение раствора ионами кальция происходит на 10-й мин. Так, образцы ГА, легированные ионами La³⁺, растворяются с меньшей скоростью по сравнению с ГА без РЗЭ (рис. 5а), а образцы ГА с добавлением 1% Y³⁺ обладают большей скоростью растворения по сравнению с гидроксиапатитом без добавок. Исходя из этого, ГА, содержащие в структуре ионы Y³⁺ (1 мас. %), могут способствовать резорбции материала.

Обработкой кинетических данных методом подбора установлен нулевой порядок реакций растворения, характерный для гетерогенных реакций в растворе. На основании этого с использованием соответствующего уравнения были рассчитаны скорости реакций растворения [24, 27] (табл. 5).

При растворении в ацетатном буфере наблюдается общая тенденция – скорость растворения чистого ГА больше, чем ГА с добавками РЗЭ; наибольшие скорости растворения имеют La–ГА 1% и Y–ГА 1%.

При растворении в среде HCl выявлено, что скорость деградации замещенных образцов меньше, чем ГА, синтезированного без введения дополнительных ионов. Из замещенных образцов наибольшие скорости растворения характерны для Y–ГА 1%. Также для указанного процесса растворения наблюдается следующая зависимость: чем больше введено ионов РЗЭ в структуру гидроксиапатита, тем меньше скорость растворения.

При сравнении скоростей растворения в различных растворителях видно, что процесс осуществляется с большей скоростью в HCl, это связано с сильнокислой средой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполнен синтез замещенных ГА с различным содержанием ионов La³⁺ и Y³⁺ (1–5%, шаг 1%). Установлено образование замещенного гидроксиапатита La–ГА, Y–ГА с различным содержанием ионов. Показано, что увеличение концентрации РЗЭ-содержащих реагентов (1–5%) в исходном растворе приводит к росту их содержания в осадках и, таким образом, к уменьшению отношения Ca/P (1/67). Выявлено, что катионзамещенные гидроксиапатиты менее растворимы, чем нелегированный ГА. Такие соединения могут ингибировать и подавлять действие остеокластов, препятствуя тем самым разрушению костной ткани и сохраняя ее целостность. В соответствии с этим материалы на основе ГА, легированного ионами РЗЭ, могут быть использованы в костной инженерии.