Журнал неорганической химии, 2022, T. 67, № 2, стр. 148-155

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в медицине имеются различные методы лечения травм костной ткани, возникающих по разным причинам. Хрящевые и костно-хрящевые дефекты являются сложными проблемами [1–3], поэтому для восстановления нормального функционирования поврежденного участка костной ткани применяют имплантаты [4, 5] – биоматериалы, способные индуцировать регенерацию кости (предпочтительно с помощью одностадийной процедуры с целью снижения затрат и заболеваемости человека) и избегать барьеры для манипулирования клетками [6, 7].

В последнее время интерес вызывает концепция реконструкции костной ткани, основанная на использовании материалов, со временем резорбируемых в организме и замещаемых новообразованной костной тканью. Такие материалы должны быть нетоксичными и иметь необходимые для построения костной ткани ионы Ca²⁺ и ${\text{PO}}_{4}^{{3 - }}.$ С этой целью часто применяют фосфаты кальция (ФК) [8–12].

Для создания биосовместимых кальций-фосфатных материалов часто используют гидроксиапатит (ГА), который имеет сходную структуру с костной тканью и обладает биосовместимостью [13–15] и высокой устойчивостью к белкам, химиотерапевтическим препаратам и антигенам, а также способен противостоять гидролитическому разложению.

Но в связи с низкой растворимостью синтетического ГА его не используют в чистом виде в качестве имплантируемого материала [16–20]. Для повышения биоактивности ГА проводят его модифицирование биологически активными ионами, находящимися в составе природной костной ткани, что позволяет управлять растворимостью материалов на его основе [21–23] и придавать биоматериалам ряд важных дополнительных свойств.

Одним из таких ценных материалов является гидроксиапатит, допированный ионами магния (Мg-ГА) [23]. Ион магния является необходимым макроэлементом для клеток и тканей. Вследствие меньшего радиуса иона и большей энергии ионизации ион Mg²⁺ образует более прочные связи, чем ион Ca²⁺, поэтому является более активным катализатором ферментативных процессов [24] и оказывает дестабилизирующее воздействие на структуру ГА.

Для приближения свойств синтезируемого материала к составу костной ткани синтез проводят в присутствии органического биополимера, что способствует образованию и росту кристаллов Mg-ГА в виде наночастиц. Такие биокомпозиты характеризуются повышенной биоактивностью и могут быть использованы для доставки лекарственных препаратов в организм человека на клеточном уровне и изготовления нанокристаллической керамики.

Для создания новых материалов часто используют такие биополимеры, как хитин и хитозан [25, 26]. Эти природные полисахариды биологически совместимы, обладают антимикробным, противоопухолевым, ранозаживляющим и гемостатическим действием [27]. В организме они могут распадаться под действием фермента лизоцима на N-ацетилглюкозамин – продукт метаболизма. Изучение механизма воздействия хитина и хитозана на иммунную систему организма показало, что они увеличивают активность ферментов гликолиза фагоцитов [28].

Хитин представляет собой линейный полисахарид, содержащийся во внешних покровах членистоногих и роговых частях животных, стенках грибов, а также в водорослях. По своему строению, физико-химическим свойствам и биологической роли хитин очень похож на целлюлозу. Из-за высокой жесткости полимерной цепи хитин растворяется в ограниченном количестве растворителей: концентрированных кислотах, растворах хлорида лития в диметилацетамиде.

Хитозан – простейшее производное хитина, образующееся при его дезацетилировании. В отличие от хитина, хитозан хорошо растворяется в разбавленных органических растворителях. Как отмечают авторы [29], для хитозана характерна зависимость вязкости раствора от концентрации полимера [29].

Цель настоящей работы – синтез композитов Mg-ГА-хитозан и Mg-ГА-хитин с разным содержанием полимеров, определение состава, морфологических и термических свойств и биоактивности синтезируемых композитов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе проведено два эксперимента (табл. 1).

Синтез композита Mg-ГА-хитозан осуществляли в присутствии хитозана методом осаждения из водных растворов при 27°С. Для этого готовили раствор нитрата магния (0.025 моль/л) и нитрата кальция (0.005 моль/л) объемом 500 мл [29]. Второй раствор состоял из 500 мл эквимолярного количества раствора диаммонийфосфата. В колбу с (NH₄)₂HPO₄ добавляли навеску хитозана массой 0.02, 0.08 или 0.16 г.

К раствору, содержащему ионы кальция и магния, с помощью магнитной мешалки медленно (в течение 1 ч) прикапывали раствор, содержащий фосфат-ионы и взвесь хитозана (общий объем раствора 1000 мл). После смешения добавляли 10 мл 25%-ного водного раствора NH₄OH и выравнивали рН системы до 12 ± 0.05 при помощи 20%-ного раствора NaOH. В основе синтеза лежит реакция (1):

При смешивании растворов происходило образование осадков белого цвета. После отстаивания растворов в течение 3 сут осадки отфильтровывали и высушивали в сушильном шкафу при 80°С до полного удаления воды.

Синтез композита Mg-ГА-хитин проводили аналогично получению Mg-ГА-хитозана, используя вместо хитозана полимер хитин. При приготовлении раствора, содержащего фосфат-ионы, добавляли хитин массой 0.02, 0.08 или 0.16 г. Полученные порошки исследовали физико-химическими методами.

Рентгенофазовый анализ (РФА) порошков проводили на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3М в монохроматизированном CuⱩ_α-излучении. Условия съемки дифрактограмм: напряжение 40 кВт, ток накала 40 мА, диапазон углов 2θ 5°–80°, шаг сканирования 0.05°, время интегрирования сигнала в точке 10 с. Качественный анализ фазового состава образца проводили по сопоставлению экспериментальных значений интенсивности дифракционных максимумов и межплоскостных расстояний по данным порошковой дифрактометрии PDF-2. Предел обнаружения методики составляет 5%. С использованием формулы Дебая–Шеррера рассчитаны размеры кристаллитов [30].

Метод ИК-Фурье-спектроскопии. ИК-спектры снимали на спектрофотометре ФСМ 2202 (Инфраспек, Россия). В ходе исследования образец в виде порошка смешивали с KBr, наносили на германиевую кювету и прессовали. Регистрацию спектров исследуемых образцов проводили в области от 400 до 4000 см^–1 с разрешением 4 см^–1, общее число сканирований 50. Обработку данных осуществляли с использованием программы OriginPro8.0. Предел обнаружения составляет 5%.

Оптическую микроскопию проводили для изучения морфологии. Форму частиц твердых фаз определяли c помощью микроcкопa серии XSP-140. В качестве материала для исследования использовали осадок фосфатов кальция с добавкой полимера. Пробы тонким слоем наносили на часовое стекло и изучали материал под микроскопом.

Термогравиметрический анализ. Образцы композитов (в виде нанопорошков) массой 0.2000 ± ± 0.0002 г прокаливали в муфельной печи LF-7/13-G1 (LOIP) при температурах 200, 400, 600 и 800°С (±2°С) в течение 2 ч после выхода печи на рабочий режим. Прокаленные образцы охлаждали на воздухе до комнатной температуры, затем взвешивали на аналитических весах и переносили в маркированные емкости. По разнице масс до и после прокаливания рассчитывали убыль массы вещества в результате термообработки.

Изучение закономерностей растворения образцов в 0.9%-ном растворе NaCl. Для изучения кинетики 0.2000 ± 0.0002 г композита помещали в 100 мл 0.9%-ного раствора NaCl при 27°С. Измерения проводили в течение 2 ч при перемешивании с постоянной скоростью в постоянном объеме жидкой фазы. В ходе эксперимента контролировали рН системы (рН-метр рН-150МИ) от времени и концентрацию ионов кальция, переходящих в жидкую фазу. Концентрацию ионов кальция определяли методом прямой потенциометрии на ионометре И-160МИ. Для определения скорости растворения осадков все кинетические кривые анализировали с помощью регрессионного анализа [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методом РФА установлено, что синтезированные композиты Mg-ГА-хитозан и Mg-ГА-хитин состоят из гидроксиапатита в качестве основной фазы: 2θ = 31.38°, 32.73°, 32.72° и 37.68° (рис. 1, карточка № 89-6437 базы данных по порошковой дифракции ICDD PDF-2, версия 2006 г.). На рис. 1а присутствуют интенсивные линии в области углов 2θ 20.30°, 20.38°, 20.28° и слабый пик при 10.49°, что характерно для хитозана [31], причем с увеличением содержания хитозана интенсивность пика увеличивается. Аналогичная картина наблюдается для хитина (рис. 1б) – присутствуют интенсивные линии при 20.28° и 21.18° [31], интенсивность которых увеличивается с ростом содержания полимера, что подтверждает образование в изучаемой системе биокомпозитов состава Mg-ГА-хитозан и Mg-ГА-хитин. На дифрактограммах также отмечается незначительное присутствие примесных фаз Mg₃(PO₄)₂ (2θ = = 26.48°, 26.58°) и Ca₃(PO₄)₂ (2θ = 49.99°, 43.39°), их содержание не превышает 5%.

Рис. 1.

Дифрактограммы композитов Мg-ГА-хитозан (а) и Мg-ГА-хитин (б) с концентрацией хитозана и хитина: 1 – 0.02; 2 – 0.08; 3– 0.16 г/л.

По данным РФА были определены размеры кристаллитов. Установлено, что с увеличением массы хитозана (рис. 2) в исходном растворе размеры кристаллитов незначительно уменьшаются (0.02 г/л – 1.9 Å; 0.08 г/л – 1.69 Å; 0.16 г/л – 1.64 Å). Это, вероятно, связано с тем, что кристаллиты Мg-ГА накапливаются в аморфной части полимера, увеличивается вязкость раствора (при увеличении концентрации хитозана), и это затрудняет рост больших кристаллов.

Рис. 2.

Зависимость среднего размера кристаллита от массы полимера: 1 – хитин; 2 – хитозан.

В случае композитов Mg-ГА-хитин фиксируется увеличение размеров кристаллов (от 1.8 до 2.6 Å) с ростом содержания хитина в растворе для синтеза (рис. 2).

По данным ИК-Фурье-спектроскопии, синтезированные композиты имеют весь набор полос, соответствующий полимерам хитозан/хитин и фосфатным группам (рис. 3). Основные полосы поглощения связи О–P–O, содержащейся в ионах ${\text{HPO}}_{4}^{{2 - }}$ и ${\text{PO}}_{4}^{{3 - }},$ характеризуются максимумами поглощения при 1006 и 571 см^–1. Широкая полоса поглощения в области 2955–3237 см^–1 соответствует валентным и деформационным колебаниям –ОH- и NH₂-групп. Колебания связи С–О в ионе ${\text{CO}}_{3}^{{2 - }}$ проявляются в спектре при 878 см^–1 (карбонатзамещенный гидроксиапатит относится к Б-типу) [32, 33].

Рис. 3.

ИК-спектры композитов с концентрацией хитозана и хитина: 1 – 0.02; 2 – 0.08; 3 – 0.16 г/л.

В ИК-спектре хитозана в составе композита наблюдаются полосы поглощения с частотой 3737 см^–1, относящиеся к колебаниям связи О–Н. При частоте 1648 см^–1 проявляется полоса колебаний связей –C=O в группе CONHR, а при 1436 см^–1 – деформационное колебание аминогруппы –NH₂.

Для спектра хитина в составе композита гидроксиапатит-хитин характерны следующие полосы: 1458 см^–1 – валентные колебания O–H_алиф, пики в области 3273 см^–1 – валентные колебания группы N–H ацетамида, 1655 см^–1 – колебания C=O ацетамида, 1458 см^–1 – колебания NH в ацетамиде, 1003 и 1074 см^–1 – C–O–C в глюкозамине [8].

Таким образом, установлено, что образцы, полученные в присутствии разных полимеров (хитин и хитозан), имеют близкий фазовый и групповой состав. Разница в ИК-спектрах хитозана и хитина фиксируется только в разной интенсивности пиков функциональных групп, характерных для использованных полимеров.

С помощью метода оптической микроскопии выявлено, что агрегаты Мg-ГА-хитозан и Мg-ГА-хитин имеют пластинчатую удлиненную форму, характерную для кристаллов магнийсодержащего гидроксиапатита (рис. 4) [23].

Рис. 4.

Микрофотографии композитов Мg-ГА с хитозаном (а, б) и хитином (в, г).

Для исследования термических свойств синтезированных композитов использован термогравиметрический анализ. Установлено, что все синтезированные образцы характеризуются непрерывной потерей массы практически до 800°С (рис. 5). Диапозон 100–400°С соответствует наибольшей потере массы образцов, это связано с удалением легколетучих примесей и адсорбционной воды. Наибольшая потеря массы наблюдается для композитов с максимальным содержанием полимера: хитозан 0.16 г/л – 46.87%; хитин 0.16 г/л – 51.82%. Это доказывает, что образцы с хитином более устойчивы термически по сравнению с хитозаном. При температуре 400–600°С происходит деструкция полимеров.

Рис. 5.

Изменение массы образцов с содержанием хитозана/хитина (1 – 0.02, 2 – 0.08, 3 – 0.16 г/л) после термообработки при различных тепловых режимах для композитов Мg-ГА-хитозан (а) и Мg-ГА-хитин (б).

Методом ИК-Фурье-спектроскопии доказано изменение функционально-группового состава композитов после прокаливания (рис. 6). На спектрах при 200 и 400°С состав твердых фаз не изменяется. При 600°С исчезают пики, отвечающие валентным и деформационным колебаниям –ОН- и –NH₂-групп в структуре хитозана, а для композитов на основе хитина их интенсивность уменьшается с увеличением температуры. При 600°С исчезает также пик, соответствующий колебаниям ассоциированной аминогруппы, в композитах на основе хитозана. Наблюдается сужение основных полос поглощения при переходе вплоть до температуры 800°С, что свидетельствует об увеличении кристалличности образца Mg-ГА. Содержание полимера влияет на массу осадка после прокаливания: чем выше концентрация полимера в образце, тем меньше масса осадка после прокаливания. Это указывает на удаление полимера из образца и коррелирует с данными [8].

Рис. 6.

ИК-спектры композитов с содержанием хитозана и хитина 0.08 г/л после термической обработки при 200 (1), 400 (2), 600 (3) и 800°С (4).

Для определения биоактивности [34] синтезированных композитов отмечали изменение рН и концентрации ионов кальция в изотоническом растворе в течение 2 ч потенциометрическим методом. Установлено, что на начальном этапе растворения композитов происходит повышение рСа, затем кривые переходят на плато (рис. 7). Значение pH раствора во время растворения композитов с хитозаном уменьшалось с увеличением концентрации полимера, а для образцов с хитином, напротив, увеличивалось с ростом концентрации полимера (рис. 7б, 7г).

Рис. 7.

Зависимость pCa (а, в) и pH (б, г) системы от времени растворения композитов с концентрацией хитозана (а, б) и хитина (в, г) 0.02 (1), 0.08 (2), 0.16 г/л (3).

Известно, что хитозан, в отличие от хитина, имеет дополнительную реакционноспособную функциональную группу (аминогруппа ${\text{NH}}_{2}^{ - }$), поэтому способность связывать ионы металлов (кальция и магния) в хелатные комплексы возрастает [31].

Кроме того, хитин является высококристаллическим полимером, в котором существуют внутри- и межмолекулярные связи между гидроксильными группами, а также связи между гидроксильными и аминоацетильными группами. Это объясняет низкую способность связывания хитином ионов металлов в хелатные комплексы

По полученным кинетическим кривым рСа = = f(τ) рассчитаны начальные значения скоростей перехода ионов кальция в раствор (табл. 2). Начальная скорость выделения ионов кальция в раствор не изменяется для композитов с концентрацией хитозана 0.02 и 0.08 г/л, а для образцов с максимальной концентрацией хитозана в исходном растворе резко возрастает в пять раз. Для композитов, полученных в присутствии хитина, начальная скорость перехода ионов кальция в раствор увеличивается с ростом концентрации хитина в исходном растворе.

Сравнение скоростей растворения композитов фосфатов кальция, полученных на основе хитозана и хитина, показало, что большую скорость растворения в физиологическом растворе имеют композиты, синтезированные в присутствии хитина. Таким образом, для использования композитов в качестве материалов с высокой биодеградацией лучше использовать композит Мg-ГА-хитин с максимальным содержанием хитина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированные композиты на основе Mg-ГА, хитина и хитозана имеют постоянный состав, наличие функциональных групп ГА и полимеров подтверждено методом ИК-спектроскопии, присутствие фаз установлено методом РФА. Все композиты имеют идентичную морфологию и кристаллизуются в виде кристаллитов определенной формы. Средний размер кристаллита Мg-ГА-хитозан уменьшается с увеличением концентрации полимера, а у композитов с хитином наблюдается обратная зависимость.

С увеличением температуры прокаливания масса всех композитов уменьшается. Скорость перехода ионов кальция из синтезированных материалов в раствор для композитов с хитином выше, чем с хитозаном.