Журнал неорганической химии, 2022, T. 67, № 2, стр. 241-247

ВВЕДЕНИЕ

Многоядерные комплексы, в структуре которых одновременно присутствуют два или несколько центральных атомов-комплексообразователей, играют важную роль в современной химии. Такие соединения перспективны в качестве противоопухолевых препаратов, контрастирующих агентов для МРТ, основы для получения биметаллических наночастиц [1–3]. Так, гетеробиядерные комплексы золота(I) и платины(II), а также золота(I) и рутения(II) с некоторыми лигандами проявляют антипролиферативные свойства [4, 5]. Присутствие различных металлических центров в одной молекуле может приводить к усилению цитотоксических эффектов комплексов.

Комплексы золота(I) с анионами тиолсодержащих кислот имеют практическое применение. Например, их часто используют для функционализации наночастиц [6, 7], и в ряде работ [8–10] показано, что получаемые системы обладают сильной флуоресценцией. Кроме того, эти комплексы применяют в медицине [11–13]. Так, комплекс золота(I) с тиомалатом (миокризин) используют в терапии ревматоидного артрита. Комплексы золота(I) с глутатионом и цистеином образуются в организме при использовании соединений золота(III) и золота(I) в качестве антираковых средств. Анионы тиолсодержащих кислот координированы к золоту(I) через атом S тиольной группы, и такие комплексы обладают очень высокой устойчивостью. В то же время в состав этих лигандов часто входят и другие группы: амино- (–NH₂) и карбоксильные (–COO^–), не занятые в координации к золоту(I), но способные присоединять ионы других металлов. Из-за возможности образования хелатов особенно перспективна в этом отношении группа NH₂–CH(R)–COO^–, входящая в состав остатков α-аминокислот и некоторых пептидов, в частности, цистеина и глутатиона. В настоящей работе рассмотрены гетеробиядерные комплексы на основе глутатионатов золота(I), содержащие дополнительно медь(II) или цинк(II).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали раствор HAuCl₄ [14], хлористый натрий (ос. ч.), соляную кислоту (фиксанал), безводный сульфит натрия (ч. д. а.), L-глутатион восстановленный (АО “Вектон”, Россия, >98%), раствор NaOH (“без CO₂”), прокипяченную бидистиллированную воду. Концентрацию HAuCl₄ устанавливали по УФ-поглощению раствора (ε = 5600 M^–1 см^–1 при 314 нм, среда 0.1 M HCl).

Все эксперименты проводили при 25°C (водяной термостат U7) и I = 0.2 M (NaCl). Раствор Na₂SO₃ (C = 0.2 моль/л) готовили непосредственно перед экспериментом из безводного реактива.

Рабочие растворы готовили, восстанавливая ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ до ${\text{AuCl}}_{2}^{ - }$ (C_Au = (1–10) × 10^–3 моль/л) сульфитом натрия (${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ + ${\text{SO}}_{3}^{{2 - }}$ + H₂O = ${\text{AuCl}}_{2}^{ - }$ + + ${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ + 2H⁺ + 2Cl^–) в присутствии NaCl (0.2 моль/л) и добавки NaOH (n_NaOH/n_Au = 3.00). Для ускорения процесса возможен небольшой подогрев раствора (<30°C). Получаемый раствор обычно имеет pH 5–6 и является метастабильным к диспропорционированию: ${\text{3AuCl}}_{2}^{ - }$ = 2Au⁰ + + ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ + 2Cl^– [15]. По окончании восстановления (20 мин) к раствору добавляли требуемую навеску глутатиона (GSH₃). Общий объем составлял 30–50 мл.

Помимо расхода на восстановление ${\text{AuCl}}_{4}^{ - },$ сульфит-ион ${\text{SO}}_{3}^{{2 - }}$ окисляется растворенным кислородом, особенно быстро в щелочной области. Использование прокипяченной воды снижает влияние кислорода, но не устраняет его полностью. Поэтому в работе не использовали низкие (<10^–3 моль/л) концентрации компонентов, а Na₂SO₃ для восстановления брали в небольшом (до 10%, подбирается эмпирически) избытке [16]. Использование других мер нежелательно. Так, пропускание в раствор инертного газа часто приводит к снятию метастабильности ${\text{AuCl}}_{2}^{ - }$ и выделению золота(0). Систематических ошибок, связанных с окислением кислородом, в ходе экспериментов не выявлено.

Измерения pH проводили при помощи стеклянного комбинированного электрода ЭСК 10301/7, прибор Radelkis OP-208. Время установления потенциала составляло 2–3 мин. Электрод калибровали по растворам сильной кислоты HCl в 0.2 M NaCl, т.е. измеряемые величины рН равны –lg[H⁺]. Необходимое для расчетов ионное произведение воды для 25°С и 0.2 M NaCl равно lgK_w = 13.76 [17].

Спектры поглощения записывали на спектрофотометре Genesys 6 (Thermo Spectronic) в диапазоне длин волн 400–800 нм, l = 0.05–5 см, раствор сравнения – вода. Проверку способности образцов растворов к флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Agilent Cary Eclipse.

ИК-спектры регистрировали на фурье-спектрометре Scimitar FTS 2000 (Digilab) при ν = 400–4000 см^–1. Образцы спрессовывали с сухим KBr под вакуумом.

Осадки для анализа отделяли фильтрованием через стеклянный фильтр. Для удаления хлорида их 4 раза промывали водой порциями по 5 мл и после двукратной промывки спиртом сушили на воздухе. Элементный CHNS-анализ проводили в аналитической лаборатории ИНХ СО РАН на CHNS-анализаторе vario MICRO cube (Elementar). Для Au(GSH)Cu · 0.5SO₄ · 1.5H₂O (% опр./расч.): N (6.6/6.6); C (18.9/18.7); H (2.8/2.8); S (7.1/7.5).

Количественный анализ на медь проводили спектрофотометрически аммиачным методом после окисления пробы азотной кислотой при нагревании. Концентрацию меди определяли по поглощению аммиачных комплексов в среде 2 M NH₃. Анализ на золото проводили спектрофотометрически в форме ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ после разложения пробы царской водкой и удаления азотной кислоты.

Оценку эффективной константы $K_{{\text{H}}}^{*}$ выполняли при помощи нелинейного МНК [18]. Расчет других величин описан в тексте ниже. В качестве ошибок указаны стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

может присоединять четыре иона H⁺ и имеет следующие константы протонирования lgK_Hi: 9.58 (i = 1), 8.76 (i = 2), 3.58 (i = 3), 2.58 (i = 4) [18]. Первые две относятся к протонированию тиольной (–S^–) и амино- (–NH₂) групп, третья и четвертая – к протонированию карбоксильных (–COO^–) групп. Тиольная и аминогруппы протонированы уже в щелочной области, карбоксильные – только в кислой. Концентрации форм зависят от pH раствора. Далее набор форм разной степени протонирования мы будем обозначать GS*, т.е. [GS*] = = $\Sigma \left[ {{\text{GSH}}_{i}^{{i--3}}} \right].$ К золоту(I) глутатионат координируется через депротонированную S^–-группу, остальные группы в координации не участвуют, хотя остаются способными к протонированию и координации к другим ионам металлов.

Золото(I) способно образовывать с GS* два вида комплексов: полимерные $({\text{AuGS}})_{m}^{*},$ в которых атомы серы являются мостиковыми, и мономерные ${\text{Au(GS}})_{2}^{*}$ [18]. Однако степень полимеризации (m) и вид (циклические или линейные) не определены. Как и GS^3–, все комплексы способны к протонированию за счет амино- и карбоксильных групп, т.е. $\left[ {({\text{AuGS}})_{m}^{*}} \right]$ = = Σ[(AuGS)_m${\text{H}}_{i}^{{i--2m}}$]. Других комплексов, кроме указанных здесь с соотношением Au : GS = 1 : 1 и 1 : 2, не выявлено [18]. Равновесие

при pH > 6 сдвинуто вправо. При 1.7 < pH < 5.5 образуется белый осадок с основным составом (AuGSH₂)_m.

При прямом восстановлении ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ глутатионом в растворе образуется неопределенный набор его окисленных форм. Поэтому в своих экспериментах мы вначале получали комплекс золота(I) ${\text{AuCl}}_{2}^{ - }$ восстановлением ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ сульфитом натрия и затем уже добавляли глутатион и NaOH до нужных значений C_GS : C_Au и pH. Также раствор содержал 0.2 M NaCl во избежание быстрого диспропорционирования: 3AuCl₂^– ↔ 2Au⁰ + ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }$ + + 2Cl^–.

Как отмечено выше, в состав GS* и комплексов золота(I) с GS* входит глицинатный фрагмент (ГФ) – группа NH₂–CH(R)–COO^–, способная к координации с образованием хелата с ионами переходных металлов. В области pH 6–9 аминогруппа находится в протонированном состоянии, а карбоксильные – в депротонированном. На рис. 1 приведены кривые титрования щелочью растворов, содержащих $({\text{AuGS}})_{m}^{*}$ и ${\text{Au}}({\text{GS}})_{2}^{*},$ с различным соотношением C_GS/C_Au в координатах C_OH/C_GS–pH. При C_GS : C_Au ≤ 1.5 они практически совпадают. Здесь же показана область существования осадка (AuGSH₂)_m. Таким образом, при pH > 5.5 комплексы золота(I) в растворе содержат глутатион с депротонированными COO^–-группами и протонированной аминогруппой $--{\text{NH}}_{3}^{ + }.$ Дальнейшее добавление щелочи приводит к ее постепенному депротонированию. Вследствие высокой устойчивости комплексов в этих условиях концентрация свободного GS* очень мала. Оценка эффективной константы протонирования NH₂-группы глутатиона в комплексах [18], полученная на основании данных pH-метрического титрования (pH > 5.5), приводит к величине $\lg K_{{\text{H}}}^{*}$ = 9.3, которая выше, чем константа lgK_2H свободного глутатиона. Вероятно, это вызвано более высоким общим отрицательным зарядом комплексов по сравнению с GSH^2–, а также отличием K_2H от детальной (“микроскопической”) константы [19] протонирования NH₂-группы в глутатионе вследствие влияния тиольной группы. Из совпадения кривых титрования (рис. 1) следует, что при известном значении pH величину $K_{{\text{H}}}^{*}$ можно использовать для расчета концентрации ионов H⁺, связанных с NH₂-группами глутатиона в комплексах:

Очевидно, эту же величину C_{H связ} можно определять и прямо из экспериментальной кривой титрования (рис. 1).

Для исследования образования гетеробиядерных комплексов на основе глутатионатных комплексов золота(I) были выбраны ионы Cu²⁺ и Zn²⁺. Хорошо известно, что медь(II) образует высокоустойчивые пятичленные циклы с ГФ обычных α-аминокислот. Так, для глицина равновесия Cu²⁺ + iGly^– ↔ ${\text{Cu(Gly}})_{i}^{{2 - i}}$ имеют lgβ₁ = 8.2 и lgβ₂ = 15.1 [20]. Уже при небольшом избытке глицина влияние гидроксидных комплексов незначительно. Устойчивость глицинатных комплексов цинка(II) намного ниже (lgβ₁ = 4.8), и, в отличие от меди(II), большее значение имеет равновесие Zn²⁺ + Gly^– + OH^– ↔ Zn(Gly)OH⁰ с lgβ_OH = 10.7 [20], т.е. при небольшом избытке глицина в слабощелочной области основными формами являются Zn(Gly)⁺ и Zn(Gly)OH.

В состав глутатиона также входят две пептидные –NH-группы. Известно, что медь(II) способна образовывать комплексы с координацией к депротонированной группе (–N^––) [21–24]. При не очень высоких значениях pH обычно образуется несколько пятичленных (реже шестичленных) циклов, причем в качестве одной из групп часто выступает –NH₂. Однако при расположении глутаминовой кислоты, как в глутатионе (γ-Glu–Cys–Gly), хелатный цикл (NH₂, N^–) может быть только семичленным, т.е. крайне неустойчивым. Тем не менее для более надежных выводов требуются данные для аналогичных систем. При этом прямое комплексообразование меди(II) с глутатионом невозможно вследствие восстановления меди(II) до меди(I). Поэтому в качестве модельной была выбрана система с дисульфидом глутатиона (GSSG), в котором группа –S–S– не окисляется медью(II) и не участвует в комплексообразовании, но при этом в молекуле GSSG полностью сохраняется строение остальной части глутатиона. В работе [25] было показано, что при умеренных значениях рН (7.4) в водном растворе при комплексообразовании Cu²⁺ с GSSG реализуется только обычный способ координации меди(II) с ГФ остатка глутаминовой кислоты без участия пептидных групп. Аналогичные выводы сделаны в работе [26].

В ходе наших экспериментов с медью(II) к растворам с C_GS : C_Au = 1–2 с pH 8.0–8.5 добавляли раствор CuCl₂. Однако оказалось, что при C_GS : C_Au > 1.5 после добавления CuCl₂ раствор сразу становился коричневым, а затем через 10–20 с полностью обесцвечивался. Очевидно, это связано с окислением части глутатиона медью(II) с переходом ее в медь(I). Для уменьшения влияния этого процесса требовалось снижение [GS*]. Лишь при C_GS : C_Au ≤ 1.5 (C_Au = 1 × 10^–3 моль/л) признаков редокс-процесса не наблюдалось и получаемые растворы имели чистый голубой цвет.

К растворам с выбранными значениями C_GS : : C_Au из диапазона 1–1.5 и pH ~ 8, при котором n* ~ ~ 0.95, добавляли CuCl₂ небольшими (C_Cu < C_Au) порциями с одновременным точным измерением pH. После добавления каждой порции наблюдали значительное (до трех единиц) снижение pH раствора. Его “восстанавливали” до приблизительно исходного значения добавлением щелочи, а затем добавляли следующую порцию CuCl₂. После добавления нескольких порций CuCl₂ величина pH раствора больше не изменялась. Результаты двух серий (из пяти) для C_Au = 1.0 × 10^–3 и 1.0 × 10^–2 моль/л показаны на рис. 2. Их можно объяснить следующим образом. Снижение pH раствора после добавления порции CuCl₂ однозначно свидетельствует о взаимодействии Cu²⁺ с протонированными группами $--{\text{NH}}_{3}^{ + },$ приводящем к выделению H⁺. Поскольку каждый глицинатный фрагмент содержит не более одного иона H⁺, по количеству выделившихся ионов H⁺ можно определить, сколько ГФ оказались связанными с одним ионом Cu²⁺. Уже из количества щелочи (Δn_OH), затрачиваемой на “восстановление” pH после добавления порций CuCl₂ (Δn_Cu), следовало, что количество ионов H⁺, выделяемых на каждый ион Cu²⁺ (k), составляет ~2 (k_Cu = Δn_OH/Δn_Cu ~ 2). Об этом же свидетельствует тот факт, что pH раствора перестает значительно изменяться при добавлении CuCl₂, когда общее количество добавленной меди(II) достигает ~1/2 C_GS. Более точный расчет проводили по уравнению материального баланса для H⁺ с пренебрежением слагаемыми [H⁺] и [OH^–]:

из которого рассчитывали k_Cu. В уравнении (3) $C_{{\text{H}}}^{*}$ = $n_{{\text{0}}}^{*}$C_GS – C_OH; n* – эффективная функция образования (2); $n_{{\text{0}}}^{*}$ – эта же функция в исходном растворе до добавления CuCl₂; C_OH и C_Cu – общие концентрации добавленных щелочи и меди(II). Расчеты по результатам всех серий показали, что k_Cu = 2.0 ± 0.2. Практически такая же величина (k_Cu = 1.9 ± 0.2) была получена из данных обычного титрования соляной кислотой раствора, содержащего полимерный комплекс ${\text{(AuGS)}}_{m}^{*}$ и медь(II) (C_GS : C_Au : C_Cu = 1 : 1 : 0.40) в интервале pH 6.7–3.9. Для расчета использовали выражение (3) с включением в n* констант протонирования карбоксильных групп и с учетом того, что $C_{{\text{H}}}^{*}$ = = $n_{{\text{0}}}^{*}$C_GS + C_HCl. В ходе этого титрования мелкие хлопья осадка (AuGSH₂)_m появлялись только при pH 4.0, что на 1.5 единиц меньше, чем его граница растворимости при такой же C_Au в отсутствие Cu²⁺, и что также свидетельствует об образовании гетеробиядерного комплекса в растворе. Дополнительным подтверждением того, что один ион Cu²⁺ в гетеробиядерном комплексе связан с двумя ГФ лигандов, служит сравнение спектров поглощения (рис. 3) в области d–d-переходов глицинатных комплексов меди(II) и (AuGS)_m${\text{Cu}}_{{xm}}^{*},$ где среднее значение x по всем формам равно C_GS : C_Au = 0.4. В расчете на один ион Cu²⁺ спектр (AuGS)_m${\text{Cu}}_{{xm}}^{*}$ по положению и интенсивности очень близок к спектру ${\text{Cu(Gly)}}_{2}^{0}$ и резко отличается от спектра Cu(Gly)⁺.

На наш взгляд, факт связывания одного иона Cu²⁺ с двумя ГФ является наиболее интересной особенностью гетеробиядерных комплексов с медью(II) в растворе. Причем это наблюдается как для растворов, в которых присутствует только ${\text{(AuGS)}}_{m}^{*}$ (C_GS : C_Au = 1), так и для растворов, содержащих одновременно ${\text{(AuGS)}}_{m}^{*}$ и ${\text{Au(GS)}}_{2}^{*}.$ Поскольку в состав глутатиона входит только один ГФ, ион Cu²⁺ координирует ГФ двух глутатионатов. Остается неясным, принадлежат ли эти глутатионат-ионы двум разным молекулам комплексов или входят в состав одной молекулы комплекса, полимерного ${\text{(AuGS)}}_{m}^{*}$ или мономерного ${\text{Au(GS)}}_{2}^{*}.$ По аналогии с дисульфидными комплексами Cu(GSSG)* [25, 26] в последнем случае возможный способ координации Cu²⁺ в (AuGS)_m${\text{Cu}}_{{xm}}^{*}$ (x < 0.5) можно представить в виде

Фрагмент –S(Au)–Au–S(Au)– в случае Cu(GSSG)* представляет собой просто –S–S–, а для ${\text{Au(GS)}}_{2}^{*}$ – это –S–Au–S–. Хотя схематично процесс образования комплекса можно представить уравнением:

где R включает в себя остальную часть молекулы глутатиона и атом золота(I). Однако корректное определение константы образования невозможно. Во-первых, из-за высокой устойчивости не удается с достаточной точностью рассчитать концентрацию [Cu²⁺], во-вторых, неизвестна степень полимеризации ${\text{(AuGS)}}_{m}^{*}.$

При дальнейшем увеличении C_Cu : C_GS > 0.5 наблюдается выделение голубого осадка. Величина k_Cu при этом снижается. Осадок, полученный при исходном соотношении Au : GS : Cu = 1 : 1 : 1 и pH 6.0, имеет чистый голубой цвет. После фильтрования (фильтруется плохо) и промывки водой и этанолом его сушили на воздухе. Результаты элементного анализа на Au, Cu, C, H, N, S показали, что их содержание отвечает формуле AuCu(GSH)⋅0.5SO₄⋅1.5H₂O. Сульфат-ион, компенсирующий часть заряда Cu²⁺, изначально присутствует в растворе вследствие окисления сульфита при получении ${\text{AuCl}}_{2}^{ - }$ из ${\text{AuCl}}_{4}^{ - }.$ В ИК-спектре осадка, в отличие от спектра GSH₃ (рис. S1 ), отсутствует полоса при 2525 см^–1, отвечающая –SH, что характерно для полимерных комплексов с координацией иона металла к тиольной группе [27], но присутствуют полосы при 881 и 431 см^–1, которые можно отнести к колебаниям Cu–${\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ и Cu–N [28, 29].

Аналогичные эксперименты были выполнены с цинком(II). По сравнению с медью(II) (рис. 2) при добавлении ZnCl₂ порциями к растворам с C_GS : C_Au = 1–2 изменения pH были намного меньше: ~1 и ниже (см. Приложение, рис. S2 ). Расчеты, аналогичные описанным выше, показывают, что каждый ион Zn²⁺ связывается не более чем с одним ГФ глутатиона, координированного к золоту(I). По достижении соотношения C_Zn : C_GS ~ 0.5 наблюдается появление белого осадка. Очевидная причина состоит в том, что комплексы цинка(II) с лигандами, содержащими ГФ, намного менее устойчивы, чем комплексы меди(II).

Нас также интересовала возможность флуоресценции гетеробиядерного комплекса с цинком(II). Раствор исходного комплекса ${\text{(AuGS)}}_{m}^{*}$ сам проявляет слабую флуоресценцию (λ_max = 430 и 650 нм), однако введение Zn²⁺ до C_Zn : C_GS = 0.4 не добавило новых особенностей (см. Приложение, рис. S3 ).

Аналогично глутатиону ГФ присутствует в цистеине ((${\text{NH}}_{3}^{ + }$)–CH(CH₂–SH)–COO^–). Однако полимер [Au(HCys)]_m чрезвычайно плохо растворим. Его растворение происходит лишь при pH > > 7–8 и при значительном (>2.2/1) избытке цистеина. В этих условиях использование меди(II) невозможно, поскольку она легко окисляет цистеин и переходит в медь(I). Эксперименты с цинком(II) также оказались неудачными из-за образования белых осадков во всей интересующей нас области (pH 7–9.5, C_Cys : C_Au = 2.2–2.5, C_Zn : C_Au = 0.2–1).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Глутатионатные комплексы золота(I) (как полимерные ${\text{(AuGS)}}_{m}^{*},$ так и мономерные ${\text{Au(GS)}}_{2}^{*}$) образуют в водном растворе гетеробиядерные комплексы с ионами Cu²⁺ и Zn²⁺, которые связываются с ГФ глутатионата, координированного к золоту(I) через атом S. В случае меди(II) один ион Cu²⁺ связан с двумя глутатионатами. Для цинка(II) один ион Zn²⁺ связан не более чем с одним глутатионатом. При pH 6–9, когда карбоксильные группы глутатиона депротонированы, для полимерного комплекса наиболее вероятный состав гетеробиядерных комплексов в растворе отвечает формулам (AuGS)_mCu_mx${\text{H}}_{{m - 2mx}}^{{m - }}$ и (AuGS)_m(ZnOH)_mx${\text{H}}_{{m - mx}}^{{m - }}$ с переменным количеством M²⁺ (x < 0.5). Во всех случаях при C_M²⁺ : C_GS > > 0.5 гетеробиядерные комплексы выделяются в виде твердой фазы. В отличие от раствора, для меди(II) соотношение основных компонентов Au : GS : Cu в ней соответствует 1 : 1 : 1.