Журнал неорганической химии, 2021, T. 66, № 8, стр. 958-963

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день в медицине используется широкий спектр материалов на основе титана и титановых сплавов: медицинские и хирургические инструменты, имплантаты для ортопедии и стоматологии, стенты и искусственные клапаны для кардиологии и т.д. [1–3]. В зависимости от назначения материалы на основе титана различаются по химическому составу, механическим и физическим параметрам [3]. Известно, что для повышения остеоинтеграции биоматериалов, улучшения соединения кость–имплантат существуют разнообразные подходы: анодная оксидация и механическая обработка, увеличивающие толщину природного слоя оксида, пескоструйная обработка или кислотное травление, создающие шероховатость поверхности и способствующие улучшению адгезии и выживанию клеток [4–6]. Альтернативным подходом является использование биохимических методик: покрытие поверхности коллагеном I типа [7], альгинатом гидрогелей [8], получение материалов с заданной пористой структурой [9] и т.п. В последнее время основополагающим подходом к повышению остеоинтегративных свойств имплантатов является активная модификация поверхности имплантата, создание микро- и наномасштабной шероховатости, которая обеспечивает максимальную площадь контакта с прилежащей костной тканью и одновременно обладает остеокондуктивным эффектом [10, 11]. За счет придания поверхности имплантата высокой степени шероховатости, определенной пористости, развитой морфологии и структурной гетерогенности достигаются условия высокой степени адгезии, скорости роста (пролиферации) клеток ткани и интеграции с костной тканью, создавая прочное закрепление имплантатов в организме и, следовательно, скорейшее возвращение пациента к активной жизни [11–13]. Недавние исследования показали, что использование наноструктурированных поверхностей металлов, особенно из титана и титановых сплавов, способствует росту костной ткани, поскольку такие поверхности лучше имитируют характерные размеры компонентов кости [14]. В результате имитации естественной наноструктуры кости уменьшается инфицирование, воспаление и увеличивается способность к остеоинтеграции [15], что улучшает долговечность ортопедических имплантатов. Технически шероховатость достигается созданием трехмерной пористой поверхности различными методами: пескоструйной обработкой, спеканием, осаждением, электродуговым или плазменным напылением, микровзрывной техникой, коррозированием и др., а также комбинацией этих методов [5, 16–20]. В качестве поверхностного слоя (покрытия) могут выступать оксиды титана, тантала, кальций-фосфатные или полимерные материалы, углерод [21, 22].

Целью данной работы является определение возможности получения заданной шероховатости поверхности титановых материалов (титана Grade 4 и сплава титана Ti₆Al₇Nb) для костных имплантатов методом ионно-кластерной технологии.

К настоящему времени накоплен значительный массив экспериментальных данных, свидетельствующий о том, что на основе процессов взаимодействия ускоренных кластерных пучков с поверхностью разнообразных материалов могут быть созданы технологии для различного вида наноструктурирования этих поверхностей [23–26]. Особенностью данного метода обработки поверхности является минимальная глубина нарушенного поверхностного слоя по сравнению с другими методами модификации поверхности [24]. Однако подбор оптимальных режимов в случае любого нового материала требует проведения многочисленных экспериментов, что связано со значительными затратами времени и материальных ресурсов. Это обусловлено как новизной данных технологий (история ионно-кластерной технологии насчитывает всего тридцать лет) [23, 24], так и достаточно узкой направленностью посвященных им теоретических исследований (например, ионно-кластерная технология первоначально была ориентирована прежде всего на обработку материалов для микроэлектроники: кремния, меди и т.д.).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для исследований использовали образцы изделий, изготовленных из титана Grade 4 (стандарт ASTM F67) и титанового сплава Ti₆Al₇Nb (стандарт ASTM F1295) в виде дисков толщиной 2 мм и диаметром 8 мм. Обработку поверхности проводили ионно-кластерными пучками из аргона. Параметры обработки: ускоряющее напряжение 20 кВ, среднее число атомов аргона в кластере 2500, поток аргона через сопло 200 мл/с, плотность тока пучка кластерных ионов 4 мкА/см².

Исследование топологии образцов проводили в сканирующей зондовой лаборатории Интегра Прима (НТ-МДТ, Россия). Сканирование осуществляли в полуконтактной моде. Использовали кантилеверы HA_NC (ScanSens, резонансная частота 235 кГц, радиус заострения острия не более 10 нм, скорость сканирования 0.5 Гц). Пост-обработка включала вычитание наклонной плоскости. Вычисление статистических параметров проводили с помощью программного обеспечения Gwyddon.

Рельеф поверхности образцов исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ), структуру образцов – сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). СЭМ-изображения получены на сканирующем электронном микроскопе FEI Quanta 3D FEG с термополевым катодом.

Исследование электронной структуры и валентных состояний образцов проводили методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) на электронном спектрометре Escalab MK2 (VG Scientific) с немонохроматизированным рентгеновским источником MgK_α (Е = 1253.6 эВ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование топологии поверхности образцов выполнено методом атомно-силовой микроскопии. Классическими параметрами, используемыми для характеристики шероховатости поверхности, являются S_q (среднеквадратичная шероховатость), S_a (среднеарифметическая шероховатость) и S_z (максимальная высота рельефа поверхности, определяемая как разность высот между самой высокой и самой низкой точками поверхности на выборочной площади). Результаты изменения шероховатости поверхности образцов приведены на рис. 1.

Рис. 1.

Шероховатость образцов (нм), исследованная методом АСМ. 1 – Ti Grade 4 (режим 1); 2 – Ti Grade 4 (режим 2); 3 – Ti Grade 4 (режим 3); 4 – Ti Grade 4 (режим 4); 5 – Ti₆Al₇Nb (режим 1); 6 – Ti₆Al₇Nb (режим 2); 7 – Ti₆Al₇Nb (режим 3).

Один и тот же режим обработки поверхности, например режим 1 (табл. 1), приводит к увеличению шероховатости образцов из титана и уменьшает шероховатость поверхности титановых сплавов Ti₆Al₇Nb. Увеличение дозы кластерно-пучковой обработки приводит к снижению шероховатости образцов из титана и увеличению шероховатости поверхности образцов из титановых сплавов Ti₆Al₇Nb (табл. 2).

Несмотря на то, что средние значения шероховатости поверхности образцов титана и титанового сплава близки, исследование микроструктуры поверхности образцов показало различие в топологических характеристиках данных материалов (рис. 2, 3). Сравнение микроструктуры образцов из титана Grade 4 и титанового сплава Ti₆Al₇Nb до и после пучково-кластерной обработки показало, что в обоих случаях после обработки формируется волнообразный рельеф с характерными размерами 150–500 нм. Однако в случае образца из титана более четко выражен характер неоднородностей и расстояние между высотами больше, чем на поверхности образца из титанового сплава.

Рис. 2.

Поверхность образца из титана Grade 4 до облучения (а) и после кластерной обработки в режиме 3 (б), увеличение ×50000.

Рис. 3.

Поверхность образца из титанового сплава Ti₆Al₇Nb до облучения (а) и после кластерной обработки в режиме 3 (б), увеличение ×50000.

Для определения качественного состава поверхности измеряли обзорный спектр в диапазоне энергий связи 0–1200 эВ с шириной полосы пропускания анализатора 50 эВ и шагом измерения 0.5 эВ. В обзорных спектрах образцов титана присутствуют пики, соответствующие углероду (линия C1s, по которой происходила нормировка энергии связи, и оже-пики), кислороду (O1s и оже-пики), титану (Ti2p, Ti2s, Ti3p, Ti3s). В некоторых случаях при измерении образцов без предварительной очистки обнаружены пики, соответствующие азоту (N1s) и кремнию (Si2p, Si2s), что свидетельствует о загрязнении поверхности образца титана поверхностно-активными веществами, используемыми при очистке поверхности (рис. 4).

Рис. 4.

РФЭС-спектры образца из титана Grade 4 до обработки (а) и после кластерной обработки в режиме 3 (б).

Результаты измерений показали, что образец почти не заряжается, изменение энергии может соответствовать недостаточной калибровке спектрометра. Почти полное отсутствие зарядки можно объяснить малой толщиной оксидной пленки TiO₂, которая превышает аналитическую глубину (~3 СДСП), но не препятствует стеканию заряда с поверхности. Таким образом, толщина слоя TiO₂ на поверхности превышает 5.3 нм. При рассмотрении тонкой структуры линии Ti2p определено содержание оксидных форм титана. Тонкая пленка поверхности у всех образцов содержала 95–100% диоксида титана и 0–5% металлического титана, это подтверждено значениями энергии связи главного пика (458.59 и 459.1 эВ, что значительно больше энергии связи металла и низших оксидов), а также спин-орбитальным расщеплением пиков в дублете (5.84 и 5.62 эВ при 5.7 эВ для высшего оксида и 6.15 для металлического титана). Показано, что ионно-кластерная обработка снижает содержание углерода, азота и кремния в поверхностном слое титановых образцов по сравнению с необработанными.

Оценку токсичности образцов из титана и титанового сплава проводили на основе исследования жизнеспособности и роста субстратзависимых клеток-предшественников костной ткани на поверхности данных материалов.

Экспериментальное исследование остеодифференцировки проводили на клетках линии Th27, культивированных на образцах из титана Grade4 и сплава Ti₆Al₇Nb с разными режимами кластерно-пучковой обработки. Экспериментальные клетки культивировали в индукционной среде в течение 7 и 21 сут и исследовали на каждом сроке; контролем для опыта служили клетки, культивированные в неиндукционной среде. Согласно отработанной методике, окрашивание клеток проводили антителами против остеокальцина и Runx2 по стандартному протоколу двойного окрашивания и при разведении антител.

При длительном культивировании на экспериментальных образцах наблюдали активную пролиферацию клеток и образование плотного монослоя. Значительных различий в количестве клеток при культивировании на экспериментальных образцах из титана Grade 4 и сплава Ti₆Al₇Nb выявлено не было (рис. 5). Численность клеток заметно варьировали между отдельными образцами в группах образцов из титана и титанового сплава, и выделить тенденцию по стабильному увеличению количества клеток на каком-либо образце было трудно. На 7 сутки культивирования в остеогенной среде выявлено больше клеток на сплаве, чем на титане, но на 21 сутки наблюдалась противоположная картина.

Рис. 5.

Адгезия клеток на поверхности образцов до пучково-кластерной обработки (контроль) и после (остеоиндукция).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные экспериментального исследования показали перспективность использования методов ионно-кластерной технологии для получения заданной шероховатости материалов на основе титана Grade 4 и титанового сплава Ti₆Al₇Nb. Показано, что ионно-кластерная обработка приводит к снижению содержания углерода, азота и кремния на поверхности титановых образцов по сравнению с необработанными материалами. Учитывая общие механизмы адгезии субстратзависимых клеток, можно утверждать, что выбор эффективных режимов кластерно-пучковой обработки поверхности имплантатов обеспечивает увеличение остеоинтегративных свойств поверхности материалов для костных имплантатов.