Журнал неорганической химии, 2021, T. 66, № 5, стр. 601-609

ВВЕДЕНИЕ

Разработка новых синтетических биоматериалов, предназначенных для реставрации костных дефектов, является одним из актуальных направлений медицинского материаловедения [1–4]. Материалы на основе гидроксиапатита ([Са₁₀(PO₄)₆(ОН)₂], ГАП) на протяжении ряда лет успешно используются в качестве имплантатов в реконструктивной хирургии, ортопедии и стоматологии, поскольку являются химическими аналогами биоапатита костной ткани человека и животных [5–8]. Однако имплантаты на основе керамических ГАП имеют неудовлетворительную биорезорбируемость и плохо индуцируют образование новой костной ткани, что является их существенным недостатком [9, 10]. Перспективным подходом к решению данной проблемы может стать разработка биомиметического ГАП путем химического модифицирования биосовместимыми анионами, что позволяет целенаправленно регулировать биоактивность и остеоиндукцию таких материалов.

Согласно литературным данным [11–13], биогенный апатит – это наноструктурный кальций – дефицитный гидроксиапатит с соответствующими катионными (Na⁺, Mg²⁺, K⁺, Zn²⁺, Sr²⁺) и анионными (F^–, Cl^–, ${\text{SO}}_{{\text{4}}}^{{{\text{2}}--}}$ и т.д.) замещениями. Наличие данных анионов в структуре ГАП оказывает существенное влияние на живой организм и стимулирует процессы регенерации полноценной костной ткани.

Среди используемых на настоящий момент при синтезе ГАП ионных замещений наиболее важными являются силикат- и карбонат-анионы [14–20]. Силикат-анионы $\left( {{\text{SiO}}_{{\text{4}}}^{{4--}}} \right)$ представляют особый интерес из-за их определяющей роли в процессе реставрации костной ткани, а внедрение карбонат-анионов $\left( {{\text{CO}}_{{\text{3}}}^{{{\text{2}}--}}} \right)$ в структуру ГАП улучшает резорбцию и увеличивает скорость остеоинтеграции.

Также сообщалось [21, 22], что введение при синтезе ГАП в реакционную среду цитрат-ионов (Cit^3–) приводит к изменению структурно-морфологических характеристик синтезируемых материалов. Показано [23–26], что цитрат-ионы, участвующие в биологических циклах, играют важную роль в процессах резорбции костной ткани и формирования биоапатита, например, при наноразмерной стабилизации кристаллитов ГАП в кости.

Таким образом, биоапатит по химическому составу представляет собой наноструктурный кальций-дефицитный гидроксиапатит, содержащий в своем составе силикат- и карбонат-анионы. Нами уже был проведен цикл исследований, посвященных синтезу биомиметического кальций-дефицитного гидроксиапатита (БМГАП), допированного силикат- и карбонат-анионами, в присутствии цитрат-ионов [22, 27].

В данной статье представлены результаты исследований влияния мольных отношений ${{{{C}_{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{C}_{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{{\text{2 + }}}}}}}}} {\left( {{{C}_{{{\text{PO}}_{4}^{{3 - }}}}} + {{C}_{{{\text{CO}}_{3}^{{2 - }}}}} + {{C}_{{{\text{SiO}}_{4}^{{4 - }}}}}} \right)}}} \right. \kern-0em} {\left( {{{C}_{{{\text{PO}}_{4}^{{3 - }}}}} + {{C}_{{{\text{CO}}_{3}^{{2 - }}}}} + {{C}_{{{\text{SiO}}_{4}^{{4 - }}}}}} \right)}}$ в кристаллохимической структуре БМГАП на физико-химические и биологические свойства полученного продукта.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве исходных реагентов использовали Ca(NO₃)₂ · 4H₂O (ч. д. а.), (NH₄)₂HPO₄ (ч. д. а.), (C₂H₅O)₄Si (TEOS, ос. ч.), (NH₄)₂CO₃ (ч. д. а.) и NH₄OH (х. ч. а.). Источником цитрат-ионов служил полученный ранее раствор лимонной кислоты. Синтез образцов БМГАП осуществляли методом химического осаждения из водных растворов по известной методике при температуре 22 ± 2°С и рН 10 ± 0.5 [27]. Для регулирования процессов нуклеации и роста кристаллов ГАП вводили цитрат-ионы (Cit^3–) в количестве 0.46 мас. %. Реакция осаждения БМГАП протекала в соответствии с уравнением:

где d – величина отклонения мольного содержания ионов Ca²⁺ в кристаллохимической структуре ГАП от стехиометрического значения; d = 1, 0.7, 0.4; х – степень замещения фосфат-ионов карбонат-анионами; y – степень замещения фосфат-ионов силикат-анионами.

Полученную суспензию отстаивали при комнатной температуре для завершения процесса фазообразования в течение 24 ч, затем твердую фазу отфильтровывали от маточного раствора, тщательно промывали дистиллированной водой и высушивали при температуре 110 ± 5°С до постоянной массы.

Для проведения исследования в качестве объектов были выбраны образцы БМГАП с мольными отношениями ${{{{C}_{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{2 + }}}}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{C}_{{{\text{C}}{{{\text{a}}}^{{2 + }}}}}}} {\left( {{{C}_{{{\text{PO}}_{4}^{{3 - }}}}} + {{C}_{{{\text{CO}}_{3}^{{2 - }}}}} + {{C}_{{{\text{SiO}}_{4}^{{4 - }}}}}} \right)}}} \right. \kern-0em} {\left( {{{C}_{{{\text{PO}}_{4}^{{3 - }}}}} + {{C}_{{{\text{CO}}_{3}^{{2 - }}}}} + {{C}_{{{\text{SiO}}_{4}^{{4 - }}}}}} \right)}}$ = = 1.50, 1.55, 1.60, где степени замещения фосфат-ионов карбонат- и силикат-анионами во всех случаях были постоянными и составляли х = y = 1. Таким образом, по химическому составу все образцы были кальций-дефицитными. Образцам были присвоены индексы БМГАП1.50, БМГАП1.55 и БМГАП1.60 соответственно. Объектом для сравнения в работе являлся стехиометрический немодифицированный ГАП с мольным отношением Ca/P = 1.67, синтезированный в отсутствие силикат- и карбонат-анионов, но в присутствии цитрат-ионов по уравнению:

Физико-химические и биологические исследования синтезированных образцов проводили комплексными методами анализа. Фазовый состав изучали на дифрактометре Rigaku-SmartLab. Съемку вели при ускоряющем напряжении 40 кВ, токе рентгеновской трубки 250 мА в интервале углов 2θ = 20°–70°, размер шага составлял 0.02°, скорость регистрации – 3 град/мин. Идентификацию соединений, входящих в состав исследуемых образцов, выполняли с помощью программы PDXL Qualitative Analysis по базам данных PDF 2008. Размер кристаллитов D и степень кристалличности X_s синтезированных образцов определяли по стандартной методике [28, 29]. ИК-спектры поглощения измеряли на ИК-Фурье-спектрометре IRPrestige-21 (Shimadzu, Япония) в интервале волновых чисел от 400 до 4000 см^–1. Морфологию и размеры частиц в форме гидродисперсий и в виде высушенных порошков БМГАП определяли по микрофотографиям, полученным с помощью просвечивающей (ПЭМ) и сканирующей (СЭМ) электронной микроскопии на приборах JEM-2100 (JEOL, Япония) и Quanta-200 3D (FEI, США) соответственно. Обработку полученных изображений осуществляли при помощи программного обеспечения ImageJ. Измерения удельной поверхности (S_уд) проводили методом БЭТ на автоматизированной сорбционной установке TriStar II 3020 (Micromeritics, США). Величину и знак поверхностного заряда синтезированных образцов оценивали посредством измерения электрокинетического потенциала. Измерения ζ-потенциала частиц выполняли с применением анализатора серии Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания). Биорезорбируемость синтезированных образцов БМГАП в физиологическом (ω(NaCl) = 0.9%) и модельном SBF-растворе (рН 7.4) оценивали по суммарной концентрации ионов Ca²⁺ в растворе через фиксированное время экспозиции методом комплексонометрического титрования [30].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследование фазового состава синтезированных образцов методом РФА показало, что все образцы БМГАП, полученные при варьировании мольных отношений в интервале 1.50–1.60, являются однофазными нанокристаллическими (рис. 1а) и могут быть отнесены к гексагональной сингонии (пр. гр. P6₃/m) и идентифицированы как модификация ГАП (по ICDD карта № 01-072-1243).

Следует отметить, что дифрактограммы порошков БМГАП отличаются более широкими линиями и меньшей интенсивностью по сравнению со стехиометрическим немодифицированным ГАП1.67 (рис. 1б). Наблюдаемое уменьшение интенсивности характеризующих пиков синтезированных образцов БМГАП, по-видимому, связано с внедрением силикат- и карбонат-анионов в кристаллохимическую структуру ГАП. Таким образом, полученные рентгенограммы полностью идентичны таковым для типичного ГАП.

Кристаллохимические и текстурные характеристики порошкообразных ГАП и БМГАП приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, повышение мольного отношения в интервале 1.50–1.67 в кристаллической структуре ГАП обусловливает монотонное увеличение параметра с. Для параметра а данная зависимость не наблюдается. Наибольшее значение параметра а (0.9523 нм) фиксируется у образца БМГАП1.55. При дальнейшем увеличении мольного отношения параметр а начинает уменьшаться и достигает минимума (0.9422 нм) у ГАП1.67. Объем элементарной ячейки меняется аналогично изменению параметров а и с. Вместе с тем определенных закономерностей в изменении параметров кристаллической решетки БМГАП от величины мольных отношений нами не выявлено. По-видимому, этот вопрос требует проведения отдельных исследований.

Обнаружено также, что при снижении степени дефицитности ионов Ca²⁺ в диапазоне мольных отношений 1.50–1.60 происходит увеличение размеров кристаллитов от 7.52 до 11.52 нм. По мере приближения к стехиометрическому значению их размер изменяется скачкообразно и достигает максимума (70.30 нм) у образца ГАП1.67.

Результаты измерений удельной поверхности синтезированных порошков методом БЭТ показали, что все исследуемые образцы БМГАП обладают высокоразвитой поверхностью по сравнению со стехиометрическим немодифицированным ГАП1.67. Максимальная величина удельной поверхности (193.53 м²/г) зафиксирована у образца БМГАП1.55. Установлено, что с возрастанием мольного отношения до стехиометрического удельная поверхность синтезированных образцов понижается и достигает минимума (74.41 м²/г) у ГАП1.67.

ИК-Фурье-спектры всех порошков БМГАП, допированных силикат- и карбонат-анионами, в интервале заданных мольных отношений содержат полосы поглощения групп ${\text{PO}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}}--}},$ ${\text{CO}}_{{\text{3}}}^{{2--}}$ и OH^–, характерные для апатитовой фазы.

По данным ИК-Фурье-спектроскопии (рис. 2), у всех образцов ГАП1.67 и БМГАП присутствуют полосы поглощения с волновыми числами в интервале 607–565 см^–1, соответствующие деформационным колебаниям фосфатных групп (мода ν₄). Полосы в области 1092–1034 см^–1 могут быть отнесены к асимметричным валентным колебаниям связей Р–О в составе ${\text{PO}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}}--}}$-тетраэдров (мода ν₃), а полосы в интервале 962–959 см^–1 вызваны симметричными валентными модами ν₁. Полоса поглощения при 470 см^–1 соответствует деформационным колебаниям О–Р–О (мода ν₂). Широкая полоса в интервале от 3700 до 2500 см^–1 может быть отнесена к модам валентных колебаний адсорбционной воды и гидроксильных групп. Кроме того, обнаруживаются полосы деформационных колебаний связей О–Н в молекулах структурно связанной воды и в гидроксид-ионах в интервале 1603–1635 см^–1. Предположительно, смещение полосы деформационных колебаний воды на 1600 см^–1, а также значительное увеличение ее интенсивности могут быть связаны с увеличением содержания карбонат-ионов в структуре ГАП. Полоса при 630 см^–1 в спектре ГАП может быть отнесена к либрационным колебаниям ОН-группы. Из рис. 2 видно, что введение как силикатных, так и карбонатных анионов в структуру ГАП приводит к исчезновению этой полосы. Согласно [31, 32], при замещении группы ${\text{PO}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}}--}}$ на ${\text{SiO}}_{{\text{4}}}^{{4--}}$ может происходить потеря одной OH-группы для компенсации заряда в элементарной ячейке ГАП. В случае допирования гидроксиапатита ${\text{CO}}_{{\text{3}}}^{{2--}}$-анионами возможна потеря одной ОН-группы за счет карбонатного замещения B-типа.

У стехиометрического немодифицированного ГАП1.67 присутствуют пики, соответствующие максимальной интенсивности колебаний группы ${\text{PO}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}}--}}$ при 1092 и 602 см^–1, но отсутствуют полосы поглощения, характерные для силикатных групп. У образцов БМГАП происходит уменьшение интенсивности колебаний фосфатных групп в результате замещения части фосфат-анионов на силикат- и карбонат-анионы. В спектрах всех образцов фиксируются также полосы в интервалах 873–871 см^–1 (мода ν₂) и 1456–1417 см^–1 (мода ν₃), относящиеся соответственно к деформационным и валентным колебаниям связей С=О в составе карбонат-аниона. В случае стехиометрического немодифицированного ГАП1.67 это может быть связано с адсорбцией углекислого газа из атмосферы воздуха в процессе синтеза. Для образцов БМГАП характерно уширение и увеличение интенсивности полосы с максимумом при 1417 см^–1, которая соответствует колебаниям ${\text{CO}}_{{\text{3}}}^{{2--}}$ (мода ν₃). Это, на наш взгляд, связано с наложением полосы поглощения при 1417 см^–1 на полосу при 1458 см^–1, которое происходит за счет вхождения в структуру ГАП карбонатных анионов. В отличие от ИК-Фурье-спектра стехиометрического ГАП1.67, в спектрах порошков БМГАП, допированных силикат- и карбонат-анионами, наблюдаются характерные малоинтенсивные полосы поглощения деформационных колебаний связей Si–O и симметричных валентных колебаний мостиковых связей Si–O–Si в силикатных тетраэдрах при 504 (мода ν₂) и ~720 см^–1 (мода ν₁) соответственно. Наличие данных сигналов [31, 33] свидетельствует о внедрении силикат-анионов в решетку ГАП.

Морфологическое исследование синтезированных образцов ГАП1.67 и БМГАП в форме гидродисперсий после синтеза было проведено методом ПЭМ. На рис. 3 представлены ПЭМ-изображения образцов ГАП1.67 и БМГАП1.50.

По данным ПЭМ (рис. 3), внедрение силикат- и карбонат-анионов в структуру ГАП приводит к изменению формы и среднего размера частиц. Видно, что частицы немодифицированного ГАП1.67 имеют игольчатую форму длиной 45–100 нм и шириной 12–25 нм (рис. 3а). В то же время для образцов БМГАП1.50 (рис. 3б) характерно наличие сферической формы с размером частиц в интервале от 13 до 32 нм. Согласно данным [34], сферическая форма частиц ГАП является важным фактором для инициации провоспалительной реакции, а игольчатая форма кристаллов ГАП является наименее биосовместимой. В [35] сообщалось, что игольчатая форма кристаллов ГАП с размером частиц микрометрового порядка (от 0.1 до 20 мкм) инициирует активацию NLRP3 инфламасомы и выраженную секрецию IL-1β макрофагами и дендритными клетками костного мозга мышей in vitro. В то же время при внутрибрюшинной инъекции микроразмерного и субмикронного ГАП воспалительный ответ не развивался при введении частиц ГАП сравнимого размера, но гладкой сферической формы.

Дополнительное структурно-морфологическое исследование ГАП и БМГАП в порошкообразном состоянии после высушивания гидродисперсий было проведено методом сканирующей электронной микроскопии. Конечные продукты синтеза после высушивания гидрогеля до постоянной массы и измельчения в фарфоровой ступке представляли собой тонкодисперсные порошки белого цвета. На рис. 4 представлены СЭМ-микрофотографии исследуемых материалов после сушки.

Анализ СЭМ-изображений полученных образцов ГАП и БМГАП подтвердил, что данные порошкообразные субстанции представляют собой полидисперсные кристаллические системы, которые имеют схожую морфологию и состоят из агломератов наночастиц с размерами в диапазоне от 2 до 23.5 мкм для немодифицированного ГАП1.67 и от 1 до 10 мкм для БМГАП. На микрофотографиях (рис. 4) присутствуют уже не наноразмерные частицы БМГАП, диспергированные в жидкой фазе, как на рис. 3, а агломерированные микрочастицы продукта, высушенного и измельченного до состояния порошка. В процессе сушки кристаллы ГАП теряют свою гидратную оболочку и происходит их агрегация.

Для кальций-фосфатных материалов, в том числе БМГАП, применяемых в качестве субстратов для изготовления костных имплантатов, помимо биосовместимости, биоактивности и остеоиндуктивности крайне важными являются электроповерхностные свойства синтезированных продуктов. Известно, что в случае помещения биоматериала внутрь организма сразу возникает биологическая ответная реакция на глубине в несколько нанометров от поверхности. В то же время наличие поверхностного заряда на границе между биоматериалом и биологической средой оказывает существенное влияние на процессы адсорбции белка и клеточной адгезии. На отрицательно заряженных кальций-фосфатных материалах происходит преимущественная адсорбция катионов кальция с образованием апатитового слоя, усиливая фиксацию белков и клеток к поверхности. С этой точки зрения частицы ГАП, несущие регулируемый отрицательный поверхностный заряд, имеют заметное преимущество. Значения ζ-потенциала синтезированных образцов ГАП и БМГАП приведены на рис. 5.

Согласно результатам измерения ζ-потенциала синтезированных образцов (рис. 5) методом динамического рассеяния света, в водной суспензии при рН 7 частицы всех образцов несут отрицательный заряд. Установлено, что с увеличением мольного отношения в кристаллохимической структуре ГАП в интервале 1.50–1.67 наблюдается закономерное уменьшение ζ-потенциала по абсолютной величине (от 4.29 до 1.05 мВ). Так, у образца у БМГАП1.50, что отвечает наибольшей степени дефицитности ионов Ca²⁺, зафиксировано максимальное отрицательное значение ζ-потенциала (4.29 мВ), далее по мере приближения мольного отношения к стехиометрическому значению ζ-потенциал уменьшается и достигает минимума у ГАП1.67. Таким образом, для синтезированных образцов БМГАП имеет место широкий диапазон варьирования величины отрицательного поверхностного заряда, что позволяет управлять их адгезионными свойствами по отношению к клеткам и протеинам.

Важной характеристикой кальций-фосфатных материалов медицинского назначения является их резорбируемость. Согласно [8], в соответствии с делением процесса резорбции на две фазы (медленную и быструю), различающиеся по уровню рН в зоне резорбции, а также по участию клеток в этом процессе, оценка биорезорбируемости материалов может быть основана на изучении растворимости биоматериала в воде или модельных средах. Биорезорбируемость гидроксиапатитовых биоматериалов зависит от нескольких факторов, таких как фазовый состав, размер кристаллов, удельная поверхность, в том числе и от мольного отношения в кристаллохимической структуре ГАП. В настоящей работе биорезорбируемость синтезированных образцов оценивали по способности к биорезорбции, т.е. интенсивности растворения в физиологическом растворе NaCl (ω(NaCl) = 0.9%), изотоничном плазме крови человека, и в SBF-растворе, имитирующем межтканевую жидкость организма.

В табл. 2 приведены результаты определения растворимости образцов ГАП1.67 и БМГАП в интервале мольных отношений 1.50–1.67 в физиологическом растворе при комнатной температуре 22°С и температуре человеческого тела 37°С (время экспозиции 7 сут).

Из данных табл. 2 видно, что образцы БМГАП обладают улучшенной степенью биорезорбции по сравнению со стехиометрическим немодифицированным ГАП1.67. Такое поведение хорошо согласуется с данными [10], согласно которым замещения на анионы с меньшим зарядом и/или бóльшим радиусом с большей энергией гидратации ведут к повышению растворимости. Для исследуемых образцов БМГАП замещения фосфат-ионов на силикат- и карбонат-анионы приводят к искажению кристаллической решетки, создают напряжения и нестабильность в структуре ГАП, что и обусловливает возрастание растворимости материала. Следует также отметить, что по мере увеличения мольного отношения в образцах БМГАП наблюдается тенденция к уменьшению растворимости. Так, у образца БМГАП1.50 зафиксирована максимальная концентрация ионов Ca²⁺ (4.10 ммоль/л), переходящих в жидкую фазу при контакте твердого вещества с физиологическим раствором. Минимальная концентрация ионов Ca²⁺ (1.10 ммоль/л) при принятом времени экспозиции наблюдалась у стехиометрического ГАП1.67. Таким образом, после выдерживания образцов в течение 7 сут в физиологическом растворе 0.9% NaCl концентрация ионов Ca²⁺ для образцов БМГАП была в 1.9–2.4 раза выше таковой для стехиометрического немодифицированного ГАП1.67. Кроме того, из данных табл. 2 видно, что с возрастанием температуры от 22 до 37°С для всех синтезированных образцов ГАП и БМГАП также отмечается повышение растворимости.

Для оценки биологической активности синтезированных образцов ГАП и БМГАП в условиях in vitro их выдерживали в модельном SBF-растворе (рН 7.4) при постоянной температуре 37 ± 0.5°С в течение 14 сут. По окончании времени выдержки образцов в насыщенном SBF-растворе их биорезорбируемость оценивали по количественному выходу Са²⁺. Результаты представлены на рис. 6.

Из рис. 6 видно, что для всех изучаемых образцов наблюдается схожий характер кривых растворения в SBF-растворе. Так, в течение первых суток выход ионов Ca²⁺ из ГАП1.67 и БМГАП в SBF-раствор быстро растет и через 5–7 сут достигает максимального равновесного значения C(Ca²⁺). После этого периода времени количество ионов Ca²⁺, переходящих в жидкую фазу, незначительно уменьшается и далее находится на постоянном уровне. Данный факт, по-видимому, связан с образованием малорастворимого апатитового слоя, формирующегося на поверхности БМГАП, который затрудняет его дальнейшее растворение; как следствие, происходит незначительное уменьшение концентрации ионов Ca²⁺ в растворе. Известно, что высвобождаемые из кальций-фосфатных материалов подобных БМГАП ионы Ca²⁺, ${\text{PO}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}}--}},$ ${\text{SiO}}_{{\text{4}}}^{{4--}}$ и OH^– играют важную роль в формировании новой апатитовой фазы в биологических средах.

Следует отметить, что все образцы БМГАП имеют более высокую биорезорбируемость в сравнении с немодифицированным ГАП1.67. Из анализа кинетических кривых следует, что по мере увеличения мольного отношения в диапазоне 1.50–1.67 их биорезорбируемость последовательно уменьшается. Максимальный выход ионов Ca²⁺ в SBF-раствор наблюдается у образца БМГАП1.50, а минимальный – у стехиометрического образца ГАП1.67.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом химического осаждения из водных растворов синтезированы образцы наноструктурного биомиметического гидроксиапатита. Показано, что при увеличении мольного отношения в интервале 1.50–1.67 происходит изменение параметров решетки а, с, а также возрастание среднего размера кристаллитов от 7.52 до 70.30 нм и уменьшение величины удельной поверхности. Установлено, что в водной суспензии (рН 7) частицы суспензии и частицы всех образцов несут отрицательный заряд. Выявлена закономерность изменения величины ζ-потенциала синтезированных порошков в исследованном диапазоне мольных отношений.

Исследования биоактивности образцов методом динамического растворения в физиологическом 0.9%-ном растворе NaCl и в SBF-растворе показали, что скорость резорбции ГАП1.67 и БМГАП уменьшается с возрастанием мольного отношения в кристаллохимической структуре исследуемых образцов.