Журнал неорганической химии, 2020, T. 65, № 7, стр. 903-906

Использование водно-солевых стеклообразующих систем для подготовки спермы человека к гипотермическому способу хранения

И. А. Кириленко a*, А. А. Винокуров b, В. П. Данилов a, В. Г. Барчуков c, И. А. Ефименко a

a Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН
119991 Москва, Ленинский пр-т, 31, Россия

b Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Минздрава России
117997 Москва, ул. Саморы Машела, 1, Россия

c Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова
117997 Москва, ул. Островитянина, 1, Россия

* E-mail: iakirilenko@mail.ru

Поступила в редакцию 20.12.2019
После доработки 22.01.2020
Принята к публикации 27.01.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Впервые разработан протектор для гипотермического хранения спермы человека на основе водно-солевого стеклообразующего раствора ацетатов жизненно важных металлов: магния, цинка, кальция. Предложен метод консервации спермы без предварительного отмывания семенной плазмы, способствующий сохранению параметров жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов, сопоставимых с показателями нативной спермы. Использование предлагаемого протектора и метода подготовки спермы человека для гипотермического хранения на первом этапе способствует замедлению метаболизма, о чем свидетельствует полная потеря подвижности сперматозоидов и сохранение близкой к 100% жизнеспособности исследованной спермы. После отмывания протектора происходит восстановление подвижности сперматозоидов на 90–100% по сравнению с показателями нативной спермы.

Ключевые слова: протектор, водно-солевой раствор, подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, криоконсервация

ВВЕДЕНИЕ

Сохранение жизнеспособности различных биосистем вне организма остается одной из важнейших проблем трансплантации клеток и органов. Для решения этих задач часто используются криопротекторы, уменьшающие интенсивность адаптационного процесса и снижающие уровень клеточного метаболизма, что делает клетки менее восприимчивыми к криоповреждениям.

В настоящее время основной способ хранения различных биоматериалов – криоконсервация. В качестве перспективных криопротекторов апробировано больше 120 веществ, принадлежащих к разным классам химических соединений, в основном органических [17]. С целью поддержания энергетического обмена в размороженных клетках и уменьшения токсичности органических консервантов к органическим криопротекторам добавляют полимеры, белки плазмы, глюкозу, неорганические соли.

При использовании криопротекторов происходит повреждение клеточных структур. Основными причинами этого являются процессы, которые происходят вследствие обезвоживания, токсичности органических консервантов и образования вне- и внутриклеточных кристаллов льда.

Существует более мягкий способ консервации, в частности спермы человека, предложенный в 1996 г. группой исследователей из Университета Иокагамы [8]. Суть метода состоит в хранении спермы в бессолевом водном растворе глюкозы и бычьего сывороточного альбумина при температуре +4°С. Консервирующая среда, названная авторами EFM (electrolyte free medium), позволяет сохранить сперму человека максимум в течение двух недель. После двухнедельного хранения в EFM подвижность восстанавливается у немногим более 50% сперматозоидов [814].

Следует отметить, что перед консервацией сперматозоиды отмываются от семенной плазмы с помощью центрифугирования смеси нативной спермы и набора Supra Sperm System, что лишает их природной среды обитания.

Гипотермическое хранение уступает криоконсервации по длительности, но при этом не требует специального криологического оборудования и не зависит от источника замораживающих агентов. В настоящее время метод находится в стадии исследования условий, необходимых для улучшения показателей жизнеспособности и подвижности сохраняемой спермы [816].

Анализ результатов многолетних систематических исследований процессов стеклообразования в водно-солевых системах при низких температурах позволил выявить составы растворов, которые на этапах охлаждения и замораживания в жидком азоте и последующего размораживания не кристаллизуются. В результате был сделан выбор предложенной нами водно-солевой системы, которая явилась основой для разработки методики по предупреждению кристаллизации льда – одного из основных факторов повреждения биологических объектов при их консервации [1720].

Согласно [18], система Mg(CH3COO)2–Zn(CH3COO)2–Ca(CH3COO)2–H2O является стеклообразующей, следовательно, способна предотвращать образование льда на этапах охлаждения и нагревания сперматозоидов при их консервации и расконсервации.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для приготовления растворов использовали реактивы марки “ч. д. а.”: Mg(CH3COO)2 · 4H2O, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, Ca(CH3COO)2 · 0.4H2O. Растворы готовили весовым разбавлением.

Исследование влияния предлагаемого протектора на жизнеспособность спермы и подвижность сперматозоидов проводили в соответствии со стандартами ВОЗ [21].

Анализ нативного эякулята осуществляли по методике, описанной ранее [21]. Оценку жизнеспособности спермы и подвижности клеток проводили с помощью световой микроскопии при увеличении ×400 с использованием стандартного красителя эозина. Эозин (Эозин Y (C.l. 45380)) разбавляли буфером Ferti Pro Flushing medium в соотношении 0.05 г эозина на 10 мл буфера. Погрешность при определении показателей жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов не превышала 10%.

Определение жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов. В соответствии с методикой [21] жизнеспособность спермы оценивали по двум категориям: окрашенные – мертвые сперматозоиды, неокрашенные – живые (табл. 1). Подвижность сперматозоидов оценивали по трем категориям: прогрессивно подвижные, непрогрессивно подвижные, полностью неподвижные сперматозоиды.

Таблица 1.  

Показатели жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов

№ опыта Количество сперматозоидов, %
живых прогрессивно подвижных непрогрессивно подвижных полностью неподвижных
Нативный эякулят
1 93 72 15 13
2 77 64 15 21
3 89 53 13 34
4 77 64 15 21
5 80 76 10 14
После использования протектора
1 95 0 1 99
2 78 0 0 100
3 87 0 0 100
4 78 0 1 99
5 90 0 0 100
После разбавления суспензии спермы с протектором буфером
1 95 67 19 14
2 78 54 13 33
3 87 54 16 30
4 78 62 15 23
5 85 71 18 11

Определение жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов после использования протектора. Исследуемый протектор добавляли к нативному эякуляту в соотношении 1 : 5. Полученную суспензию перемешивали пипетированием. Спустя 15 мин на два предметных стекла наносили по 10 мкл суспензии для определения жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов.

Определение жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов после разбавления суспензии буфером (отмывание клеток от протектора). Полученную при взаимодействии спермы и протектора суспензию разбавляли буфером Ferti Pro Flushing medium в соотношении 1 : 4, через 15 мин подсчитывали количество сперматозоидов и оценивали их подвижность. Результат выражали в процентах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Предлагаемый протектор является стеклообразующей водно-солевой системой, способной предотвращать образование льда на этапах охлаждения и нагревания сперматозоидов, т.е. при их консервации и расконсервации. Следует отметить, что входящие в состав протектора соли содержат ионы цинка, магния и кальция, которые жизненно необходимы для организма человека. Цинк – основной строительный материал для тестостерона. Именно цинк обеспечивает фертильность спермы. Магний – важнейший элемент в жизнедеятельности организма человека, участвующий в метаболизме. Ионы кальция обладают особенностью проникать в цитоплазму, снижая энергетический “уровень” митохондрий, и тем самым способствуют процессу консервации. Ацетаты цинка, кальция и магния (Е650, Е263, Е343 соответственно) известны как лекарственные препараты и пищевые добавки, что может свидетельствовать об их минимальной токсичности.

В табл. 1 представлены исходные параметры образцов нативной спермы пяти человек. Предлагаемый метод подготовки спермы для гипотермического способа хранения без предварительного отмывания семенной плазмы способствует сохранению природной среды для спермы, в отличие от методик, описанных в работах [511].

Данные о жизнеспособности спермы после взаимодействия с протектором (содержание живых сперматозоидов составляет от 78 до 95%) полностью совпадают с аналогичными показателями нативных образцов (77–93%), т.е. при взаимодействии с протектором жизнеспособность спермы по сравнению с исходным материалом в пределах ошибки сохранилась почти на 100%, при этом сперматозоиды полностью обездвижились (табл. 1).

Полученные данные свидетельствуют также о возобновлении подвижности клеток после отмывания протектора почти на 100% по сравнению с нативной спермой.

Предлагаемый метод подготовки спермы для гипотермического способа хранения без предварительного отмывания семенной плазмы способствует сохранению природной среды для спермы. В ходе исследования установлено, что оптимальное соотношение протектора и нативной спермы при их смешивании, способствующее получению лучших результатов по жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов, соответствует соотношению 1 : 5. Этот вывод сделан на основании анализа 10-ти вариантов пропорций смешивания от 1 : 1 до 1 : 10 (данные не приведены). Рассмотрены возможные способы отмывания суспензии от протектора буфером с разведением в пропорции 1 : 4, 1 : 6, 1 : 8. Оптимальным признан вариант 1 : 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование предлагаемого протектора и метода подготовки спермы человека для гипотермического хранения на первом этапе способствует замедлению метаболизма, о чем свидетельствует полная потеря подвижности сперматозоидов и сохранение близкой к 100% жизнеспособности исследованной спермы. После отмывания протектора происходит восстановление подвижности сперматозоидов на 90–100% по сравнению с нативной спермой.

Предлагаемые к использованию протектор и метод консервации на стадии подготовки к замораживанию демонстрируют высокую эффективность и перспективность.

Список литературы

  1. Костяев А.А., Мартусевич А.К., Андреев А.А. // Научное обозрение. Медицинские науки. 2016. № 6. С. 54.

  2. Kuleshova L.L., Shaw J.M., Trouson A.O. // Cryobiology. 2001. V. 43. № 1. P. 21.

  3. Kanno H., Kajwara K., Miyta K. // J. Chem. Phys. 2010. V. 132. P. 1945.

  4. Hunt C.J. // Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2019. V. 46. № 3. P. 134.

  5. Арутинян И.В., Строкова С.О., Макаров А.В. и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2018. № 3. С. 180.

  6. Строкова С.О., Арутинян И.В., Муллабаева С.М. и др. // Акушерство и гинекология. 2018. № 12. С. 5.

  7. Синева О.Н., Иванкова Т.Д., Терехова Л.П. // Антибиотики и химиотерапия. 2019. № 3–4. С. 3.

  8. Saito K., Kinoshita Y., Kanno H. // Fertility and Sterility. 1996. V. 65. № 6. P. 1210.

  9. Kanno H, Saito K., Ogawa T. // Fertility and Sterility. 1998. V. 69. № 1. P. 127. https://doi.org/10.1016/S0015-0282(97)00439-1

  10. Riel J.M., Huang T.T., Ward M.A. // Arch. Androl. 2007. V. 53. № 5. P. 275.

  11. Riel J.M., Yamauchi Y., Huang T.T. // Biology of Reproduction. 2011. V. 85. № 3. P. 536. https://doi.org/10.1095/ biolreprod.111.091322

  12. Morisawa M., Yoshda M.// Reproductive Medicina Biol. 2005. № 4. P. 101.

  13. Исаев Д.А., Заева В.В., Бакурадзе Р.В. и др. // Проблемы репродукции. 2009. № 5. С. 33.

  14. Исаев Д.А., Захарова Е.Е., Капралова И.В. и др. // Проблемы репродукции. 2015. № 4. С. 65. https://doi.org/10.17116/repro201521465-70

  15. Черкашина И.В. // Влияние перфторана на функциональные характеристики сперимеев при гипотермическом хранении и криоконсервации. Автореф. дис. … канд. биол. наук. Харьков. 2007.

  16. Одинцов А.А, Кучков И.Н., Черкашина И.В. и др. // Современная технология в медицине. 2011. Т. 3. С. 47.

  17. Кириленко И.А. Водно-электролитные стеклообразующие системы. М.: Красанд, 2016. 256 с.

  18. Kirilenko I.A. // Russ. J. Inorg. Chem. 2017. V. 62. № 14. P. 1819. https://doi.org/10.1134/S00360236171140042

  19. Kirilenko I.A. // Russ. J. Inorg. Chem. 2018. V. 63. № 13. P. 1728. https://doi.org/10.1134/S0036023618130053

  20. Kirilenko L.I., Demina L.I., Danilov V.P. // Russ. J. Inorg. Chem. 2019. V. 64. № 10. P. 1282. [Кириленко И.А., Демина Л.И., Данилов В.П. // Журн. неорган. химии. 2019. Т. 64. № 10. С. 1282.]https://doi.org/10.1134/S0036023619100073

  21. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека // World Health Organization. М.: Капитал Принт, 2012. 285 с.

Дополнительные материалы отсутствуют.