Журнал неорганической химии, 2020, T. 65, № 7, стр. 903-906
Использование водно-солевых стеклообразующих систем для подготовки спермы человека к гипотермическому способу хранения
И. А. Кириленко a, *, А. А. Винокуров b, В. П. Данилов a, В. Г. Барчуков c, И. А. Ефименко a
a Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН
119991 Москва, Ленинский пр-т, 31, Россия
b Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии,
онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Минздрава России
117997 Москва, ул. Саморы Машела, 1, Россия
c Российский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова
117997 Москва, ул. Островитянина, 1, Россия
* E-mail: iakirilenko@mail.ru
Поступила в редакцию 20.12.2019
После доработки 22.01.2020
Принята к публикации 27.01.2020
Аннотация
Впервые разработан протектор для гипотермического хранения спермы человека на основе водно-солевого стеклообразующего раствора ацетатов жизненно важных металлов: магния, цинка, кальция. Предложен метод консервации спермы без предварительного отмывания семенной плазмы, способствующий сохранению параметров жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов, сопоставимых с показателями нативной спермы. Использование предлагаемого протектора и метода подготовки спермы человека для гипотермического хранения на первом этапе способствует замедлению метаболизма, о чем свидетельствует полная потеря подвижности сперматозоидов и сохранение близкой к 100% жизнеспособности исследованной спермы. После отмывания протектора происходит восстановление подвижности сперматозоидов на 90–100% по сравнению с показателями нативной спермы.
ВВЕДЕНИЕ
Сохранение жизнеспособности различных биосистем вне организма остается одной из важнейших проблем трансплантации клеток и органов. Для решения этих задач часто используются криопротекторы, уменьшающие интенсивность адаптационного процесса и снижающие уровень клеточного метаболизма, что делает клетки менее восприимчивыми к криоповреждениям.
В настоящее время основной способ хранения различных биоматериалов – криоконсервация. В качестве перспективных криопротекторов апробировано больше 120 веществ, принадлежащих к разным классам химических соединений, в основном органических [1–7]. С целью поддержания энергетического обмена в размороженных клетках и уменьшения токсичности органических консервантов к органическим криопротекторам добавляют полимеры, белки плазмы, глюкозу, неорганические соли.
При использовании криопротекторов происходит повреждение клеточных структур. Основными причинами этого являются процессы, которые происходят вследствие обезвоживания, токсичности органических консервантов и образования вне- и внутриклеточных кристаллов льда.
Существует более мягкий способ консервации, в частности спермы человека, предложенный в 1996 г. группой исследователей из Университета Иокагамы [8]. Суть метода состоит в хранении спермы в бессолевом водном растворе глюкозы и бычьего сывороточного альбумина при температуре +4°С. Консервирующая среда, названная авторами EFM (electrolyte free medium), позволяет сохранить сперму человека максимум в течение двух недель. После двухнедельного хранения в EFM подвижность восстанавливается у немногим более 50% сперматозоидов [8–14].
Следует отметить, что перед консервацией сперматозоиды отмываются от семенной плазмы с помощью центрифугирования смеси нативной спермы и набора Supra Sperm System, что лишает их природной среды обитания.
Гипотермическое хранение уступает криоконсервации по длительности, но при этом не требует специального криологического оборудования и не зависит от источника замораживающих агентов. В настоящее время метод находится в стадии исследования условий, необходимых для улучшения показателей жизнеспособности и подвижности сохраняемой спермы [8–16].
Анализ результатов многолетних систематических исследований процессов стеклообразования в водно-солевых системах при низких температурах позволил выявить составы растворов, которые на этапах охлаждения и замораживания в жидком азоте и последующего размораживания не кристаллизуются. В результате был сделан выбор предложенной нами водно-солевой системы, которая явилась основой для разработки методики по предупреждению кристаллизации льда – одного из основных факторов повреждения биологических объектов при их консервации [17–20].
Согласно [18], система Mg(CH3COO)2–Zn(CH3COO)2–Ca(CH3COO)2–H2O является стеклообразующей, следовательно, способна предотвращать образование льда на этапах охлаждения и нагревания сперматозоидов при их консервации и расконсервации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для приготовления растворов использовали реактивы марки “ч. д. а.”: Mg(CH3COO)2 · 4H2O, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, Ca(CH3COO)2 · 0.4H2O. Растворы готовили весовым разбавлением.
Исследование влияния предлагаемого протектора на жизнеспособность спермы и подвижность сперматозоидов проводили в соответствии со стандартами ВОЗ [21].
Анализ нативного эякулята осуществляли по методике, описанной ранее [21]. Оценку жизнеспособности спермы и подвижности клеток проводили с помощью световой микроскопии при увеличении ×400 с использованием стандартного красителя эозина. Эозин (Эозин Y (C.l. 45380)) разбавляли буфером Ferti Pro Flushing medium в соотношении 0.05 г эозина на 10 мл буфера. Погрешность при определении показателей жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов не превышала 10%.
Определение жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов. В соответствии с методикой [21] жизнеспособность спермы оценивали по двум категориям: окрашенные – мертвые сперматозоиды, неокрашенные – живые (табл. 1). Подвижность сперматозоидов оценивали по трем категориям: прогрессивно подвижные, непрогрессивно подвижные, полностью неподвижные сперматозоиды.
Таблица 1.
№ опыта | Количество сперматозоидов, % | |||
---|---|---|---|---|
живых | прогрессивно подвижных | непрогрессивно подвижных | полностью неподвижных | |
Нативный эякулят | ||||
1 | 93 | 72 | 15 | 13 |
2 | 77 | 64 | 15 | 21 |
3 | 89 | 53 | 13 | 34 |
4 | 77 | 64 | 15 | 21 |
5 | 80 | 76 | 10 | 14 |
После использования протектора | ||||
1 | 95 | 0 | 1 | 99 |
2 | 78 | 0 | 0 | 100 |
3 | 87 | 0 | 0 | 100 |
4 | 78 | 0 | 1 | 99 |
5 | 90 | 0 | 0 | 100 |
После разбавления суспензии спермы с протектором буфером | ||||
1 | 95 | 67 | 19 | 14 |
2 | 78 | 54 | 13 | 33 |
3 | 87 | 54 | 16 | 30 |
4 | 78 | 62 | 15 | 23 |
5 | 85 | 71 | 18 | 11 |
Определение жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов после использования протектора. Исследуемый протектор добавляли к нативному эякуляту в соотношении 1 : 5. Полученную суспензию перемешивали пипетированием. Спустя 15 мин на два предметных стекла наносили по 10 мкл суспензии для определения жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов.
Определение жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов после разбавления суспензии буфером (отмывание клеток от протектора). Полученную при взаимодействии спермы и протектора суспензию разбавляли буфером Ferti Pro Flushing medium в соотношении 1 : 4, через 15 мин подсчитывали количество сперматозоидов и оценивали их подвижность. Результат выражали в процентах.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Предлагаемый протектор является стеклообразующей водно-солевой системой, способной предотвращать образование льда на этапах охлаждения и нагревания сперматозоидов, т.е. при их консервации и расконсервации. Следует отметить, что входящие в состав протектора соли содержат ионы цинка, магния и кальция, которые жизненно необходимы для организма человека. Цинк – основной строительный материал для тестостерона. Именно цинк обеспечивает фертильность спермы. Магний – важнейший элемент в жизнедеятельности организма человека, участвующий в метаболизме. Ионы кальция обладают особенностью проникать в цитоплазму, снижая энергетический “уровень” митохондрий, и тем самым способствуют процессу консервации. Ацетаты цинка, кальция и магния (Е650, Е263, Е343 соответственно) известны как лекарственные препараты и пищевые добавки, что может свидетельствовать об их минимальной токсичности.
В табл. 1 представлены исходные параметры образцов нативной спермы пяти человек. Предлагаемый метод подготовки спермы для гипотермического способа хранения без предварительного отмывания семенной плазмы способствует сохранению природной среды для спермы, в отличие от методик, описанных в работах [5–11].
Данные о жизнеспособности спермы после взаимодействия с протектором (содержание живых сперматозоидов составляет от 78 до 95%) полностью совпадают с аналогичными показателями нативных образцов (77–93%), т.е. при взаимодействии с протектором жизнеспособность спермы по сравнению с исходным материалом в пределах ошибки сохранилась почти на 100%, при этом сперматозоиды полностью обездвижились (табл. 1).
Полученные данные свидетельствуют также о возобновлении подвижности клеток после отмывания протектора почти на 100% по сравнению с нативной спермой.
Предлагаемый метод подготовки спермы для гипотермического способа хранения без предварительного отмывания семенной плазмы способствует сохранению природной среды для спермы. В ходе исследования установлено, что оптимальное соотношение протектора и нативной спермы при их смешивании, способствующее получению лучших результатов по жизнеспособности спермы и подвижности сперматозоидов, соответствует соотношению 1 : 5. Этот вывод сделан на основании анализа 10-ти вариантов пропорций смешивания от 1 : 1 до 1 : 10 (данные не приведены). Рассмотрены возможные способы отмывания суспензии от протектора буфером с разведением в пропорции 1 : 4, 1 : 6, 1 : 8. Оптимальным признан вариант 1 : 4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование предлагаемого протектора и метода подготовки спермы человека для гипотермического хранения на первом этапе способствует замедлению метаболизма, о чем свидетельствует полная потеря подвижности сперматозоидов и сохранение близкой к 100% жизнеспособности исследованной спермы. После отмывания протектора происходит восстановление подвижности сперматозоидов на 90–100% по сравнению с нативной спермой.
Предлагаемые к использованию протектор и метод консервации на стадии подготовки к замораживанию демонстрируют высокую эффективность и перспективность.
Список литературы
Костяев А.А., Мартусевич А.К., Андреев А.А. // Научное обозрение. Медицинские науки. 2016. № 6. С. 54.
Kuleshova L.L., Shaw J.M., Trouson A.O. // Cryobiology. 2001. V. 43. № 1. P. 21.
Kanno H., Kajwara K., Miyta K. // J. Chem. Phys. 2010. V. 132. P. 1945.
Hunt C.J. // Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2019. V. 46. № 3. P. 134.
Арутинян И.В., Строкова С.О., Макаров А.В. и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2018. № 3. С. 180.
Строкова С.О., Арутинян И.В., Муллабаева С.М. и др. // Акушерство и гинекология. 2018. № 12. С. 5.
Синева О.Н., Иванкова Т.Д., Терехова Л.П. // Антибиотики и химиотерапия. 2019. № 3–4. С. 3.
Saito K., Kinoshita Y., Kanno H. // Fertility and Sterility. 1996. V. 65. № 6. P. 1210.
Kanno H, Saito K., Ogawa T. // Fertility and Sterility. 1998. V. 69. № 1. P. 127. https://doi.org/10.1016/S0015-0282(97)00439-1
Riel J.M., Huang T.T., Ward M.A. // Arch. Androl. 2007. V. 53. № 5. P. 275.
Riel J.M., Yamauchi Y., Huang T.T. // Biology of Reproduction. 2011. V. 85. № 3. P. 536. https://doi.org/10.1095/ biolreprod.111.091322
Morisawa M., Yoshda M.// Reproductive Medicina Biol. 2005. № 4. P. 101.
Исаев Д.А., Заева В.В., Бакурадзе Р.В. и др. // Проблемы репродукции. 2009. № 5. С. 33.
Исаев Д.А., Захарова Е.Е., Капралова И.В. и др. // Проблемы репродукции. 2015. № 4. С. 65. https://doi.org/10.17116/repro201521465-70
Черкашина И.В. // Влияние перфторана на функциональные характеристики сперимеев при гипотермическом хранении и криоконсервации. Автореф. дис. … канд. биол. наук. Харьков. 2007.
Одинцов А.А, Кучков И.Н., Черкашина И.В. и др. // Современная технология в медицине. 2011. Т. 3. С. 47.
Кириленко И.А. Водно-электролитные стеклообразующие системы. М.: Красанд, 2016. 256 с.
Kirilenko I.A. // Russ. J. Inorg. Chem. 2017. V. 62. № 14. P. 1819. https://doi.org/10.1134/S00360236171140042
Kirilenko I.A. // Russ. J. Inorg. Chem. 2018. V. 63. № 13. P. 1728. https://doi.org/10.1134/S0036023618130053
Kirilenko L.I., Demina L.I., Danilov V.P. // Russ. J. Inorg. Chem. 2019. V. 64. № 10. P. 1282. [Кириленко И.А., Демина Л.И., Данилов В.П. // Журн. неорган. химии. 2019. Т. 64. № 10. С. 1282.]https://doi.org/10.1134/S0036023619100073
Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека // World Health Organization. М.: Капитал Принт, 2012. 285 с.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Журнал неорганической химии