Журнал неорганической химии, 2020, T. 65, № 3, стр. 403-412

ВВЕДЕНИЕ

Потребность медицины в материалах, используемых для замены или регенерации костной ткани, служит стимулом для разработки различных биоматериалов, в том числе и биоактивных стекол [1–4]. Биоактивные стекла относятся к классу керамики, способной взаимодействовать с костными тканями организма. Биостекло запускает реакции организма, отвечающие за восстановление костного дефекта за счет медленного растворения компонентов биостекла. Продукты растворения стимулируют пролиферацию остеогенных клеток, что способствует воспроизводству новых тканей. В процессе растворения на поверхности биостекла формируется биологически активный слой нанокристаллического гидроксиапатита, который обеспечивает прочную связь искусственного материала с костью и мягкими тканями [4–6].

Состав биостекол с оптимальными биосовместимыми свойствами (отсутствие токсичности, биоактивность в процессах остеокондукции и остеоиндукции, биорезорбируемость и др.) предложен Л. Хенчом под маркой “45S5 Bioglass” и включает в мас. %: 45 SiO₂, 24.5 Na₂O, 24.5 CaO, 6 P₂O₅ [7]. Однако в ряде исследований доказано, что биоактивные стекла, легированные бором, имеют еще более высокую биологическую активность, улучшенную биосовместимость и антибактериальные свойства по сравнению с традиционным биостеклом [8, 9]. Роль бора в организме человека определяется его участием в обмене жиров, углеводов, гормонов и витаминов. Кроме того, регулируя паратиреоидный гормон, бор косвенно воздействует на обмен магния, кальция, фосфора и витамина D, а также вовлечен в метаболизм костных тканей и принимает активное участие в ее формировании. Более того, бор влияет на жизненно важные процессы, включая эмбриогенез, рост костей и психомоторные навыки [10, 11]. Известно, что борсодержащее биостекло вызывает повышенную пролиферацию остеобластов в клетках [10], а контролируемое высвобождение бора из биостекла способствует улучшенной регенерации костных тканей [12, 13].

Для получения биостекол, в том числе содержащих бор, чаще используют золь-гель методы [12, 14, 15]. Однако процесс приготовления золя из исходных реагентов является достаточно длительным и занимает от одного дня [16] до одной недели [15]. Применяют также метод получения стекол в расплаве [17, 18]. Для этого используют смеси из SiO₂, H₃BO₃, CaCO₃, Na₂CO₃ и NaH₂PO₄ · 2H₂O или SiO₂, Na₂O, CaO, P₂O₅, B₂O₃, которые плавят при 1300–1450°С. Указанные методы не позволяют получать покрытия из биоактивного стекла, повторяющие форму пор на пористых биоинертных носителях. В частности, предложенным в [16] методом получают порошок биоактивного стекла, поскольку пропитать гелем пористую керамику невозможно.

Метод пиролиза органических растворов был использован в работе [12] для получения каркасов из борсодержащих биоактивных стекол. Для этого готовили растворы, содержащие тетраэтилортосиликат, нитрат кальция, трибутилборат, триэтилфосфат и соляную кислоту в этаноле. Этим раствором несколько раз пропитывали полиуретановую губку и обжигали при температуре 700°С. В результате были получены пористые структуры содержащие мезо- и макропоры. Таким образом, использование органических растворов, содержащих компоненты стекла, позволяет пропитывать пористые структуры и получать биоактивные слои или каркасы. Но необходимо отметить, что в составе стекла, предложенного в работе [12], отсутствует такой важный компонент костной ткани, как натрий.

В связи с этим очевидный интерес может представлять способ прямого пиролиза органических растворов широкого компонентного состава, оригинальность которого заключается в возможности синтеза как объемных биостекол, так и тонкослойных биопокрытий на инертных керамических носителях с глубоким проникновением в их пористый объем, представляющих практический интерес в костной имплантологии.

Целью настоящего исследования явилась разработка способа синтеза биоактивных стекол состава 45S5 Bioglass, легированных 5, 15, 25 и 60 мас. % бора, и тонкослойных биопокрытий на их основе на пористой инертной керамике пиролизом органических прекурсоров в жидкой фазе. Оценка антибактериальных свойств биостекол в зависимости от содержания бора.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы. Для получения биостекол использовали олеат натрия (C₁₈H₃₃O₂Na, 98%), олеат кальция (C₃₆H₆₆O₄Ca, 98%), скипидар (сульфатный, очищенный для органического синтеза), тетраэтоксисилан (C₈H₂₀O₄Si, 99.5%), трибутилфосфат (C₁₂H₂₇O₄P, 99%), бензол (C₆H₆, 99.8%). Для получения органического раствора бора использовали борную кислоту (H₃BO₃, 99.8%), три-н-октиламин (C₂₄H₅₁N, 98%) и 1-октанол (C₈H₁₈O, 99%).

Методика снтеза. В органический раствор, содержащий олеат натрия в скипидаре и тетраэтоксисилан, добавляли органический раствор олеата кальция в скипидаре с бензолом и трибутилфосфатом. Борную кислоту растворяли при температуре 180°С в смеси три-н-октиламина (ТОА) и 1-октанола (Ос) с соотношением ТОА : Ос = 1 : 1. Далее органический раствор, содержащий бор, в заданных пропорциях смешивали с раствором, содержащим остальные компоненты стекла. Борсодержащее биоактивное стекло получено замещением части SiO₂ на B₂O₃ в составе биостекла 45S5 Bioglass (табл. 1).

После смешивания всех необходимых компонентов выполняли отгонку растворителя при температуре 150–200°С. Полученную массу (прекурсор) переносили в тигель, подвергали пиролизу, нагревая в муфельной печи до 1300°С со скоростью 7 град/мин и выдерживали при этой температуре в течение 20 мин. После этого образец переносили в камеру отжига с температурой 520–550°С, выдерживали при этой температуре 2 ч, а затем охлаждали до комнатой температуры.

Микробиологические исследования. Микробиологические исследования (антибактериальная активность) заключались в оценке степени нарастания бактериальной пленки Pseudomonas aeruginosa на поверхности образцов биостекол с содержанием 0, 5, 15 мас. % B₂O₃. Образцы размещали в жидкой питательной среде с бактериальной культурой. Культивирование проводили при 37°С в течение 48 ч. Фиксацию биопленки на образце осуществляли путем промывки в 4%-ном формальдегиде с 1%-ным раствором фосфатного буфера и последующим воздействием 1%-ным раствором тетраоксида осмия в течение 1 ч. Обезвоживание проводили с помощью последовательной обработки в этаноле различной концентрации и при соответствующей экспозиции (30% – 10 мин, 50% – 10 мин, 70% – 10 мин, 96% – 10 мин, 100% – 20 мин), а затем в ацетоне 20 мин. Морфологию сформированных биопленок изучали с помощью электронной микроскопии на приборе Carl Zeiss Ultra 55 (Германия) c катодом на полевой эмиссии при ускоряющих напряжениях 1–5 кВ и токе пучка I ≈ 100 pA.

Методы исследования. Рентгенофазовый анализ (РФА) образцов проводили на дифрактометре D8 Advance Bruker AXS (Германия) в CuK_α-излучении с графитовым монохроматором. Кристаллические фазы образующихся на разных стадиях синтеза стекол определяли с использованием программы поиска EVA по базе порошковых данных PDF-2. Для исследования качественного и количественного элементарного состава, а также морфологии образцов использовали метод растровой электронной микроскопии (РЭМ). РЭМ-изображения образцов получали на электронном сканирующем микроскопе S5500 Hitachi (Япония). ИК-спектры регистрировали на вакуумном ИК-спектрометре Vertex 70V фирмы Bruker (Германия) при помощи приставки нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО или ATR) в диапазоне частот 350–4000 см^–1. Спектры ЯМР и MAS ЯМР ¹¹B, ²⁹Si, ³¹P регистрировали на спектрометре Avance AV-300 Bruker (Германия) при температуре 305 K. Частота вращения образца в MAS-экспериментах составляла 7 кГц. Измерение химических сдвигов (ХС) резонансных линий проводили методом замещения с использованием в качестве стандарта (C₂H₅O)₂ ∙ BF₃ (¹¹B), тетраметилсилана (²⁹Si) и 85%-ной H₃PO₄ (³¹P). Ошибка измерения ХС составляла 1.0 м.д. Разложение спектра на компоненты гауссовой формы проводили в самостоятельно разработанной программе с использованием модифицированного метода минимизации Ньютона. Ошибка подгонки кривой не превышала 8% от ее площади. Температуру стеклования T_g определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии на калориметре DSC-204 Netzch (Германия) в температурном интервале 30–650°С в платиновых тиглях, скорость нагревания 10 град/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее для получения биостекол нами был предложен метод пиролиза органических растворов [19, 20]. В качестве растворимых в органических растворителях компонентов стекла были использованы тетраэтоксисилан, трибутилфосфат и олеаты натрия и кальция. Отмечен ряд преимуществ получения биостекол этим методом. Метод позволяет вводить в стекло допирующие компоненты. Их удобно вводить в виде экстрактов в органических растворителях [21]. Для получения борсодержащего биостекла метод жидкостной экстракции не применялся, так как бор плохо экстрагируется из водных растворов. В связи с этим нами разработан метод жидкостно-твердофазной экстракции бора: борную кислоту растворяли в смеси ТОА с Ос при нагревании. При этом установлено что в Ос борная кислота не растворяется, но с ТОА она образует полибораты триоктиламмония с мольным отношением В : ТОА > 3. Именно они растворяются в органических растворителях, в частности в Ос. Метод жидкостно-твердофазной экстракции позволяет получить высококонцентрированный органический раствор бора: до 40 мас. % H₃BO₃ в смеси ТОА с Ос.

В настоящей работе исследованы условия получения и некоторые свойства борсодержащей стеклокерамики, полученной методом пиролиза органических растворов. Получены образцы с содержанием оксида бора 5, 15, 25 и 60 мас. %.

Рентгенофазовый анализ при обжиге прекурсоров с различным содержанием B₂O₃ в зависимости от температуры выявил фазы, представленные в табл. 2. Начиная с 500°С наряду с аморфной фазой образуются фосфаты натрия, кальция и комбеиты, среди которых, в соответствии с [22], соединение Na₄Ca₄Si₆O₁₈, которое может рассматриваться как предшественник фазы (Na_15.78Ca₃(Si₆O₁₂)).

Предлагаемый метод позволяет варьировать содержание бора в широком диапазоне и получать стекла или стеклокерамику различных составов. При увеличении содержания бора в стекле, вероятно, происходит вытеснение фосфатного аниона из силикатной сетки стекла. Об этом свидетельствуют данные РФА для стекол с содержанием оксида бора >25% (табл. 2). Следует отметить появление в стекле фазы гидроксиапатита Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, который является основной минеральной составляющей костной ткани, также активно синтезируется и исследуется учеными в качестве биоматериала [23]. При повышении температуры обжига гидроксиапатит трансформируется в оксиапатит, который впоследствии при взаимодействии со средой организма снова переходит в гидроксиапатит.

В качестве примера на рис. 1 приведены дифрактограммы продуктов обжига прекурсора с 5%-ным содержанием B₂O₃ при различных температурах. В интервале температур 500–1000°С в продуктах обжига на фоне рентгеноаморфной фазы присутствуют в основном две фазы: Ca₂SiO₄ и Na₄Ca₄(Si₆O₁₈), а при увеличении содержания бора в стекле появляются фазы фосфатов кальция, что, вероятно, говорит о вытеснении последних из силикатной сетки стекла. Это, как будет показано ниже, подтверждается данными MAS ЯМР ³¹P.

Рис. 1.

Дифрактограммы прекурсора с 5%-ным содержанием B₂O₃ после обжига при различных температурах: 1 – 500, 2 – 700, 3 – 1000, 4 – 1300°С.

Температура стеклования образцов колеблется в пределах 520–550°С (табл. 3). Для снятия напряжений и предотвращения растрескивания образцов полученные стекла во время охлаждения подвергали изотермической выдержке при температуре 520–550°С. Полученные при 1300°С стекла обнаруживают тенденцию к кристаллизации при дополнительной изотермической выдержке выше 650°С. Основной наблюдаемой фазой в продуктах кристаллизации стекла является Na₆Ca₃Si₆O₁₈, а при повышении содержания В₂О₃ > 5% дополнительно кристаллизуется Na₆Ca₃(PO₄)_5/2. При изотермической выдержке полученных образцов в камере отжига с температурой 700–750°С в зависимости от времени выдержки возможно получение как керамики, так и стеклокерамики, содержащей фазы фосфатов и силикатов кальция (табл. 3), что должно повышать их биоактивность.

Стекла, содержащие 5, 15, 25 мас. % оксида бора, прозрачны (рис. 2), рентгеноаморфны и содержат все компоненты: кремний, кислород, натрий, кальций, фосфор и бор. В энергодисперсионном спектре бор дает очень слабый сигнал. Например, пик углерода на рис. 2б соответствует 0.282 кэВ с интенсивностью 100 усл. ед., 15% оксида бора в образце дают сигнал, соответствующий 0.185 кэВ с интенсивностью 20 усл. ед. Таким образом, он практически сливается с фоновым сигналом.

Рис. 2.

Фотография (а) и энергодисперсионный спектр (б) борсодержащего биостекла.

В ИК-спектрах стекол в области 900–1100 см⁻¹ имеются две интенсивные полосы поглощения с максимумами при 941 и 1045 см⁻¹, относящиеся к колебаниям ν₃ связей Si–O (рис. 3). Колебания ν₂ связей Si–O представлены интенсивной полосой при 474 см^–1, а колебания ν₁ – двумя полосами с максимумами при 721 и 768 см⁻¹. Расщепление полосы валентных колебаний ν₃ связей Si–O свидетельствует о наличии в составе стекла различных тетраэдров [SiO₄]. Известно, что чем больше степень связности тетраэдров друг с другом, тем в более высокочастотной области будет находиться основной максимум поглощения. У силикатов с островной структурой тетраэдры [SiO₄] непосредственно не связаны друг с другом и основной максимум поглощения находится в области 880–950 см⁻¹. У каркасных силикатов с наиболее высокой степенью полимеризации кремнекислородных тетраэдров эта полоса сдвигается в высокочастотную область до 1100–1120 см⁻¹. Таким образом, на основании данных ИК-спектроскопии можно сделать заключение, что в составе полученного нами стекла имеются тетраэдры [SiO₄] с различной степенью полимеризации.

Рис. 3.

ИК-спектры образцов стекла, содержащих 0, 5 и 15 мас. % B₂O₃.

В ИК-спектрах (рис. 3) стекол присутствует также полоса поглощения с максимумом при 1375 см⁻¹, которая относится к асимметричным валентным колебаниям ν₃ связей В–O. С увеличением содержания бора в стекле интенсивность этой полосы возрастает, а полос, относящихся к колебаниям связей Si–O, снижается. В соответствии с [24], полосы поглощения, отвечающие валентным колебаниям ν₃ связей B–O, при тригональном окружении бора находятся вблизи 1300 cм⁻¹, в то время как при тетраэдрическом окружении это поглощение смещено в область более низких частот (800−1100 cм⁻¹), которая перекрывается полосами поглощения с участием колебаний связей Si–O. На основании этого можно сделать вывод о наличии в составе полученных нами стекол тригонально-координированных боратных групп.

Спектры MAS ЯМР ¹¹B биостекол, содержащих 5 и 15 мас. % B₂O₃ (рис. 4), имеют по две компоненты различной ширины. Узкие компоненты гауссовой формы со сдвигами –0.6 и –1.2 м.д., имеющие полуширину ∼300 Гц, можно отнести к атомам бора B⁽⁴⁾ в тетраэдрическом окружении мостиковых атомов кислорода [25]. Широкие компоненты, имеющие тот же сдвиг, вероятно, соответствуют атомам B⁽³⁾ группировок ${\text{BO}}_{{\text{3}}}^{{{\text{3}} - }},$ для которых высокие значения градиента электрического поля приводят к эффектам второго порядка в спектрах ЯМР ¹¹B. Поскольку интенсивность компонент невелика, их форма также моделировалась гауссовыми кривыми, полуширина которых составляла ~2 кГц. Отношение интегральных интенсивностей узкой и широкой компонент, взятое без учета боковых линий от вращения образца, составило 30 : 70 для биостекла с 15%-ным содержанием B₂O₃ и 40 : 60 для биостекла с 5%-ным содержанием B₂O₃. Полученные отношения можно считать оценкой относительного содержания упомянутых групп в стеклах.

Рис. 4.

Спектры MAS ЯМР ¹¹B стекол: 15 мас. % B₂O₃ (1) и 5 мас. % B₂O₃ (2).

Спектры MAS ЯМР ²⁹Si (рис. 5) могут быть разложены на три компоненты с ХС –88, –95 и –105 м.д., соответствующими группировкам Si(2), Si(3) и Si(4) [25]. Соотношение интегральных интенсивностей сигналов приведено в табл. 4. Наблюдаемое распределение интенсивностей характерно для стекол, содержащих наряду с SiO₂ несколько стеклообразователей [24, 25].

Рис. 5.

Спектры MAS ЯМР ²⁹Si стекол: 15 мас. % B₂O₃ (1) и 5 мас. % B₂O₃ (2).

В спектрах MAS ЯМР ³¹P (рис. 6) наблюдаются сигналы с ХС 5.5 и 1 м.д., соответствующие полностью деполимеризованным группировкам ${\text{PO}}_{{\text{4}}}^{{{\text{3}} - }}$ (P⁽⁰⁾) и группировкам P⁽¹⁾, сохраняющим связь P–O–P и входящим в состав фосфатной стекольной сетки. Соотношения интегральных интенсивностей сигналов составляют 79 : 21 и 75 : 25 для стекол 45B15S5 и 40S5B5 соответственно. Положения и интенсивности сигналов согласуются с литературными данными для стекол близкого состава: 24.6Na₂O–26.7CaO–27.7SiO₂–18.4B₂O₃–2.6P₂O₅ и 24.6Na₂O–26.7CaO–41.5SiO₂–4.6B₂O₃–2.6P₂O₅ [22]. Поскольку концентрация P₂O₅ в исследованных нами составах выше, содержание групп P⁽¹⁾ также более высокое, а сигналы несколько смещены в область сильного поля. Можно отметить, что, как и в работе [26], имеется тенденция к компенсации одного стеклообразователя другим: при уменьшении содержания B₂O₃ в стекле относительная концентрация мостиковых фосфатных групп возрастает.

Рис. 6.

Спектры MAS ЯМР ³¹P стекол: 15 мас. % B₂O₃ (1) и 5 мас. % B₂O₃ (2).

Как известно, биостекола по своим механическим свойствам уступают костной ткани (низкая прочность на растяжение и сопротивление к удару, хрупкость и др.). Для костного эндопротезирования лучше использовать прочную пористую биоинертную керамику, аналогичную предложенной в работе [27], пропитанную органическим раствором, содержащим все компоненты биоактивного стекла. На рис. 7 и 8 приведены микрофотографии и энергодисперсионные спектры исходной керамики из γ-Al₂O₃ и керамики, пропитанной биостеклом, с содержанием оксида бора 15% с последующим обжигом при 1300°С. В энергодисперсионном спектре появились линии компонетов стекла, а интенсивность сигнала алюминия значительно снизилась. Из приведенных рисунков видно, что после нанесения биостекла на поверхность образца и его прокаливания на керамике образуется тонкий биоактивный слой стекла, не нарушающий морфологию поверхности носителя. Такой биоактивный слой должен способствовать возникновению анатомической взаимосвязи между изменяющейся живой костью и поверхностью импланта. Необходимо подчеркнуть, что, как показано выше, при дополнительном отжиге при температуре 700–750°С на поверхности керамики в составе стеклофазы могут быть сформированы кристаллы фосфатов кальция, что должно способствовать повышению биоактивности покрытий.

Рис. 7.

РЭМ-изображение (а) и ЭДС-спектр (б) образца из γ-Al₂O₃.

Рис. 8.

РЭМ-изображение (а) и ЭДС-спектр (б) образца из γ-Al₂O₃, покрытого биостеклом.

Существуют литературные данные по исследованию биоактивности и цитотоксичности стекла 45S5B, полученного золь-гель методом [15]. Было установлено, что цитотоксичность этого стекла не превышает цитотоксчность стекла 45S5, что указывает на его безопасность для применения в биомедицинской области. Исследования разных авторов показывают, что биостекла имеют большой потенциал в лечении хронического остеомиелита, например, S53P4 обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении штаммов возбудителей хронического остеомиелита MRSA, MRSE, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, эффект обусловлен влиянием биостекла на микробные биопленки. Стекло S53P4 оказывает сильное ингибирующее действие на все протестированные патогены. Стекло CaPSiO₂ показывает умеренные антибактериальные свойства [28–30].

В настоящем исследовании нами изучена способность различных составов борсодержащего биоактивного стекла влиять на формирование бактериальной биопленки, образуемой на исследуемом материале мультирезистентным бактериальным штаммом Pseudomonas aeruginosa. Обнаружена заметная разница в антибиопленочной активности образцов. Данные сканирующей микроскопии свидетельствуют о значительном уменьшении биомассы и уменьшении общего объема клеток в биопленках P. aeruginosa с увеличением процентного содержания в образцах B₂O₃ (рис. 9).

Рис. 9.

РЭМ-изображения бактериальной пленки на образцах биостекол: а – 0 мас. % B₂O₃; б – 5 мас. % B₂O₃; в – 15 мас. % B₂O₃.

На образце, представленном на рис. 9a, наблюдаются участки толстой биопленки, и даже единичные клетки развивают выраженные пили адгезии. На следующем образце (рис. 9б) биопленка гораздо более тонкая, разреженная, адгезивные пили практически не видны, много деформированных, по-видимому, погибших клеток. На образце, показанном на рис. 9в, биопленка не сформирована, видны не связанные между собой одиночные бактериальные клетки, пилей нет. Скорее всего, это не активное начало образования биопленки, а просто случайно оставшиеся бактерии из питательной среды. Можно сделать вывод, что B₂O₃ в составе биостекла обладает антибактериальными и антибиопленочными свойствами. B₂O₃ можно рассматривать как эффективный компонент биоактивных стекол для профилактики и лечения связанных с биопленками инфекций протезов костей и суставов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Реализован оригинальный способ синтеза борсодержащего биостекла “45S5 Bioglass” и стеклокерамики на его основе, который заключается в пиролизе смеси органических прекурсоров тетраэтоксисилана, трибутилфосфата, олеата натрия и олеата кальция в жидкой фазе. Получены образцы биостекла объемного типа и в виде тонкослойных покрытий на пористом керамическом носителе γ-Al₂O₃ с содержанием оксида бора 5, 15, 25 и 60 мас. %. Введение бора в состав образцов достигнуто использованием высококонцентрированного органического раствора бора, приготовленного жидкостной твердофазной экстракцией. По результатам РФА показано, что состав образцов включает кальцийфосфатные биокомпоненты в виде апатита и гидроксиапатита, формируемые в зависимости от температурных режимов прокаливания. По данным ИК-спектроскопии установлено, что биостекла имеют тетраэдры [SiO₄] с различной степенью полимеризации, а бор организуется в виде тригонально-координированных боратных групп. Наличие, тип и соотношение кремнийфосфатных и бороксидных группировок в составе образцов определено методом ЯМР на ядрах ³¹Р, ¹¹В, ²⁹Si. Выявлена тенденция к компенсации одного стеклообразователя другим, например, увеличение концентрации мостиковых фосфатных групп в структуре стекла при уменьшении количества вводимого в синтез бора. Методом РЭМ изучена морфология покрытий биостекла на пористом γ-Al₂O₃ отмечено наличие плотного слоя биостекла на внутренней поверхности пор, содержащего кальций и фосфор по данным ЭДС. Исследованы антибактериальные свойства борсодержащих биостекол. Установлено, что повышение концентрации B₂O₃ в составе образцов препятствует образованию бактериальных пленок Pseudomonas aeruginosa на его поверхности.

Показано, что предлагаемый пиролизный способ формирования биостекол из органических растворов в виде объемного материала и тонкослойных покрытий на пористой поверхности керамических носителей является простым и менее длительным по сравнению с золь-гель процессом, а получаемые образцы представляют перспективу для костной имплантологии современной медицины.