Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова, 2020, T. 70, № 2, стр. 277-288

МЕТОДИКА

Исследования выполнены на 115 белых беспородных крысах обоего пола, полученных из питомника “Рапполово”. Эксперименты проводили в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. N 199н). Исследование одобрено Комитетом по этике биомедицинских исследований ФГБУ “ГНИИИ ВМ” МО РФ о соответствии планируемого экспериментального исследования гуманистическим и этическим нормам (протокол № 4 от 10.04.2018 г.).

Тестирование животных осуществляли в лабораторных условиях при температуре 18–24°С, относительной влажности 40–80%. Исключали воздействие постороннего шума и прочих раздражителей, не допускали присутствия в лаборатории животных других видов. В течение 2 нед до начала тестирования животных содержали в виварии с реверсивным светом и свободным доступом к воде и пище. Цель использования реверсивного света заключалась в формировании у крыс новых циркадных ритмов. Известно, что грызуны являются “ночными” животными, наибольшая интенсивность основных биологических процессов которых характерна для темного времени суток (в том числе и процессов, связанных с размножением). В связи с этим животных за 14 сут до начала эксперимента размещали в специально затемненном помещении с искусственным освещением. Цикл освещенности помещения, где размещались экспериментальные животные, включал 2 фазы: темная фаза с 10 ч до 22 ч, светлая фаза с 22 ч до 10 ч. Опыты проводили в течение темной фазы суточного цикла при тусклом красном освещении.

Подготовка экспериментальных животных к тестированию заключалась в формировании устойчивого уровня их половой активности. Подготовку самок осуществляли по модифицированной методике путем овариэктомии [Буреш и др., 1991; Jones et al., 2017; Цветкова, 2017]. Рецептивность самок достигали последовательным подкожным введением масляного раствора β-эстрадиола (“Sigma Aldrich”, США) в дозе 50 мкг на крысу в первый день цикла и масляного раствора прогестерона (“Дальхимфарм”, Россия) в дозе 500 мкг на крысу в третий день цикла. Рецептивность самок подтверждали вагинальным мазком и выраженностью лордоза. Через 7 сут после начала гормональной терапии (по завершению двух эстральных циклов), когда устанавливался регулярный половой цикл, приступали к тренировкам половой активности крыс-самок. Тренировка заключалась в подсадке к самке с гормонально вызванным эструсом самца с предшествующим половым опытом. За период 30-минутной экспозиции фиксировали компоненты полового поведения самок (замирание, вздрагивание, лордоз) и компоненты их антагонистического поведения по отношению к самцам (стойки, вокализация, удары задними лапами). По результатам трех экспозиций для дальнейшего исследования отбирали самок с выраженной рецептивностью и отсутствием антагонистичного поведения. Для экспериментальных исследований было отобрано 40 особей. Эксперименты проводили в третий день цикла спустя 4 ч после введения прогестерона.

Подготовка самцов крыс заключалась в последовательных тренировках, целью которых являлось формирование полового опыта животных. Тренировки проводили два раза в неделю на протяжении двух недель. Тренировка состояла в подсадке к самцу рецептивной самки на период 15 мин. Регистрировали элементы полового поведения: латентный период, число садок, интромиссий, количество эякуляций. В эксперименте использовали “клинически” здоровых половозрелых самцов с массой тела 180–300 г и высоким стабильным уровнем половой активности (1–2 эякуляции за период теста). Для экспериментальных исследований было отобрано 60 особей. Формирование групп осуществляли из животных с близкими средними значениями показателей полового поведения. Каждая контрольная и опытная группа включала шесть самцов крыс. В каждом экспериментальном тестировании использовались новые животные, не участвующие в предыдущих опытах.

Основным инструментом анализа информативности используемых в работе методов являлась сравнительная оценка полового поведения самцов крыс на фоне введения лекарственного средства, оказывающего стимулирующее влияние на половую функцию. В качестве такого средства использовали антагонист α2-адренорецепторов и агонист имидазолиновых рецепторов – йохимбина гидрохлорид (субстанция Sigma Aldrich) в дозе 2.6 мг/кг. Расчет дозы проводили на основании максимальной суточной дозы для человека с использованием межвидовых коэффициентов пересчета доз [Хабриев, 2005]. Препарат вводили самцам крыс опытных групп при всех вариантах тестирования однократно внутрижелудочно за 30 мин до эксперимента из расчета 1 мл на 100 г веса животного. Животные контрольных групп получали внутрижелудочно воду для инъекций в аналогичном объеме.

Половое поведение крыс изучали с использованием батареи тестов, позволяющих количественно оценить выраженность половой мотивации и сексуальной активности самцов крыс по показателям, характеризующим копуляторное поведение животных:

– оценка половой активности в течение 15-минутного парного взаимодействия самца с самкой (Тест 1);

– оценка половой активности в течение 30-минутного парного взаимодействия самца с самкой (Тест 2);

– оценка половой активности при парном взаимодействии самца с самкой до достижения самцом состояния “полового истощения” (Тест 3);

– оценка половой активности при парном взаимодействии самца с самкой после проведения процедуры “полового истощения” самца (Тест 4);

– оценка половой мотивации самца с помощью установки “Камера с преградой” (Тест 5).

В тестах 1–4 регистрировали показатели полового поведения животных: латентный период первой садки с интромиссией (ЛП интр., мин), количество интромиссий в каждой копулятивной серии, количество копулятивных серий, количество эякуляций, длительность взаимодействия самца с самкой (мин), длительность рефрактерных периодов между копулятивными сериями (мин), рассчитывали показатель частоты интромиссий, общее количество интромиссий, общее время копулятивной активности самца (мин).

В тесте 3 критериями завершения полового цикла (или критериями достижения состояния “полового истощения”) считали: отсутствие активности у самца в течение 30 мин после последней эякуляции (критерий насыщения), отсутствие копуляции в течение 60 мин после предъявления рецептивной самки (критерий инертности) или отсутствие эякуляции при сохранении копулятивной активности более 60 мин (критерий несостоятельности).

В тесте 4 введение йохимбина осуществляли сразу после достижения самцом одного из критериев “полового истощения”. Регистрацию показателей полового поведения самца проводили через 30 мин после введения лекарственного средства с новой рецептивной самкой.

В тесте 5 использовали установку “Камера с преградой”, с помощью которой оценивали мотивационную составляющую полового поведения самцов крыс. В основе методики лежало формирование у крыс мотивированного поведения, поддерживаемого положительным подкреплением (рецептивная самка в противоположном отсеке камеры). Во время обучения крысу обучали перебегать из одного отсека камеры в противоположный, где находилась рецептивная самка, по тоннелю с электрифицированным решетчатым полом при отсутствии электростимуляции. Для тестирования отбирали самцов с устойчивым навыком преодолевать тоннель между двумя отсеками. Для экспериментальных исследований было отобрано 15 особей. Общая длительность опытного тестирования составляла 20 мин. Во время тестирования первую побежку в отсек с рецептивной самкой осуществляли при отсутствии электростимуляции. В течение остального периода тестирования на решетку подавали ток силой 0.5 мА. В случае перехода самца через тоннель с включенным электрифицированным полом длительность пребывания самца в отсеке с рецептивной самкой ограничивали временем, требующимся самцу на совершение 3 садок с интромиссиями. Затем самца возвращали в исходный отсек. Регистрировали количество побежек в отсек с подкреплением и латентный период входа в тоннель. По готовности самцов преодолевать заряженную решетку пола для получения подкрепления судили о мотивационном компоненте полового поведения.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0 и Excel 2010. Полученные данные выражали в виде медианы и процентилей [25; 75]. Для анализа данных использовали непараметрические методы статистики: для сравнения количественных показателей – критерий Манна–Уитни, для сравнения качественных показателей – критерий χ² и точный метод Фишера. Критическое значение уровня статистической значимости принимали равным 0.05. Долю животных представляли в виде: количество животных с признаком по отношению к общему количеству животных в группе. Анализ взаимосвязи признаков проводили с использованием метода Спирмена. Сравнительный анализ времени до события осуществляли с помощью метода Каплана–Майера (Statistica 10.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сравнительный анализ копуляторного поведения самцов крыс в тестах 1–4 показал высокую значимость выбора длительности тестирования для оценки стимулирующих эффектов йохимбина (табл. 1).

В тестах 1 и 2 отмечали отсутствие статистически значимых отличий показателей копулятивного поведения самцов между контрольными и опытными значениями. Во всех экспериментальных группах регистрировали высокую скорость инициации спаривания и скорость копуляции, оцениваемые по показателям латентный период садок с интромиссиями и частота интромиссий соответственно. Стимулирующие эффекты йохимбина на половое поведение самцов выявляли только по показателю количество копулятивных серий в тесте 2 (при р < 0.04). При этом различие с контролем значений показателя количество эякуляций в тесте 2 не достигло статистической значимости.

Стимулирующее влияние йохимбина на половое поведение самцов отмечали в тесте 3, что выражалось в практически двукратном снижении частоты интромиссий, 1.5-кратном увеличении количества копулятивных серий и эякуляций относительно контрольной группы.

При тестировании животных после достижения “полового истощения” (Тест 4) в ряде наблюдений фиксировали прирост времени копулятивной активности самцов за счет доли животных без эякуляции при сохранении копулятивной активности более 60 мин (критерий несостоятельности). Отмечали увеличение количества копулятивных серий и эякуляций, но различия значений с контролем статистически были незначимы.

С целью оценки уровня информативности тестов ограниченной длительности (15 мин) был проведен сравнительный анализ половой активности самцов в тестах 1–4 по показателю время копулятивной активности в течение первых 15 мин после предъявления рецептивной самки. Значения показателя в опытных группах находились в диапазоне 7.6–10.8 мин, в группах контроля диапазон значений составил 6.7–13.7 мин. Результаты оценки свидетельствовали об отсутствии возможности выявления стимулирующих эффектов йохимбина на копуляторное поведение самцов в начале полового цикла.

Анализ относительных величин показателей полового поведения самцов крыс позволил выявить активирующее действие йохимбина в тестах небольшой длительности (рис. 1). На примере показателя относительное время отдыха показано стимулирующее влияние йохимбина на потенцию самцов. Это выражалось в статистически значимом снижении значений показателя в тестах 1 и 4 (при p = = 0.05 и р = 0.02 соответственно).

Рис. 1.

Относительное время отдыха (%) самцов крыс во время парного взаимодействия с рецептивной самкой в тестах 1–4. * – значимые отличия от показателя животных контрольных групп, p < 0.05. Количество животных в каждой группе n = 6. Легенда: – среднее значение; – среднее значение ± стандартное отклонение; – среднее значение ± 1.96 стандартное отклонение. 1, 2, 3, 4 – номер теста; К – контрольная группа животных; О – опытная группа животных.

Fig. 1. The relative rest time (%) of male rats during pairing with a receptive female in tests 1–4. * – significant differences from control, p < 0.05. Number of animals in each group n = 6. Legend: – mean; – mean ± standard deviation; – mean ± ± 1.96*standard deviation. 1, 2, 3, 4 – test number; K – control group of animals; O – experimental group of animals.

При оценке уровня возбуждения самцов крыс по показателям длительности постэякуляторного рефрактерного периода (РП) продемонстрирована возможность выявления позитивных эффектов фармакологических агентов в тестах 1–3 (рис. 2).

Рис. 2.

Длительность рефрактерного периода (РП) у самцов крыс при парном взаимодействии с рецептивной самкой в тестах 1–4. По оси абсцисс: количество завершенных копулятивных серий в течение всего периода тестирования. Данные представлены в виде медианы. * – значимые отличия от показателей животных контрольных групп, p < 0.05. Животные, не закончившие последнюю серию, из подсчета исключались. Легенда: – медиана; – межквартильный интервал 25%–75%; – диапазон значений: минимум – максимум.

Fig. 2. The duration of the refractory period in male rats with paired interaction with a receptive female in tests 1–4. Х-asis: the number of completed copulative episodes during the entire testing period. Data are presented as medians. * – significant differences from the animals of the control groups, p < 0.05. Animals that did not complete the last series were excluded from the calculation. Legend: – median; – interquartile range 25%–75%; – range of values: minimum – maximum.

Статистически значимое снижение длительности РП в опытных группах фиксировали в тестах 1, 2 и 3 после первой, первой и второй, первой-пятой копулятивной серии соответственно. Следует учесть, что отсутствие значимости показателя после 3–4 копулятивной серии в тесте 2 и 6–9 копулятивной серии в тесте 3 связано со снижением доли животных с признаком в контрольной группе, что не позволило провести статистическое сравнение значений показателя.

Анализ изменения показателей “Количество копулятивных серий и эякуляций” показал высокую информативность теста 3 по сравнению с другими используемыми в работе методами. В табл. 2 приведены данные о влиянии йохимбина на количество копулятивных серий, совершенных самцами за период тестирования в тестах 1–4. Данные представлены в виде доли животных в группе, выполнивших определенное количество копулятивных серий.

На фоне развивающегося ингибирующего действия эякуляций на механизм возбуждения самцов стимулирующее влияние йохимбина отмечали в тестах 3 и 4 в 7–9 и 3 копулятивных сериях соответственно. Аналогичные результаты были получены при анализе количества эякуляций, совершенных самцами за период тестирования, в тестах 1–4.

На примере распределения животных в контрольных и опытных группах по показателю “длительность завершающей копулятивной серии” (латентный период эякуляции) при различных вариантах тестирования показана высокая информативность тестов 2 и 3. Отмечали статистически значимое позитивное влияние йохимбина на потенцию самцов в середине (тесты 2 и 3) и конце полового цикла (тест 3) (рис. 3 (б), (в)). Высокий уровень естественной половой активности в начале копуляторного цикла (тест 1) и низкая стимулирующая эффективность йохимбина на возобновление половой активности самцов через 60 мин после достижения ими состояния “полового истощения” (тест 4) не позволили получить статистически значимых различий показателя от контрольных значений (рис. 3 (а), (г)). На рисунке для большей наглядности в качестве завершающей копулятивной серии представлены серии № 2, 4, 9 и 2 для тестов 1, 2, 3 и 4 соответственно.

Рис. 3.

Доля животных и латентный период эякуляций в завершающей копулятивной серии при различных вариантах тестирования: (а) – вторая копулятивная серия в тесте 1; (б) – четвертая копулятивная серия в тесте 2; (в) – девятая копулятивная серия в тесте 3; (г) – вторая копулятивная серия в тесте 4. Распределение длительностей латентных периодов эякуляций представлены в виде кривых Каплана–Майера. Легенда: • – обозначены животные, закончившие копулятивную серию эякуляцией; + – обозначены животные без эякуляции; * – значимые отличия от показателя животных контрольных групп, p < 0.05; – контроль; – йохимбин.

Fig. 3. Share of animals and latent period of ejaculation in the final copulative series in various tests: (а) – second copulative series in test 1; (б) – fourth copulative series in test 2; (в) – ninth copulative series in test 3; (г) – second copulative series in test 4. The distribution of the durations of latent periods of ejaculation are presented in the form of Kaplan–Meier curves. Legend: • – marked animals that completed the copulative series of ejaculation; + – marked animals without ejaculation; * – significant differences from the animals of the control groups, p < 0.05; – the control; – yohimbine.

Оценку уровня половой мотивации самцов крыс в настоящей работе проводили по данным теста 3, отражающего полный цикл полового поведения самцов, и теста 5, показателями мотивации в котором являлись латентный период перехода в тоннель с электрифицированным полом и количество переходов в отсек с рецептивной самкой. Информативность тестов определяли по статистически значимым изменениям показателей мотивации через 30 мин после введения йохимбина (табл. 3).

Йохимбин усиливал мотивацию самцов в исследуемых тестах по количеству копулятивных серий (тест 3) и количеству переходов (тест 5). Сравнение групп по качественному признаку (частота встречаемости признака) показало, что применение теста 5 позволяет выявить статистически значимые различия значений показателя с группой контроля. 10-кратное снижение значения показателя “латентный период перехода в отсек” с рецептивной самкой в опытной группе не достигло уровня статистической значимости (р = 0.22). Показатель прекопуляторного поведения (латентный период садок с интромиссиями) не изменялся на фоне введения йохимбина (p = 0.26), корреляционных связей с другими показателями не выявляли.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Оценка половой активности самцов крыс по показателям копуляторного поведения в тестах различной длительности показала высокую значимость выбора длительности тестирования. Отсутствие статистических различий показателей при кратковременном тестировании прежде всего были связаны с высоким уровнем половой активности животных, о чем свидетельствовали отсутствие садок без интромиссий, высокая скорость инициации спаривания, большие значения скорости копуляции. Важным фактором, осложняющим интерпретацию результатов по оценке стимулирующих эффектов йохимбина в начале полового цикла, являлось наличие у самцов предшествующего сексуального опыта. Известно, что поведение сексуально опытных самцов сложнее изменить, воздействуя на них фармакологически [Pfaus et al., 2012]. Отсутствие статистических различий при оценке показателя “время копулятивной активности животных” в тестах 1–4 в течение первых 15 мин после предъявления рецептивной самки, а также высокая скорость инициации спаривания затрудняли выявление стимулирующих эффектов йохимбина в тестах ограниченной длительности. Позитивное фармакологическое действие α2-адреноблокатора проявлялось только в отношении показателя “количество копулятивных серий”, совершенных в течение первых 30 мин после предъявления рецептивной самки (Тест 2). Количество эякуляций при этом значимо не отличалось от контроля, что могло быть обусловлено недостаточной продолжительностью тестирования.

Низкая информативность ограниченных временем тестов, как правило, связана с ошибочностью проведения количественной оценки абсолютных величин показателей полового поведения в отдельности. Любое изменение характера полового поведения автоматически приводит к изменению сопряженных показателей. Например, продолжительное взаимодействие самцов с рецептивными самками приводит к увеличению как количества интромиссий, необходимых для достижения эякуляции, так и длительности копулятивных серий. В связи с этим для выявления фармакологических эффектов в кратковременных тестах необходима оценка не абсолютных, а относительных величин показателей. На примере показателя “относительное время отдыха” продемонстрирована возможность выявления активирующего действия йохимбина в тестах небольшой длительности.

Наибольшая информативность по оценке биологической активности йохимбина показана для метода парного взаимодействия самца с самкой до достижения самцом состояния “полового истощения” (Тест 3). Уровень генитальной стимуляции, необходимый для достижения порога эякуляции и определяемый по общему количеству совершенных интромиссий, был практически вдвое ниже в опытной группе, при этом отмечали увеличение количества копулятивных серий и эякуляций. Полученные данные подтверждают мнение о том, что вероятность обнаружения активирующего действия лекарственных средств выше при анализе изменений в середине и на заключительных стадиях цикла полового поведения, когда активность животных снижена.

Тестирование животных после достижения “полового истощения” (Тест 4) не позволило выявить позитивных эффектов α2-адреноблокатора. Увеличение времени активности и незначительное снижение длительности периода восстановления копулятивной активности самцов отмечали в единичных случаях. Это противоречит данным И. Белозерцевой, в которых отмечено, что с использованием такой экспериментальной процедуры препарат в дозе 2 мг/кг значимо увеличивал долю сексуально активных самцов, скорость инициации спаривания, уровень генитальной стимуляции и среднее число эякуляций, необходимое для достижения полового насыщения [Белозерцева, 2013].

При оценке уровня возбуждения животных по показателю “длительность постэякуляторного рефрактерного периода” тесты 1–2 обладали схожей информативностью. Во всех экспериментальных группах отмечали более быстрое восстановление половой активности самцов после совершенной эякуляции. Наиболее полную информацию о характере влияния йохимбина на длительность восстановления половой активности самцов крыс получили в тесте 3, дающем представление о завершенном цикле полового поведения. Статистически значимые различия показателя с контрольными значениями отмечали после 1–5 копулятивных серий.

Оценка уровня половой мотивации самцов крыс в тестах 3 и 5 показала перспективность изучения стимулирующих эффектов фармакологических средств с помощью установки “Камера с преградой”. Об этом свидетельствовало наличие статистически значимых отличий от контрольных значений такого показателя половой мотивации, как количество переходов в отсек с рецептивной самкой. Сравнение групп по качественному признаку “доля животных, совершивших переход” также указывало на усиление половой мотивации у животных с введением йохимбина. Увеличение выборки животных, возможно, позволило бы получить достоверное подтверждение стимулирующего влияния йохимбина на половую мотивацию самцов по показателю теста 5 – “латентный период перехода в тоннель с электрифицированным полом”. Сравнительный анализ качественных признаков, полученных в результате проведения тестов 3 и 5, показал отсутствие статистической значимости между этими показателями, что позволяет говорить о взаимозаменяемости тестов при оценке половой мотивации самцов крыс в эксперименте.

Отсутствие корреляционных связей между показателем “латентный период садок с интромиссиями” и другими исследуемыми показателями может свидетельствовать о его низкой информативности в отношении мотивированного поведения самцов с высоким уровнем половой активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, сравнительный анализ информативности методов оценки полового поведения у животных показал низкую информативность тестов ограниченной длительности. Одним из способов повышения информативности ограниченных временем тестов является проведение оценки не абсолютных величин показателей, а их отнесенное ко времени количество. Вероятность обнаружения активирующего действия лекарственных средств значительно выше при использовании метода завершенного цикла полового поведения. Этот метод позволяет оценить стимулирующие эффекты препаратов на фоне общего утомления, наступающего вследствие интенсивности и энергоемкости совершаемых действий.

Если задачей исследования является оценка половой мотивации, то выбор метода исследования может быть ограничен небольшой длительностью тестирования. Высокая скорость инициации полового взаимодействия служит маркером выраженности мотивации животных. Однако на экспериментальных моделях с использованием самцов с высоким уровнем активности и предшествующим половым опытом этот показатель теряет свою информативную значимость. Наличие статистически значимых отличий показателей половой мотивации от контрольных значений в тесте 5, а также отсутствие отличий по качественному признаку (сравнение доли животных с признаком в тестах 3 и 5) позволяет рекомендовать применение метода “Камера с преградой” для оценки половой мотивации у животных.