Физиология растений, 2022, T. 69, № 5, стр. 451-461

ВВЕДЕНИЕ

Исследование вторичного метаболизма растений является важной задачей современной физиологии и биохимии. Новые подходы для изучения этого процесса открывают использование культур клеток высших растений. Система in vitro позволяет изучать процесс формирования соединений специализированного обмена в дедифференцированных пролиферирующих клетках, лишенных организменных систем контроля [1]. Особое место в этом направлении занимают морфогенные каллусные культуры или культуры органов растений in vitro с частичной организменной регуляцией. Сопоставление специфики вторичного метаболизма в морфогенных культурах (где присутствуют сформированные ткани, органы и специализированные клетки) и в дедифференцированных клетках in vitro позволяет не только изучать механизмы и системы регулирования этого процесса, но и устанавливать влияние метаболитов на жизнедеятельность растения.

Росянка круглолистная (Drosera rotundifolia L.) – травянистое насекомоядное растение из семейства росянковых (Droseraceae). Экстракты D. rotundifolia обладают антимикробными, противогрибковыми и противоопухолевыми свойствами [2]. Биологическую активность росянки приписывают двум группам фитохимических веществ, характерным для этого рода – 1,4-нафтохинонам и флавоноидам. Большинство этих соединений все еще извлекают из растений путем сбора в естественных местах произрастания. Интенсивное антропогенное воздействие на среду обитания, в том числе осушение болот для нужд сельского хозяйства и заготовки торфа, привели к критическому сокращению ареала росянки. Все три вида росянки, произрастающие в Европе – D. anglica, D. intermedia и D. rotundifolia, включены в список растений, находящихся на грани исчезновения [3]. По данным Baranyai и Joosten на рынке 1 кг сухой биомассы D. rotundifolia стоит 1000−1200 EUR [4]. Таким образом, разработка биотехнологического способа получения биомассы D. rotundifolia имеет практическое и природоохранное значения. Достаточно большой массив работ посвящен микроклональному размножению D. rotundifolia [5, 6] как декоративному растению. И лишь в последнее время стали уделять внимание биохимическому анализу растений, полученных в культуре ткани и факторам, влияющим на этот процесс [7].

Агробактериальная трансформация онкогеном rolC (ген фрагмента плазмиды почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes Conn.) инициирует процесс неопластической трансформации у растений, а также повышает экспрессию защитных генов в клетке и активацию синтезов вторичных метаболитов [8]. В растениях ген rolC чаще всего приводит к карликовости, кустистости, изменению формы листовой пластинки [9], в культуре клеток к интенсивному делению или образованию корней. Однако прямых доказательств механизма действия гена rolC на сегодняшний день не имеется [9].

Цель данной работы – гистологический анализ внутреннего строения и анализ состава вторичных метаболитов двух линий D. rotundifolia: морфогенной линии Green и линии с частичной дифференциацией клеток, трансформированной геном rolC – Red, для установления связи между специализацией клеток и накоплением определенного типа вторичных метаболитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали две линии каллусной культуры D. rotundifolia под обозначением Green и Red.

Получение каллусных культур клеток. Линии Green и Red были получены в 2005 г. из листьев интактного растения. В качестве стерилизующего агента использовали 0.2% диоцид в течение 5 минут с последующей 4−кратной промывкой стерильной водой. Линия Red была получена методом агробактериальной трансформации геном rolC, линия Green – не трансформированная. Линии стабильно культивируются более 15 лет.

Условия культивирования. Культивирование проводили на модифицированной среде Мурасиге-Скуга [10] с пониженным содержанием NH₄NO₃ до 400 мг/л и добавлением тиамина (B₁) ‒ 0.2 мг/л, пиридоксина (B₆) ‒ 0.5 мг/л, никотиновой кислоты (PP) ‒ 0.5 мг/л, мезоинозитола ‒ 100 мг/л, пептона ‒ 100 мг/л, сахарозы ‒ 25000 мг/л, агара ‒ 6000 мг/л и гормонов α-нафтилуксусной кислоты ‒ 2.0 мг/л, бензиламинопурина ‒ 0.5 мг/л. Каллусы выращивали в колбах объемом 100 мл (33 мл питательной среды) в темноте при 25 ± 1°С. Цикл выращивания составлял 28 суток. Для пересева использовали фрагменты каллуса с размером около 1 см³.

Трансформация геном rolC и отбор трансформированных культур клеток. Стерильные листья D. rotundifolia трансформировали с помощью штамма A. tumefaciens GV3101/pPCV002-CaMVC, содержащим в составе бинарного вектора плазмиду pPCV002-CaMVC, несущую ген rolC под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S [11]. Плазмидная конструкция также несет ген nptII резистентности к канамицину (Km) под контролем промотора нопалинсинтазы. Через четыре дня после трансформации в культуральную среду добавляли антибиотик цефотаксим для подавления роста бактерий. Отбор трансгенных клеток на канамицине провели через 30 дней после трансформации, в течение двух месяцев отобрали активно растущие rolC-трансформированные агрегаты в присутствии 50 мг/л канамицина (доза ингибирующая рост клеток).

Выделение и анализ ДНК и РНК. ДНК и РНК экстрагировали из 21-дневных клеточных линий D. rotundifolia [12], ПЦР, ОТ-ПЦР и анализ экспрессии генов rolC и nptII проводили с использованием праймеров, специфичных к генам nptII и rolC, как ранее было описано [13]. Длина продуктов ПЦР составляла 700 п.н. для nptII и 537 п.н. ‒ для rolC.

Гистологический анализ. Для гистологического исследования брали фрагменты каллуса величиной не более 0.5 см³, которые подвергали фиксации ФСУ (50% этанол : 3.7% формальдегид : 5% уксусная кислота, в соотношении 100 : 7 : 7) путем вакуумной инфильтрации, обезвоживали, заключали в парафин и делали срезы толщиной 5−10 мкм с помощью ротационного микротома HM 340E (Microm, Thermo Scientific, Вальдорф, Великобритания). Окраску срезов проводили альциановым синим и ацетогематоксилином по Жинкиной и Вороновой [14]. После гистохимической окраски препараты изучали на микроскопе AxioImager A1 (Carl Zeiss, Йена, Германия).

Фитохимический анализ. Определение вторичных метаболитов в биомассе культур тканей D. rotundifolia проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым и масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-УФ-МС). Для приготовления экстракта 50 мг сухой биомассы исчерпывающе экстрагировали 80% метанолом с использованием ультразвука. Полученный экстракт осаждали с помощью центрифуги Microfuge 22R Centrifuge (Beckman Coulter, США) в режиме 14 000 об/мин (18000 g) в течение 15 минут.

Экстракты анализировали с использованием хроматографа 1260 Infinity (Agilent, США) и тандемного масс-спектрометра Bruker HCT ultra PTM Discovery System (Bruker Daltonik, GmbH, Германия) оснащенного ионной ловушкой. Разделение проводили на аналитической колонке Zorbax C18 (150х2.1 мм, 3.5 мкм, Agilent, США) уравновешенной в растворе А и термостатированной при 40°С. Подвижная фаза состояла из раствора муравьиной кислоты (0.1%) в деионизированной воде (раствор А) и ацетонитрила (раствор Б). Градиентное элюирование проводили со скоростью потока растворителей 0.2 мл/мин по следующей схеме: от 10% до 35% раствора Б за 40 мин, затем до 95% раствора Б до 50 мин и 95% раствора Б до 60 мин. УФ-спектры записывали в диапазоне λ = 200‒800 нм с использованием детектора на диодной матрице, хроматографический сигнал при λ = 245 нм записывали и использовали для определения относительной интенсивности поглощения компонентов экстрактов. Масс-спектрометрические данные получали в режиме ионизации с электрораспылением и регистрации отрицательных ионов с диапазоном регистрируемых значений m/z 100‒1000. Поток газа осушителя (N₂) был 10.0 л/мин, давление газа распылителя (N₂) было 175 кПа, потенциал ионного источника был 4.0 кВ, температура газа осушителя составляла 325°С. МС/МС спектры записывали при напряжении фрагментации 1 В. Хроматографические данные записывали и обрабатывали с использованием Agilent OpenLAB CDS software (v.01.06.111), масс-спектрометрические данные записывали и обрабатывали с использованием Bruker Daltonics Compass 1.3 Data Analysis software (v.4.0.234.0). В работе использовали оборудование Центра коллективного пользования “Биотехнология и генетическая инженерия” ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН.

Масс-спектрометрию высокого разрешения (МСВР) для подтверждения идентификации проводили с использованием хроматомасс-спектрометра Shimadzu LCMS-IT-TOF (Киото, Япония), оснащенного жидкостным хроматографом высокого давления LC-20A Prominence и времяпролетным масс-спектрометром с ионной ловушкой. Условия хроматографического разделения оставили без изменений. Масс-спектрометрические данные получали в режиме ионизации электрораспылением и регистрации отрицательных ионов с разрешением 12 000. Данные записывали и обрабатывали с использованием программного обеспечения Shimadzu LCMS Solution (v.3.60.361).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение культуры тканей D. rotundifolia

Из листьев интактного растения классическими методами культуры ткани растений была получена морфогенная линия Green.

В результате трансформации с помощью A. tumefaciens, несущей плазмидный вектор, содержащий ген rolC под контролем промотора 35S CaMV и путем отбора на среде с канамицином получили одну трансгенную rolC культуру, под обозначением Red. Ген-специфический ПЦР-анализ выявил наличие генов nptII и rolC в ДНК rolC-трансгенной клеточной линии D. rotundifolia (линия Red), что подтверждает успешную трансформацию (рис. 1а). Методом ОТ-ПЦР была показана экспрессия гена rolC в трансформированной клеточной линии Red (рис. 1б).

Рис. 1.

ПЦР-анализ генов nptII и rolC (а) в ДНК образцах клеточных культур D. rotundifolia, ОТ-ПЦР анализ гена rolC (б) в клеточных культурах D. rotundifolia: G – линия каллусной культуры Green, R – линия каллусной культуры Red, ПК – позитивный контроль (плазмида pPCV002-rolABC), НК – негативный контроль (ПЦР-смесь без растительной ДНК-матрицы), М – синтетический маркер молекулярной массы, размер ампликонов – 700 п.н. (nptII), 537 п.н. (rolC).

Морфологическая и гистологическая характеристика линии Green D. rotundifolia

Исследуемая линия Green – морфогенная каллусная культура, преимущественно с побегами бледно-зеленого цвета и основанием коричневого цвета (рис. 2а). Основную часть каллуса (85‒90%) составляют довольно крупные тонкостенные паренхимные клетки округлой или овальной формы 25‒40 мкм в диаметре. Доля меристематических клеток, составляющих каллус не высока (10‒12%). На гистологических срезах четко определяется тканевая дифференциация морфогенных структур: почек, побегов и соматических зародышей (эмбриоидов) (рис. 2б). Формирование корней в клеточной линии не происходило, что вероятно связано с биологией самого растения. Тем не менее, очень редко наблюдалось формирование структур похожих на корни с красноватым оттенком (рис. 2а). Анализ гистологических срезов выявил наличие характерных тканей, соответствующих дифференцированным структурам; эпидерма, хлоренхима, паренхима, проводящая система (ксилемы и флоэмы (ситовидные трубки)) (рис. 2б, в). В субэпидермальной зоне побегов вдоль проводящей системы наблюдалось большое количество запасающих паренхимных клеток с включениями, окрашенными гематоксилином, так же, как и в базальной части каллуса (рис. 2в). Соматические зародыши состоят из одинаковых изодиаметрических клеток, содержащих небольшие вакуоли, большое ядро с несколькими ядрышками и плотную цитоплазму. При формировании соматического зародыша субэпидермальные клетки листьев, претерпевая несколько делений, формировали меристематический бугорок. В дальнейшем на нем закладывались листовые примордии и апекс будущего побега, образующие почку. Листовые примордии развивались в листья (рис. 2б). Периодически внутри основания каллуса наблюдались меристематические зоны. Это может говорить о том, что соматические зародыши формируются из групп клеток. Основание каллуса состояло, главным образом, из проводящей системы, паренхимы с мелкими вакуолями и включениями, и слоя отмирающих клеток, покрытых большим количеством секрета. Этот секрет окрашивался альциановым синим в бледно-голубой цвет, что говорит о присутствии кислых мукополисахаридов в его составе (рис. 2г).

Рис. 2.

Внешний вид (а) и гистологическое строение линии Green каллусной культуры D. rotundifolia. (б) ‒ побег, верхний апекс с меристематическими клетками и листовыми примордиями; развивающийся эмбриоид; (в) ‒ проводящая система; (г) ‒ базальная зона каллуса.

Морфологическия и гистологическая характеристика линии Red D. rotundifolia

Линия Red – каллус малинового цвета, по краям бледно-розовый, в основании бурый (рис. 3а). Основными структурными элементами каллуса линии Red являются глобулярные многоклеточные агрегаты (рис. 3б), состоящие из тонкостенных округлых паренхимных клеток, размер которых в среднем составляет 50 ± 25 мкм (рис. 3в). В более крупных по размеру структурах наблюдалось формирование проводящей системы. Доля паренхимных клеток в линии достигает 80%. Поверхность этих слабо дифференцированных структур была покрыта крупными клетками с характерной темной окраской содержимого и пленкой из секрета разрушенных клеток. Формирование эпидермальных тканей не наблюдали. Окраска внутренних и внешних паренхимных клеток сильно отличалась (рис. 3а). Отдельные слои клеток меристематического типа наблюдали под крупными темными клетками с секретом. Эти клетки делились активно, асинхронно и имели много ядрышек внутри ядра (рис. 3в). Наличие большого количества ядрышек и интенсивная окраска клеток может говорить об активных биосинтетических процессах, происходящих в них (рис. 3б, г). Возобновление этих структур происходило из групп клеток. Дальнейший рост этих участков не приводил к развитию соматических зародышей или побегов. По внешнему и внутреннему строению, эти глобулы напоминали редко встречающиеся в предыдущей линии структуры с красноватым оттенком.

Рис. 3.

Внешний вид (а) и гистологическое строение линии Red каллусной культуры D. rotundifolia. (б) ‒ каллус; (в) ‒ активно делящиеся меристематические клетки, стрелками показаны метафазные клетки; клетка с 5 ядрышками (1 – клетка, 2 – ядро, 3 – ядрышки); (г) – начало формирования новой структуры.

Фитохимическая характеристика

Масс-спектрометрические исследования метанольных экстрактов культуры тканей Drosera rotundifolia L. выявили наличие 11 биологически-активных компонентов полифенольной природы (рис. 4). Идентификация компонентов выполнена путем сравнения полученных экспериментальных данных с ранее опубликованными работами [15–18]. В таблице 1 приведены данные хроматомасс-спектрометрического определения основных полифенолов каллусной культуры двух линий Drosera rotundifolia L., среди которых четыре гликозилированных флавонола – производных мирицетина и кверцетина, эллаговая кислота и три ее производных, а также галлокатехин галлат, гликозид синапиновой кислоты и производное нафтохинона – глюкозид гидроплюмбагина, известный как россолизид.

Рис. 4.

Хроматографический профиль (ВЭЖХ, 245 нм) экстрактов каллусов: (а) ‒ линия Green; (б) ‒ линия Red; (в) – масс-хроматограммы по выбранным ионам. Нумерация на хроматограмме соответствует номерам пиков в таблице 1.

Таблица 1.

Список основных соединений, идентифицированных в метанольных экстрактах каллусов Drosera rotundifolia L. методом ВЭЖХ-УФ-МС

N° пика	tуд, мин	λmax, нм	МСВР, [M-H]-, m/z			Формула	MС/МС фрагментация	Результаты идентификации	Ссылки
			теоретич.	измерен.	погрешн., ppm
1	9.5	238; 330	385.114	385.1132	2.13	C17H22O10	265; 247; 223; 205	Синапоилглюкоза	[17]
2	10.6	275	457.0776	457.0764	2.7	C22H18O11	331; 305; 169	Галлокатехин галлат	[18]
3	13.9	260; 358	479.0831	479.0828	0.65	C21H20O13	317; 316; 179	Мирицетин-3-O-галактозид	[16]
4	14.5	260; 358	479.0831	479.0825	1.28	C21H20O13	461; 317; 316; 179	Мирицетин-3-O-глюкозид	[16]
5	16.8	250; 363	477.0675	477.0679	0.91	C21H18O13	315; 300	3-O-метилэллаговая кислота гликопиранозид	[18]
6	17.2	253; 370	300.9990	300.9996	2.02	C14H6O8	284; 157; 229; 185	Эллаговая кислота	[16]
7	18.1	254; 355	463.0882	463.0871	2.37	C21H20O12	301	Кверцетин 3-О-галактозид	[16]
8	18.4	224; 305; 325; 342	351.1085	351.1094	2.44	C17H20O8	189	Россолизид	[15]
9	18.7	254; 357	463.0882	463.087	2.59	C21H20O12	301	Кверцетин 3-О-глюкозид	[16]
10	19.2	248; 370	491.0831	491.0825	1.25	C22H20O13	476; 329; 314	3,3'-ди-O- метилэллаговая кислота гликопиранозид	[18]
11	33.3	249; 377	329.0303	329.031	2.15	C16H10O8	314; 299	3,3'-ди-O-метилэллаговая кислота	[16]

Компоненты 3 и 4, а также 7 и 9 проявили себя как две пары изомеров в соответствии со сходным спектральным поведением. Типичные для флавоноидов УФ-профили позволили отнести эти компоненты к данному классу соединений. Рассчитанные при помощи МСВР брутто формулы компонентов 3 и 4 (C₂₁H₂₀O₁₃ для ионов состава [M–H]^– с m/z 479.0828 для 3 и 479.0825 для 4) и компонентов 7 и 9 (C₂₁H₂₀O₁₂ для ионов состава [M–H]^– с m/z 463.0871 для 7 и 463.0870 для 9) отличаются на один атом кислорода. МС/МС спектры исследуемых компонентов показали наличие интенсивных сигналов фрагментов (с m/z 317 для 3 и 4, и с m/z 301 для 7 и 9), что определяется элиминированием остатков гексозы (–162 Да). Так, согласно опубликованным ранее данным для видов росянки [16] компоненты 3 и 4 были определены, как галактозид и глюкозид мирицетина, а компоненты 7 и 9 – кверцетина, соответственно.

УФ-спектры компонентов 5, 6, 10 и 11 характерны для производных эллаговой кислоты, с интенсивной полосой поглощения при 248‒254 нм, плечами при ~300 и 350 нм и небольшим максимумом при ~370 нм (табл. 1). Соединение 6 (C₁₄H₆O₈ для [M–H]^– с m/z 300.9996) определено, как эллаговая кислота [16]. Компонент 11 продемонстрировал интенсивный сигнал депротонированных ионов с m/z 329.0310, что соответствует молекулярной формуле C₁₆H₁₀O₈. В МС/МС спектре 11 наблюдались фрагментные ионы с m/z 314 и 299, соответствующие потере двух метильных радикалов (–15 Да каждый). Компонент 11 был определен как диметил-О-эллаговая кислота [16]. Соединения 5 (C₂₁H₁₈O₁₃ для [M–H]^– с m/z 477.0679) и 10 (C₂₂H₂₀O₁₃ для [M–H]^- с m/z 491.0825) показали характерный для О-гликозидов профиль фрагментации – интенсивные сигналы (с m/z 315 для 5 и с m/z 329 для 10), соответствующие элиминированию остатков гексозы (-162 Да). Причем компоненты 5 и 10 отличаются друг от друга на СН₂ фрагмент. Компоненты 5 и 10 были определены, как гликопиранозиды метилэллаговой и диметилэллаговой кислот [18].

Спектральные данные компонента 2 – интенсивная полоса поглощения при 275 нм и сигнал депротонированных ионов с m/z 457.0764 (C₂₂H₁₈O₁₁) – позволили определить его как галлат галлокатехина. Профиль фрагментации [M–H]^– ионов также не противоречил идентификации. МС/МС спектр показал наличие ионов фрагментов с m/z 331 (соответствует потере декарбоксилированных молекул галловой кислоты), 305 и 169 (депротонированные галлокатехин и галловая кислота соответственно) [18].

УФ-профиль компонента 1 с интенсивной полосой поглощения при ~320‒335 нм характерен для транс-оксикоричных кислот и их производных. МС/МС фрагментация депротонированных ионов (с m/z 385.1132, C₁₇H₂₂O₁₀) соединения 1 выявила интенсивный сигнал с m/z 223, соответствующей потере остатка гексозы (–162 Да). Также наблюдались сигналы фрагментов с меньшей интенсивностью – с m/z 265 (потеря части кольца гексозы), с m/z 248 (последующее отщепление воды). Таким образом, соединение 1 определено как гликозид синапиновой кислоты [17].

Компонент 8 был определен как О-гликозид благодаря наблюдаемому в МС/МС спектре интенсивному сигналу иона-фрагмента с m/z 189, который соответствует элиминированию остатка гексозы (–162 Да). Рассчитанная молекулярная формула для депротонированных ионов (C₁₇H₂₀O₈ для [M–H]^– с m/z 351.1094) соединения 8 соответствует выделенному и описанному ранее для видов росянки [15] глюкозиду гидроплюмбагина, известному как россолизид (1,4-нафтохинон).

Содержание эллаговой кислоты в зеленой морфогенной клеточной линии практически в четыре раза, россолизида в три раза превышают таковой в линии Red (рис. 5). В экстракте каллуса линии Red содержание флавонолов на одну четвертую превышало содержание в экстракте каллуса линии Green, кроме вещества галлат эпигаллокатехина.

Рис. 5.

Относительная интенсивность сигнала основных соединений двух линий Drosera rotundifolia L. при длине волны 245 нм. 1 – линия Red, 2 – линия Green.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование процессов, определяющих биосинтетические и морфологические свойства культур клеток высших растений, имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Для многих культур клеток при длительном культивировании (более двух лет выращивании в системе in vitro) характерна потеря способности к дифференциации и переход на активное деление однородных клеток. Однако, наши исследования и литературные данные показывают, что некоторые виды растений способны формировать in vitro стабильные длительно выращиваемые морфогенные культуры [19, 20]. Такие системы расширяют возможности исследования морфогенеза и сопутствующих процессов, характерных для этих видов растений, поскольку стабильность генома в них выше [19]. Во многих исследованиях показано, что в морфогенной структуре сохраняется биосинтез вторичных метаболитов исходного растения [20, 21]. Известно, что с дедифференциацией клеток в условиях in vitro, каллусы теряют и/или меняют биосинтетические свойства [1]. Показано, что интактное растение D. rotundifolia богато флавоноидами, 1,4-нафтохинонами и эллаговой кислотой [7], большинство из этих веществ идентифицированы в исследуемых линиях (табл. 1). При этом морфогенез в культуре клеток, по-видимому, способствовал накоплению эллаговой кислоты, ее производных и 1,4-нафтохинона. Нафтохиноны и флавоноиды Drosera in vivo и in vitro достаточно хорошо исследованы и обобщаются в обзорных работах [22, 23]. Структурное разнообразие производных эллаговой кислоты в культуре клеток Drosera, идентично описанному в литературе для интактных растений D. rotundifolia [7]. Высокая концентрация эллаговой кислоты содержится в плодах и орехах высших растений [24]. Скорее всего, эллаговая кислота участвует в привлечении насекомых, подобно другим органическим кислотам в хищных растениях [25]. У плотоядных растений 1,4-нафтохиноны участвуют в переваривании пищи, защищая от содержащихся в ней микроорганизмов, которые могут заразить ткани самого растения [25]. Обе функции сугубо организменные и сохранение соединений ответственных за них в большей степени в морфогенной культуре, нежели в дедифференцированной, согласуется с классическим пониманием вторичного метаболизма в клетках in vitro [1].

Трансформация геном rolC является мощным инструментом в регуляции вторичного метаболизма и морфогенеза растений [26]. В нашем случае не обнаружено изменений качественного состава метаболитов между двумя исследуемыми линиями, однако наблюдаются существенные изменения в соотношении групп соединений. Красная окраска трансформированной линии может быть обусловлена различными пигментами аналогично секреторным клеткам интактного растения: флавонов, антоцианов, каротиноидов и нафтохинонов [27]. По гистологическому анализу (рис. 2, 3) можно понять, что накопление данных соединений идет в наружном слое структур с частичной дифференциацией. Это, вероятно, связано с защитной функцией данных соединений [28]. При этом, эти структуры напоминают элементы корневой системы росянки, произрастающей в естественных условиях. Корни Drosera умеренного пояса обычно короткие и слабо разветвленные, с анатомическими адаптациями для роста в почвах с дефицитом кислорода и длинными тонкими волосками, не формирующимися в культуре клеток [29].

Схема формирования основных веществ в растениях и клеточных линиях Drosera представлена на рис. 6. Увеличение синтеза кверцетина и мирецитина и их производных при трансформации геном rolC, вероятно, связано с эффектом сайленсинга. Экспрессия генов, кодирующих ферменты-участники вторичного метаболизма, обычно регулируется (подавляется) с помощью miРНК. Продукт гена rolC предположительно нарушает этот процесс, в результате синтез данных соединений повышается [26]. Это же объясняет отсутствие эффекта на галлат эпикатехина, который синтезируется по другой ветви фенилпропаноидного пути. Активация биосинтеза полифенолов геном rolC подтверждается результатами других авторов [30]. Это также сочетается с его функцией стимуляции корнеобразования в культуре ткани [26] и усилением биосинтетических процессов, сопряженных с ним. Тогда как эллаговая кислота, и ее производные, нафтохинон россолизид больше накапливались в морфогенной культуре, что скорее всего, обусловлено организменной ролью данных соединений. Основное соединение D. rotundifolia [15] – плюмбагин, не был идентифицирован в настоящей работе. Возможно, минорное содержание вызвано многолетним пассированием каллуса в условиях in vitro.

Рис. 6.

Пути образования основных соединений культуры клеток D. rotundifolia. Стрелками показаны одноэтапные переходы; пунктирными стрелками указаны пути, проходящие в несколько этапов.

Таким образом, впервые получены длительно растущая морфогенная каллусная культура D. rotundifolia линия Green, и частично дифференцированная rolС-трансгенная линия Red. Проведен анализ гистологического строения линий; масс-спектрометрический анализ их основных соединений; выявлены различия в накоплении нафтохинонов, эллаговой кислоты и ее производных, флавонов в зависимости от типа сформированных тканей и органов. Однако, для более глубоко понимания связи исследуемых веществ с процессами морфогенеза необходимы дополнительные исследования.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследования. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.