1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Физиология растений
  4. T. 69, № 5, 2022

Физиология растений, 2022, T. 69, № 5, стр. 522-530

Рост корней трансгенных растений табака со сверхэкспрессией генов экспансинов и ксилоглюканэндотрансгликозилаз в условиях кадмиевого стресса

З. А. Бережнева a, Х. Г. Мусин a, Б. Р. Кулуев a, *

a Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук
Уфа, Россия

* E-mail: kuluev@bk.ru

Поступила в редакцию 28.12.2021
После доработки 21.02.2022
Принята к публикации 25.02.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Экспансины и ксилоглюканэндотрансгликозилазы играют важную роль в регуляции роста растений при оптимальных и стрессовых условиях. Нами ранее были созданы трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие гены экспансинов NtEXPA1, NtEXPA5 и ксилоглюканэндотрансгликозилазы NtEXGT Nicotiana tabacum L. Целью данной работы стал морфофизиологический анализ корней этих трансгенных растений табака в условиях кадмиевого стресса. Трансгенные растения табака характеризовались увеличенной длиной корней по сравнению с растениями дикого типа, как при оптимальных условиях, так и при воздействии кадмия. Площадь клеток паренхимы корней трансгенных растений табака, сверхэкспрессирующих гены экспансинов NtEXPA1 и NtEXPA5 была больше по сравнению с диким типом, а в случае с трансгеном NtEXGT размеры клеток наоборот были меньше. Сверхэкспрессия генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT способствовала увеличению общей антиоксидантной способности, активности аскорбатпероксидаз и уменьшению содержания пролина в корнях при действии кадмия. В побегах трансгенных по генам экспансинов растений обнаруживалось меньшее содержание МДА как при оптимальных условиях, так и при действии кадмия. Таким образом, показано, что трансгены NtEXPA1 и NtEXPA5 оказывают стимулирующее действие на рост корней табака в условиях кадмиевого стресса за счет усиления роста клеток растяжением и позитивного влияния на компоненты антиоксидантной системы. Ген NtEXGT также вовлечен в обеспечение роста корней при действии кадмия, в том числе через влияние на антиоксидантную систему.

Ключевые слова: Nicotiana tabacum, кадмий, ксилоглюканэндотрансгликозилазы, рост корней, сверхэкспрессия гена, трансгенные растения, экспансины

ВВЕДЕНИЕ

Клеточная стенка растущей клетки растения представляет собой несколько слоев микрофибрилл целлюлозы, погруженных в матрикс, состоящий из связующих гликанов и пектиновых веществ. Экспансины – неферментативные белки, вызывающие обратимое разрушение водородных связей между гликанами и микрофибриллами целлюлозы [1, 2]. Ксилоглюканэндотрансгликозилазы (XTHs) − апопластические ферменты, осуществляющие реакции расщепления и трансгликозилирования связующих гликанов [3]. Суть процесса растяжения клеточных стенок заключается в тандемной и синергичной работе экспансинов, XTHs и некоторых других ферментов путем модификации сети полимеров, представленной микрофибриллами целлюлозы и связующими гликанами.

Сверхэкспрессия экспансинов и XTHs может позитивно влиять на продуктивность и стрессоустойчивость растений не только благодаря стимуляции роста клеток растяжением, но и через воздействие на антиоксидантную систему. Например, трансгенные растения с конститутивной экспрессией гена экспансина риса OsEXPA7 характеризовались уменьшенным количеством АФК и увеличением общей антиоксидантной активности по сравнению с диким типом [4]. Однако, взаимодействие экспансинов и XTHs с антиоксидантной системой, остается малоизученной областью.

Повышенная экспрессия генов экспансинов и XTHs способствует улучшению роста корней благодаря стимуляции роста клеток растяжением [5–7]. Также показано участие экспансинов и XTHs в реакциях стрессоустойчивости растений к засухе, холоду и засолению за счет поддержания роста клеток корней в условиях дефицита влаги [6, 8–10]. Содержание транскриптов генов экспансинов NtEXPA1 [11], NtEXPA5 [12] и ксилоглюканэндотрансгликозилазы NtEXGT [6] повышается в условиях засоления, засухи и низких положительных температур и трансгенные по данным генам растения табака имели улучшенные параметры роста при действии вышеперечисленных стрессовых факторов [6, 7]. Однако, как будут расти корни данных растений в условиях воздействия кадмия оставалось неизвестным.

Кадмий и его соединения оказывают серьезное негативное воздействие на все физиологические и биохимические процессы в растениях [13]. Об участии экспансинов и XTHs в обеспечении устойчивости к кадмиевому стрессу известно очень мало. Например, сверхэкспрессия гена экспансина тополя PtoEXPA12 в растениях табака [14] и гена экспансина пшеницы TaEXPA2 [15] позитивно влияли на формирование устойчивости растений к кадмиевому стрессу. В этой связи представляется актуальным проведение дополнительных исследований вклада экспансинов и XTHs в регуляцию и обеспечение устойчивости к кадмию.

Целью данного исследования являлся морфометрический и микроскопический анализ, а также оценка состояния антиоксидантной системы корней трансгенных растений табака со сверхэкспрессией генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT при кадмиевом стрессе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение трансгенных растений

Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana линии SR1 со сверхэкспрессией генов экспансинов NtEXPA1 [11] и NtEXPA5 [12] и ксилоглюканэндотрансгликозилазы NtEXGT [6] получены методом агробактериальной трансформации листовых дисков, протоколы описаны подробно в соответствующих публикациях [6, 11, 12]. Отбор трансгенных растений проводился по результатам ПЦР-анализа на наличие целевых генов экспансинов и NtEXGT, а также 35SCaMV промотора. Морфометрический анализ проводился на трансгенных растениях второго поколения, выращенных на селективной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением антибиотика гигромицина для элиминации нетрансгенных сеянцев. Уровень содержания транскриптов трансгенов определяли в побегах и корнях полученных трансгенных растений методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Для последующего анализа были отобраны линии трансгенных растений, характеризующиеся высоким уровнем содержания транскриптов трансгенов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT. Было отобрано по 3 линии трансгенных растений табака со сверхэкспрессией генов экспансинов NtEXPA1 и NtEXPA5 и ксилоглюканэндотрансгликозилазы NtEXGT.

Количественная ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Тотальную РНК из корней и побегов исследуемых растений табака выделяли с помощью тризола, первую цепь кДНК строили при помощи олиго(dT) праймера и MMuLV-ревертазы (NEB, США). Количественное определение содержания мРНК генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT проводили методом ПЦР в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I на термоциклере Rotor-GeneTM 6000 (Corbett Research, Австралия). В качестве референсного гена, как и в предыдущих наших исследованиях [6, 7, 10, 11] был использован ген EF-1α N. tabacum, характеризующийся наиболее стабильным уровнем экспрессии при изменении условий среды. Реакцию амплификации проводили в 0.2 мл пробирках (AXYGEN, Inc., США) в объеме 25 мкл, используя реакционную смесь для ПЦР-РВ (Синтол, кат. № М-427, Россия). Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР генов EF-1α, NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT представлены в дополнительных материалах (табл. 1).

Таблица 1.

Площадь клеток корней табака дикого типа и трансгенных растений со сверхэкспрессией генов экспансинов NtEXPA1, NtEXPA5 и ксилоглюканэндотрансгликозилазы NtEXGT при нормальных условиях и при воздействии 200 мкМ ацетата кадмия, мкм2

Растения Нормальные условия Ацетат кадмия
Дикий тип 2836.8 ± 873.3 2959.5 ± 755.2
NtEXPA1 2670.4 ± 806.6 3826.1 ± 655.8
NtEXPA5 2731.4 ± 812.4 3912.3 ± 785.4
NtEXGT 2227.3 ± 693.2 2283.5 ± 675.8

Примечание: жирным шрифтом выделены показатели трансгенных растений, достоверно различающиеся от дикого типа при действии ацетата кадмия (P < 0.05).

Оценка параметров роста корней трансгенных растений табака при действии ацетата кадмия

Трансгенные растения проращивали в климатостатах Binder (Германия) при температуре +25°С, освещенности около 140 мкМ/(м2 с) и фотопериоде 16/8 ч (свет/темнота) на питательной среде МС. Через 10 дней проращивания на селективной среде с гигромицином проростки с одинаковыми размерами корней переносили на вертикально-ориентированные чашки Петри со средой МС и через 10 дней определяли прирост корней (изменение длины) при норме (контроль) и при действии 100, 200 и 400 мкМ ацетата кадмия. Такие же концентрации ацетата кадмия были использованы в наших предыдущих исследованиях и, было показано, что они существенно ингибируют рост корней табака [16]. Измерение длины корней трансгенных растений проводили перед началом эксперимента и по истечению 10-дневного срока. В дальнейшем при обработке результатов эксперимента был учтен только прирост корней трансгенных растений за 10 дней. Контрольной линией выступали растения табака N. tabacum сорта Petit Havana линии SR1 дикого типа. Выборка составила 60 растений для каждой линии. Результаты исследований представляли в виде гистограмм со средними значениями выборки. Барами обозначали стандартную ошибку среднего. Достоверность различий во всех экспериментах оценивали по тесту Duncan (P < 0.05) [17].

Фиксация и микроскопический анализ корней

Корни табака фиксировали в 4% формалине на фосфатном буфере (pH 7.2) в течение 4 ч при комнатной температуре. Далее их переносили в 30% глицерин, приготовленный на 2% диметилсульфоксиде, и выдерживали 30 мин при комнатной температуре. Затем корни перекладывали в “просветляющий раствор” для подготовки к просмотру препаратов под микроскопом. Состав “просветляющего раствора”: 3.7 М KI и 12.5 мМ Na2S2O3 в 100 мл 2% диметилсульфоксида. Далее 35 мл этого раствора смешивали с 65 мл 100% глицерина. Корни табаков выдерживали в “просветляющем растворе” не меньше 1.5 ч, после этого готовили временные препараты в 50% глицерине [18]. Размер клеток корней изучали в вариантах: оптимальные условия роста и рост при действии 200 мкМ CdAc. В обеих вариантах растения выращивали в течение 10 дней перед фиксацией корней. Каждая повторность включала в себя по 10 корней на вариант опыта в каждой исследуемой линии (n = 10). Измерения клеток паренхимы корней проводили в центральной части зоны роста. Зону роста корня определяли визуально в ходе микроскопического анализа по расположению между другими зонами, а также по характерному строению клеток. Размер и площадь клеток анализировали на флуоресцентном микроскопе Biozero BZ-8100 (Япония). Было проанализировано по 150 клеток на каждую вариацию опыта по каждой линии исследованных растений (n = 150).

Анализ антиоксидантной системы трансгенных растений табака в условиях кадмиевого стресса

Активность аскорбатпероксидаз (АПОК) определялась по методу, описанному Verma и Dubey [19]. Метод основан на расчете скорости разложения Н2О2 ферментом аскорбатпероксидазой с образованием Н2О и дегидроаскорбата. Содержание малонового диальдегида (МДА) измеряли с использованием тиобарбитуровой кислоты по методу, описанному Taylor и Millar [20]. Методика определения количества пролина была взята из работы Bates с соавт. [21] с модификациями Khedr и соавт. [22]. Оценка общей антиоксидантной способности (ОAC) проводили на метанольных (80%) экстрактах по восстановлению молибдена (VI) до молибдена(V) в кислой среде [23].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание транскриптов генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT в трансгенных растениях табака

В ходе ранее проведенных работ по агробактериальной трансформации было получено: 11 линий трансгенных растений с геном экспансина NtEXPA1, 15 линий трансгенных растений с геном экспансина NtEXPA5 и 12 линий трансгенных растений с геном XTH NtEXGT. Во всех полученных растениях экспрессия трансгена находилась под контролем конститутивного 35SCaMV промотора. Трансгенность всех полученных линий была доказана при помощи ПЦР и ОТ-ПЦР анализа исследуемых генов. Высокое содержание транскриптов генов экспансинов и NtEXGT было выявлено в побегах всех исследуемых растений. Большое содержание транскриптов генов в корнях было выявлено только у нескольких полученных растений (Дополнительные материалы, табл. 2 ). Далее в экспериментах использовали линии трансгенного табака с повышенной в 3 и более раза экспрессией исследуемых генов в корнях по сравнению с диким типом (рис. 1, Дополнительные материалы, табл. 2 ).

Рис. 1.

Содержание транскриптов генов экспансинов NtEXPA1 (а), NtEXPA5 (б) и ксилоглюканэндотрансгликозилазы NtEXGT (в) в корнях трансгенных растений табака. Звездочками (*) обозначены достоверно различающиеся результаты содержания транскриптов между диким типом и трансгенными растениями после статистического анализа согласно тесту Duncan (P < 0.05).

Дополнительно был исследован прирост корней за 10 дней (рис. 2) этих линий при оптимальных условиях, который подтвердил взаимосвязь изменений содержания транскриптов с ростом корней трансгенных растений со сверхэкспрессией генов экспансинов NtEXPA1 (рис. 2а) и NtEXPA5 (рис. 2д). При оптимальных условиях прирост корней данных растений был в среднем в 1.7 раза больше прироста корней табака дикого типа. У трансгенных растений со сверхэкспрессией гена NtEXGT (рис. 2и) средний прирост корней при оптимальных условиях был в 1.9 раза по сравнению с диким типом.

Рис. 2.

Прирост за 10 дней корней трансгенных растений табака со сверхэкспрессией генов NtEXPA1 (а-г), NtEXPA5 (д-з) и NtEXGT (и-м). Оптимальные условия – (а), (д), (и), 100 мкМ CdAc – (б), (е), (к), 200 мкМ CdAc – (в), (ж), (л), 400 мкМ CdAc – (г), (з), (м). ДТ – дикий тип. Звездочками (*) обозначены достоверно различающиеся результаты прироста корней между диким типом и трансгенными растениями после статистического анализа согласно тесту Duncan (P < 0.05).

Рост корней трансгенных растений табака со сверхэкспрессией генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT при воздействии ацетата кадмия

Прирост корней при выращивании в течение 10 дней на вертикально-ориентированных чашках Петри был проанализирован у всех линий трансгенных растений табака, которые показали повышенное по сравнению с диким типом относительное содержание транскриптов генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT в корнях. При оптимальных условиях (+25°С) достоверное увеличение длины корней по сравнению с диким типом, было выявлено у всех линий трансгенных растений табака со сверхэкспрессией гена NtEXPA1 (рис. 2а), у линий 49 и 56 трансгенных растений табака со сверхэкспрессией гена NtEXPA5, у линии 17 трансгенных растений табака со сверхэкспрессией гена NtEXGT (рис. 2и).

При выращивании растений на среде МС с добавлением ацетата кадмия в концентрации 100 мкМ повышенные показатели прироста корней по сравнению с диким типом выявлены у трансгенных растений табака линии 49 с геном NtEXPA5 (рис. 2е) и линий 17 и 21 трансгенных растений табака со сверхэкспрессией гена NtEXGT (рис. 2к). Линии 5 и 13 трансгенных растений табака со сверхэкспрессией гена NtEXPA1 (рис. 2б) и линия 22 трансгенных растений табака с геном NtEXGT показали снижение прироста корней относительно дикого типа при содержании ацетата кадмия в среде 100 мкМ. При действии 200 мкМ ацетата кадмия более быстрыми темпами роста корней характеризовались все линии изучаемых трансгенных растений (рис. 2в, ж, л), по сравнению с диким типом. При действии ацетата кадмия в концентрации 400 мкМ также почти все линии показали существенно больший прирост корней по сравнению с приростом корней дикого типа, за исключением линии 22 трансгенных растений табака с геном NtEXGT (рис. 2г, з, м).

Микроскопический анализ корней трансгенных растений табака при воздействии ацетата кадмия

Были проанализированы клетки паренхимы корней табака дикого типа и трансгенных растений со сверхэкспрессией генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT при оптимальных условиях и при воздействии ацетата кадмия в концентрации 200 мкМ (рис. 3). Анализ и фиксация клеток проводились через 10 дней после посадки на вертикально-ориентированные чашки Петри. Форма клеток корней была цилиндрическая, вытянутая при оптимальных условиях и при воздействии ацетата кадмия. Только у трансгенных растений табака со сверхэкспрессией гена экспансина NtEXPA1 при воздействии ацетата кадмия 200 мкМ, клетки приобрели кубическую форму (рис. 3г). При этом визуальных изменений в толщине клеточных стенок не наблюдалось.

Рис. 3.

Размеры и форма клеток корней табака дикого типа (а), (б) и трансгенных растений, сверхэкспрессирующих гены NtEXPA1 (в), (г), NtEXPA5 (д), (е) и NtEXGT (ж), (з) выросших при оптимальных условиях (а), (в), (д), (ж) и при воздействии ацетата кадмия в концентрации 200 мкМ (б), (г), (е), (з). Масштаб − 50 мкм.

Было выявлено, что на питательных средах с ацетатом кадмия в концентрации 200 мкМ площадь клеток у трансгенных растений табака со сверхэкспрессией генов NtEXPA1 и NtEXPA5 была больше по сравнению с диким типом. У трансгенных растений со сверхэкспрессией гена NtEXGT площадь клеток паренхимы корней была меньше, чем у дикого типа, как при оптимальных условиях, так и при действии ацетата кадмия (табл. 1).

Анализ антиоксидантной системы в трансгенных растениях табака при воздействии ацетата кадмия

Кадмий негативно действует на растения через увеличение уровня окислительного стресса и образования активных форм кислорода (АФК) в клетках. АФК, в свою очередь, нарушают структуру и компоненты растительной клетки [24]. Так как кадмий воздействует на все растение, было принято решение провести анализ антиоксидантной системы и в корнях, и в побегах трансгенных растений табака со сверхэкспрессией исследуемых генов. Растения для опытов выращивали в течение 10 дней на вертикально-ориентированных чашках Петри, затем проводили соответствующие анализы.

Общая антиоксидантная способность (ОАС) побегов при воздействии кадмия в концентрации 200 мкМ у трансгенных растений табака со сверхэкспрессией всех исследуемых генов была ниже, чем у дикого типа (рис. 4а). ОАС в корнях трансгенных по генам NtEXPA5 и NtEXGT растений при воздействии ацетата кадмия была выше по сравнению с диким типом (рис. 4б).

Рис. 4.

Анализ антиоксидантной системы табака дикого типа и трансгенных растений со сверхэкспрессией генов NtEX-PA1, NtEXPA5 и NtEXGT в нормальных условиях и при воздействии ацетата кадмия в концентрации 200 мкМ через 10 дней после начала опыта на вертикально-ориентированных чашках Петри: (а) – ОАС в побегах; (б) – ОАС в корнях; (в) – активность АПОК в побегах; (г) – активность АПОК в корнях; (д) – содержание МДА в побегах; (е) – содержание МДА в корнях; (ж) – содержание пролина в побегах; (з) – содержание пролина в корнях. ДТ – дикий тип. Звездочками (*) обозначены достоверно различающиеся результаты между диким типом и трансгенными растениями после статистического анализа согласно тесту Duncan (P < 0.05).

В корнях большинства проанализированных трансгенных растений была обнаружена повышенная активность ферментов АПОК по сравнению с диким типом, причем как при оптимальных условиях, так и при воздействии ацетата кадмия в концентрации 200 мкМ (рис. 4в, г).

У трансгенных растений со сверхэкспрессией генов экспансинов содержание МДА в побегах, как при оптимальных условиях, так и при воздействии ацетата кадмия было меньше по сравнению с диким типом (рис. 4д). А вот у трансгенных по гену NtEXGT растений в корнях и побегах, как при норме, так и при кадмиевом стрессе содержание МДА было больше, чем у дикого типа (рис. 4д, е).

Содержание пролина в побегах у всех трансгенных растений при действии ацетата кадмия (рис. 4ж) было больше по сравнению с диким типом. В корнях количество пролина при действии кадмия возрастало как у дикого типа, так и у всех линий растений, однако у трансгенных по генам NtEXPA5 и NtEXGT растений в меньшей степени, чем у дикого типа (рис. 4з).

ОБСУЖДЕНИЕ

Важная роль экспансинов и XTHs заключается в обеспечении роста корней и побегов при действии таких абиотических стресс-факторов, как засуха, гипотермия и засоление [2]. Полученные нами данные доказывают участие экспансинов и XTHs в обеспечении роста корней и побегов также при действии кадмия. Схожие данные были получены Ren с соавт. [15]: растения табака, сверхэкспрессирующие ген экспансина пшеницы TaEXPA2, имели более высокую скорость прорастания, удлинения корней и накапливали большую биомассу по сравнению с растениями дикого типа после обработки CdCl2. Для генов XTHs таких результатов до наших исследований не было показано, хотя об активации экспрессии генов XTHs при действии кадмия данные имеются [25]. Наши результаты, полученные на трансгенных растениях табака, доказывают, что сверхэкспрессия генов как экспансинов, так и XTHs увеличивают устойчивость растений к ацетату кадмия.

Полученные нами трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие гены NtEXPA1 и NtEXPA5 имели увеличенную длину корней по сравнению с диким типом, как при оптимальных условиях, так и при воздействии кадмия в концентрации 200 мкМ за счет увеличения размеров паренхимных клеток в зоне роста растяжением корней. Lee с соавт. [26] также обнаружили корреляцию сверхэкспрессии гена экспансина GmEXP1 на кончиках корней сои с удлинением клеток. Сверхэкспрессия корнеспецифичного гена риса OsEXPA8 улучшала рост корня, за счет стимуляции роста клеток растяжением [27]. Показано, что ген экспансина риса OsEXPA10 участвует в удлинении корневых клеток риса при воздействии алюминия [28]. Таким образом, сверхэкспрессия генов экспансинов положительно влияет на рост растяжением корневых клеток при действии кадмия. Корни трансгенных растений 35S:NtEXGT также росли быстрее, чем у дикого типа, как при норме, так и при кадмиевом стрессе. Однако, в данном случае корреляции роста корней с размерами клеток не прослеживалось. Наоборот, в случае со сверхэкспрессией гена NtEXGT возможно стимулировалось деление клеток (табл. 1).

Трансгенные по генам NtEXPA5 и NtEXGT растения характеризовались повышенной ОАС в корнях при воздействии кадмия, по сравнению с диким типом (рис. 4б). В корнях анализируемых нами трансгенных растений также наблюдалась более высокая аскорбатпероксидазная активность, чем у дикого типа (рис. 4г). Ren с соавт. [15] также обнаружили, что трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ген экспансина пшеницы TaEXPA2 имеют повышенную устойчивость к воздействию CdCl2 за счет увеличения активности компонентов антиоксидантной системы. Необходимо отметить, что в побегах трансгенных растений такие изменения в ОАС и пероксидазной активности не обнаруживались. Видимо, это связано с меньшей стрессовой нагрузкой в органах побега, по сравнению с корнями.

В побегах трансгенных по генам экспансинов растений было обнаружено меньшее содержание МДА, по сравнению с диким типом при кадмиевом стрессе (рис. 4д). Это может говорить о меньшей стрессовой нагрузке, которую испытывают трансгенные растения, возможно за счет защитного эффекта экспансинов [14]. Защитный эффект продукта гена NtEXGT, видимо реализовывался через другие механизмы, так как в корнях трансгенных растений 35S:NtEXGT при кадмиевом стрессе накапливалось даже больше МДА, чем у дикого типа. Такое высокое накопление МДА в данном случае может объясняться более высокими темпами роста корней трансгенных растений, по сравнению с диким типом.

Количество свободного пролина многократно увеличивается в растениях в ответ на воздействие тяжелых металлов, что говорит о чувствительности растений к данному стрессору [29]. Однако, в корнях трансгенных по генам NtEXPA5 и NtEXGT растений мы наблюдали меньшее содержание пролина, чем у дикого типа (рис. 4з). Эти данные также могут говорить о наличии защитного эффекта экспансинов и XTHs при кадмиевом стрессе [15].

Изменения активности антиоксидантной системы при сверхэкспрессии генов экспансинов описывались и ранее [15, 30], при этом до сих пор остается без ответа весьма интригующий вопрос – каков конкретный механизм влияния этих белков клеточной стенки, которые известны в основном лишь как регуляторы роста клеток растяжением, на антиоксидантную систему? Хорошо известно, что некоторые АФК, например, гидроксильный радикал, являются позитивными регуляторами роста клеток, непосредственно участвуя в расщеплении полисахаридов клеточной стенки, то есть действуют синергично с экспансинами и XTHs [31]. Исходя из этого, можно предположить, что в корнях трансгенных растений со сверхэкспрессией генов экспансинов и XTHs происходит компенсаторное уменьшение содержания АФК. Подтверждение этой гипотезы требует проведения дополнительных исследований.

Таким образом, экспансины оказывают стимулирующее действие на рост корней в условиях кадмиевого стресса за счет усиления роста клеток растяжением и позитивных сдвигов в антиоксидантной системе. Ксилоглюканэндотрансгликозилазы также оказывают позитивный эффект на рост корней при действии кадмия, что выражается теми же изменениями в антиоксидантой системе: повышение пероксидазной активности и общей антиоксидантной способности. Гены NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXGT могут быть предложены в качестве целевых для создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью к кадмию.

Работа выполнена в рамках Государственного задания № AAAA-A19-119021190011-0 при поддержке гранта Президента Российской Федерации МД-2304.2020.4.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием животных и людей в качестве объектов исследований. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Шарова Е.И. Экспансины – белки, размягчающие клеточные стенки в процессе роста и морфогенеза растений // Физиология растений. 2007. Т. 54. С. 805.

  2. Cosgrove D.J. Plant expansins: diversity and interactions with plant cell walls // Curr. Opin. Plant Biol. 2015. V. 25. P. 162. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2015.05.014

  3. Van Sandt V.S., Suslov D., Verbelen J.P., Vissenberg K. Xyloglucan endotransglucosylase activity loosens a plant cell wall // Ann. Bot. 2007. P. 1467. https://doi.org/10.1093/aob/mcm248

  4. Jadamba C., Kang K., Paek N.C., Lee S.I., Yoo S.C. Overexpression of rice expansin 7 (Osexpa 7) confers enhanced tolerance to salt stress in rice // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. P. 454. https://doi.org/10.3390/ijms21020454

  5. Lin C., Choi H.S., Cho H.T. Root hair-specific EXPANSIN A7 is required for root hair elongation in Arabidopsis // Mol. Cells. 2011. V. 31. P. 393. https://doi.org/10.1007/s10059-011-0046-2

  6. Kuluev B.R., Mikhaylova E.V., Berezhneva Z.A., Nikonorov Y.M., Postrigan B.N., Kudoyarova G.R., Chemeris A.V. Expression profiles and hormonal regulation of tobacco NtEXGT gene and its involvement in abiotic stress response // Plant Physiol. Biochem. 2017. V. 111. P. 203. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2016.12.005

  7. Kuluev B.R., Berezhneva Z.A., Mikhaylova E.V., Chemeris A.V. Growth of transgenic tobacco plants with changed expression of genes encoding expansins under the action of stress factors // Russ. J. Plant Physiol. 2018. V. 65. P. 211. https://doi.org/10.1134/S1021443718020036

  8. Zhao M.R., Li F., Fang Y., Gao Q., Wang W. Expansin-regulated cell elongation is involved in the drought tolerance in wheat // Protoplasma. 2011. V. 248. P. 313. https://doi.org/10.1007/s00709-010-0172-2

  9. Xu Q., Xu X., Shi Y., Xu J., Huang B. Transgenic tobacco plants overexpressing a grass PpEXP1 gene exhibit enhanced tolerance to heat stress // PLoS One. 2014. V. 9. e100792. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0100792

  10. Kuluev B.R., Avalbaev A.M., Mikhaylova E.V., Nikonorov Y.M., Berezhneva Z.A., Chemeris A.V. Expression profiles and hormonal regulation of tobacco expansin genes and their involvement in abiotic stress response // J. Plant Physiol. 2016. V. 206. P. 1. https://doi.org/10.1016/j.jplph.2016.09.001

  11. Кулуев Б.Р., Князев А.В., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В. Роль генов NtEXPA1 и NtEXPA4 в регуляции клеточного растяжения при росте листьев табака // Генетика. 2014. Т. 50. С. 560. https://doi.org/10.1134/S1022795414010074

  12. Кулуев Б.Р., Сафиуллина М.Г., Князев А.В., Чемерис А.В. Влияние эктопической экспрессии гена NtEXPA5 на размеры клеток и рост органов трансгенных растений табака // Онтогенез. 2013. Т. 44. С. 34. https://doi.org/10.1134/S1062360413010049

  13. Титов А.Ф., Казнина Н.М., Таланова В.В. Тяжелые металлы и растения. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. 2014. 194 с.

  14. Zhang H., Ding Y., Zhi J., Li X., Liu H., Xu J. Over-expression of the poplar expansin gene PtoEXPA12 in tobacco plants enhanced cadmium accumulation // Int. J. Biol. Macromol. 2018. V. 116. P. 676. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.05.053

  15. Ren Y., Chen Y., An J., Zhao Z., Zhang G., Wang Y., Wang W. Wheat expansin gene TaEXPA2 is involved in conferring plant tolerance to Cd toxicity // Plant Sci. 2018. V. 270. P. 245. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2018.02.022

  16. Бережнева З.А., Кашафутдинова А.Р., Кулуев Б.Р. Рост корней трансгенных растений Nicotiana tabacum L. с конститутивной экспрессией гена глутатионсинтетазы рапса BnGSH при действии стрессовых факторов // Вестник защиты растений. 2017. № 3(93). С. 55.

  17. Duncan D.B. Multiple range and multiple F-test // Biometrics. 1955. V. 11. P. 1. https://doi.org/10.2307/3001478

  18. Филин А.Н., Иванов В.Б. Влияние 2,4-Д на пролиферацию и растяжение клеток в корнях Arabidopsis thaliana // Физиология растений. 2016. Т 63. С. 174. https://doi.org/10.7868/S0015330316010061

  19. Verma S., Dubey R.S. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alert the activities of antioxidant enzymes in grooving rice plants // Plant Sci. 2003. V. 64. P. 645. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(03)00022-0

  20. Taylor N.L., Millar A.H. Oxidative stress and plant mitochondria // Methods in molecular Biology. 2007. V. 372. P. 389. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-365-3_28

  21. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline for water-stress studies // Plant Soil. 1973. V. 39. P. 205. https://doi.org/10.1007/BF00018060

  22. Khedr A.H.A., Abbas M.A., Abdel W.A.A., Quick W.P., Abogadallah G.M. Proline induces the expression of salt-stress-responsive proteins and may improve the adaptation of Pancratium maritimum L. to salt-stress // J. Exp. Bot. 2003. V. 54. P. 2553. https://doi.org/10.1093/jxb/erg277

  23. Boestfleisch C., Wagenseil N.B., Buhmann A.K., Seal C.E., Wade E.M., Muscolo A., Papenbrock J. Manipulating the antioxidant capacity of halophytes to increase their cultural and economic value through saline cultivation // AoB Plants. 2014. V. 13. P. 6. https://doi.org/10.1093/aobpla/plu046

  24. Сазанова К.А., Башмаков Д.И., Лукаткин А.С. Генерация супероксидного анион-радикала в листьях растений при хроническом действии тяжелых металлов // Труды КарНЦ РАН. Серия: Экспериментальная биология. 2012. № 2. С. 119.

  25. Liu Y., Yu X., Feng Y., Zhang C., Wang C., Zeng J., Huang Z., Kang H., Fan X., Sha L., Zhang H., Zhou Y., Gao S., Chen Q. Physiological and transcriptome response to cadmium in cosmos (Cosmos bipinnatus Cav.) seedlings // Sci. Rep. 2017. V. 7. P. 14691. https://doi.org/10.1038/s41598-017-14407-8

  26. Lee D.K., Ahn J.H., Song S.K., Choi Y.D., Lee J.S. Expression of an expansin gene is correlated with root elongation in soybean // Plant Physiol. 2003. V. 131. P. 985. https://doi.org/10.1104/pp.009902

  27. Ma N., Wang Y., Qiu S., Kang Z., Che S., Wang G., Huang J. Overexpression of OsEXPA8, a root-specific gene, improves rice growth and root system architecture by facilitating cell extension // PLoS One. 2013. V. 8. e75997. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0075997

  28. Che J., Yamaji N., Shen R.F., Ma J.F. An Al-inducible expansin gene, OsEXPA10 is involved in root cell elongation of rice // Plant J. 2016. V. 88. P. 132. https://doi.org/10.1111/tpj.13237

  29. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 321.

  30. Кулуев Б.Р., Мусин Х.Г., Якупова А.Б. Ген экспансина NtEXPA5 повышает стрессоустойчивость волосовидных корней табака через влияние на антиоксидантную систему // Экологическая генетика. 2021. Т. 19. № 1. С. 5.

  31. Liszkay A., Zalm E., Schopfer P. Production of reactive oxygen intermediates (O2–, H2O2, and OH) by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth // Plant Physiol. 2004. V. 136. P. 3114.

Дополнительные материалы

скачать ESM.docx
Таблица 1. Исследованные гены, последовательности праймеров для ОТ-ПЦР и размеры ампликонов
 
Таблица 2. Отбор линий трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии генов экспансинов и ксилоглюканэндотрансгликозилаз в корнях

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Физиология растений

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал