Физиология растений, 2021, T. 68, № 2, стр. 132-150

ВВЕДЕНИЕ

Развитие науки сопровождается появлением новых данных во всех областях знаний. Знания о молекулярных механизмах действия известных и широко используемых в экспериментальных исследованиях химических агентов постоянно дополняются новой информацией, выявляются неизвестные ранее эффекты, уточняются концентрационные зависимости уже исследованных явлений. Это касается и химических ингибиторов фотосинтеза. В соответствии со свойствами и эффектами на фотохимическую активность фотосистемы II химические ингибиторы подразделяют на две большие группы, производные мочевины и триазина (диурон, атразин) и ингибиторы фенольного типа (диносеб). Основные эффекты диурона исследованы, и этот агент широко используется во множестве научных работ в качестве “тонкого инструмента” исследований. В то же время появляется много сообщений о неизвестных ранее эффектах диурона, диносеба, дибромтимохинона (DBMIB) и других ингибиторов. Кроме блокирования переноса электрона на акцепторной стороне ФС II описаны эффекты диурона и на донорной стороне этой фотосистемы [1, 2]. Показано, что обратимое фотовосстановление феофитина (Pheo) в кислород-выделяющих препаратах ФС II ингибируется диуроном и реактивируется последующим добавлением экзогенного донора электрона, аскорбата [3, 4], что может свидетельствовать о способности диурона ингибировать активность донорной стороны ФС II. Показано, что диносеб способен к окислительно-восстановительному взаимодействию с компонентами реакционного центра (РЦ) ФС II [5, 6]. Показано, что DBMIB значительно тушит возбужденные состояния хлорофилла антенны ФС II даже при низкой концентрации [7]. Доминирование тех или иных эффектов (на донорной или акцепторной стороне ФC II) зависит не только от концентрации ингибирующего агента, но и от концентрации биологического образца [8]. Несомненно, исследователям, использующим в своих работах такие “химические инструменты”, необходимо в полной мере владеть этой информацией, чтобы иметь возможность избежать неправильного толкования получаемых результатов. Выявлена новая группа высокоэффективных ингибиторов переноса электрона в ФС II, производных перфторизопропилдинитробензола (ПФИПДНБ), действие которых основано на формировании короткого циклического переноса электрона с участием первичного донора и акцептора электрона феофитина и хлорофилла P₆₈₀ соответственно (или, возможно, Y_Z) [9–11], показана их способность (в отличие от используемых ранее ингибиторов) проявлять ингибирующее действие на уровне изолированных комплексов D1/D2/цитохром b₅₅₉ – комплексы реакционных центров (РЦ) [12], предохранять ФС II от фотоингибирования за счет образования указанного выше циклического переноса электрона вокруг ФС II с их участием [13], защищать от фотодеструкции в комплексах РЦ преимущественно белок D2 [14], причем местом их связывания в отличие от традиционных ингибиторов (диурона и атразина), очевидно, является не белок D1, а белок D2. Об этом свидетельствуют также результаты исследований места связывания производных ПФИПДНБ [15] и отсутствие конкуренции за место связывания между этими ингибиторами и диуроном [16]. Исследовано несколько больших групп новых металлорганических комплексов способных одновременно эффективно подавлять как фотохимическую, так и карбоангидразную активность ФС II, а также активность нескольких ключевых ферментов растительной клетки [17–19]. Все эти новые результаты требуют тщательного и подробного рассмотрения. Не менее важно, особенно для начинающих экспериментаторов, иметь подробную информацию о самых разных возможных проявлениях действия известных ингибиторов при измерении широко используемых реакций, характеризующих активность ФС II. В современных публикациях в основном описаны главные, устоявшиеся, общепринятые представления о механизмах действия ингибиторов, причем достаточно кратко. Однако почти полностью отсутствует описание детального проявления их действия. Эта информация хорошо отражена в первоначальных работах, в публикациях 70–90-х гг., в которых эффекты ингибиторов не только подробно описаны, но и не менее подробно и обоснованно объяснены. Поэтому еще одной задачей обзора было рассмотрение работ тех лет.

ИНГИБИТОРЫ ДИУРОНОВОГО И ТРИАЗИНОВОГО ТИПА

Диурон и монурон как ингибиторы фотосинтетического транспорта электрона впервые были описаны в работе Весельса и Ван-Дер-Вина в 1956 году [20]. Позже было показано, что эти соединения не ингибируют фотовыделение водорода в ФС I, циклическое фотофосфорилирование, фотовосстановление НАДФ⁺ от восстановленного 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ). На основании гипотезы, что флуоресценция (F) хлорофилла ФС II тушится окисленной формой первичного акцептора электрона Q_A, и того факта, что диурон вызывает значительное увеличение выхода F (подобно воздействиям, приводящим к накоплению Q_A в восстановленном состоянии), было высказано предположение, что диурон блокирует перенос электрона между Q_A и вторичным акцептором электрона Q_B (пулом пластохинонов). Далее в целом ряде экспериментов было показано, что диуроновые и триазиновые ингибиторы блокируют транспорт электрона перед пулом пластохинонов; подавляют темновое реокисление электрон-транспортного компонента Х-320 (Q_A) [20]. Позже [21, 22] было показано, что ингибиторы диуронового и триазинового типа блокируют транспорт электронов на уровне комплекса пластохинонов (Q_AQ_B) и что механизм их действия заключается в понижении среднеточечного окислительно-восстановительного потенциала Q_B относительно Q_A, делающим прямой перенос электрона от ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ к Q_B термодинамически невозможным и тем самым предотвращающим транспорт электрона между ними. Это предположение подтверждалось рядом экспериментальных данных, которые можно было объяснить индуцированием обратного потока электронов от ${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$ к Q_A в присутствии ингибитора. В 1981–1982 гг. в исследованиях на пурпурных фотосинтезирующих бактериях [23] и на ФС II растений [24] было показано, что Q_B может замещаться молекулой ингибитора в Q_B-связывающем участке. При этом ингибирование транспорта электрона происходит вследствие того, что скорость освобождения молекулы ингибитора с Q_B-связывающего участка во много раз меньше скорости освобождения Q_BН₂ [25, 26]. Эти ингибиторы (триазины, мочевины), связанные с Q_B-участком, не могут восстанавливаться от ${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$, и транспорт электрона по этой причине прерывается. На основе предложенного механизма замещения пластохинона гербицидом можно объяснить отмеченный ранее [21, 22] факт индуцирования обратного потока электронов от ${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$ к Q_A в присутствии ингибитора. Перенос электрона ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$Q_B ↔ (Q_AQ_B)^– ↔ Q_A${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$ обратим и происходит с константой равновесия 10–30 [23–27]. Попав на пластохиноновый комплекс (Q_AQ_B), электрон ~95% времени локализован на Q_B (состояние Q_A${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$), а остаток времени – на Q_A (состояние ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$Q_B). В тот момент, когда (Q_AQ_B)^– комплекс находится в состоянии ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$Q_B, пластохинон может покинуть, а гербицид может занять связывающий участок, блокируя связывание нового пластохинона с Q_B-участком. Таким образом, создается впечатление, что ингибитор индуцирует обратный поток электрона от ${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$ к Q_A [21]. В соответствии с этим объяснением, связывание гербицида значительно уменьшается в комплексах в состоянии (Q_AQ_B)^– по сравнению с комплексами с окисленными пластохинонами [28]. Q_BН₂ слабо связан с D1-белком и значительно легче замещается молекулой ингибитора, чем Q_B. В то же время ${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$ гораздо прочнее связан, чем Q_B [29]. Диурон [30] и атразин [31] замещают пластохинон PQ и пластохинол PQН₂, но не семихинон в Q_B-связывающем участке (измерено по бинарной осцилляции связывающего сродства ингибитора от номера вспышки). Связывание атразина ингибируется в присутствии либо эндогенного пластохинона (в восстановленной форме ${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$), либо экзогенного аналога пластохинона [32]. Отмытые от пластохинона тилакоиды эффективно связывают ¹⁴С-диурон, но это связывание нарушается добавлением пластохинона [33]. Замена одной аминокислоты в белке D1, приводящая к появлению устойчивости к целому ряду ингибиторов ФС II, сопровождается значительным (более, чем в 20 раз) уменьшением константы равновесия между ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ и Q_B [23–27]. Это подтверждается также тем фактом, что устойчивые биотипы имеют квантовый выход разделения и стабилизации зарядов на 25–30% меньший, чем у чувствительных растений [34]. Имеется значительное количество данных, свидетельствующих о существовании дополнительных мест действия [35, 36] и целом ряде дополнительных эффектов ингибиторов диуронового и триазинового типов на уровне ФС II. Кроме блокирования переноса электрона на акцепторной стороне ФС II описаны эффекты диурона и на донорной стороне этой фотосистемы [1–4, 37–39]. Показано, что обратимое фотовосстановление Pheo в субхлоропластных кислород-выделяющих препаратах ФС II в анаэробных условиях ингибируется диуроном и реактивируется при последующем добавлении экзогенного донора электрона, аскорбата [3, 4], что может свидетельствовать о способности диурона ингибировать активность донорной стороны ФС II. Уменьшение флуоресценции, связанное с окислением ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ под действием света 1 (свет, возбуждающий преимущественно ФС I, >710 нм), ингибируется диуроном и не реактивируется аскорбатом (в отличие от эффекта, связанного с фотовосстановлением феофитина под действием света 2 [3, 4]. Представлены результаты исследования мест действия четырнадцати ингибиторов ФС II, имеющих разную химическую природу и относящихся к разным типам ингибиторов ФС II [37]. Получены неопровержимые результаты, подтверждающие существование второго сайта ингибирования исследованными агентами на донорной стороне ФС II. Первоначально было обнаружено, что эти ингибиторы подавляют фотовосстановление силикомолибдата тилакоидами хлоропластов, использующими воду в качестве донора электронов [37]. Это указывало на сайт, отличный от хорошо охарактеризованного сайта ингибирования на акцепторной стороне ФС II на D1 белке. Кроме того, на основе данных флуоресценции и способности экзогенного донора электронов, дифенилкарбазида, преодолевать подавление реакции фотовосстановления DCIP в случае всех исследованных ингибиторов кроме бутидазола, сделано заключение о том, что существует второй участок действия этих ингибиторов на донорной стороне ФС II [37]. Исследовано влияние диурона на относительный средний выход кислорода на одну вспышку в зависимости от времени между вспышками в хлоропластах шпината [38]. Обнаружено, что в концентрации, при которой заблокировано около 80% цепей переноса электронов ФС II, относительный средний выход кислорода на вспышку уменьшается с увеличением темнового интервала между вспышками [38]. Сделано заключение о том, что диурон не только действует как ингибитор акцепторной стороны ФС II, но также ускоряет спад положительных зарядов, хранящихся в КВК (кислород-выделяющем комплексе) ФС II [38]. Показано, что подкисление хлоропластов в темноте вызывает снижение способности ферроцианида восстанавливать окисленный цитохром b₅₅₉, которое обратимо при повышении pH [39]. Этот эффект подавляется, если в среду перед подкислением добавляется диурон в относительно низких концентрациях (примерно в 4 раза меньших концентраций, необходимых для подавления переноса электрона на акцепторной стороне ФС II) [39]. Выдвинуто предположение, что способность низких концентраций диурона оказывать специфический эффект на b₅₅₉ подразумевает, что цитохром b₅₅₉ может быть одним из основных сайтов действия диурона [39]. Исследованы эффекты диурона на переходный процесс индукции F хлорофилла (OJIP) у высших растений и обнаружено, что начальный (F₀) и максимальный (F_M) уровни F листьев, обработанных диуроном, не изменяются относительно контроля, если обработка проводится в полной темноте и диурон медленно диффундирует в листья [40]. Путем одновременного измерения пропускания при 820 нм (измерения потока электронов через ФС I) показано, что в образцах, обработанных диуроном, пул пластохинона остается окисленным во время световых импульсов, тогда как в необработанных листьях уровень F_М совпадает с уровнем F_М листьев с полностью восстановленной цепью транспорта электронов. Одинаковые значения величин F_M в обработанных и необработанных диуроном образцах указывают на то, что в неповрежденных листьях значение F_M не зависит от окислительно-восстановительного состояния пула пластохинонов [40]. Кроме того, показано, что обычно наблюдаемое увеличение F₀, вероятно, связано с присутствием (даже очень слабого) света во время обработки диуроном, и что в тилакоидных мембранах в присутствии диурона уровень F_M ниже по сравнению с уровнем F_M контрольного образца [40]. Впервые представлена кристаллическая структура ФС II [41]. Коровые комплексы ФС II выделены из клеток термофильных цианобактерий Thermosynechococcus elongatus с ингибитором, связанным с ФС II, тербутрином, с разрешением 3.2 ангстрема [41]. Было обнаружено, что исследованный ингибитор связывается по крайней мере двумя водородными связями с Q_B-сайтом подобно тому, как это имеет место у аноксигенных пурпурных бактерий. Обсуждается связывание ингибиторов с ФС II с точки зрения влияния на окислительно-восстановительный потенциал Q_A [41].

ФЕНОЛЬНЫЕ ИНГИБИТОРЫ СРАВНЕНИЕ ИНГИТОРОВ ФЕНОЛЬНОГО И ДИУРОНОВОГО ТИПА

В 1979 году ингибиторы ФС II окончательно разделили на две большие группы: диуронового и фенольного типа [42]. Замещенные фенолы (диносеб, иоксинил, нитрофен, бромнитротимол, трифлуралин, тринитрофенол, динитро-о-крезол и т. д.) химически значительно отличаются от ингибиторов типа диурона и атразина и, тем не менее, имеют сходный эффект на электронный транспорт, подавляя восстановление пластохинона на акцепторной стороне ФС II [42]. Детальное рассмотрение ингибиторов фотосинтеза представлено в обзорах Гольдфельда и Карапетяна [43, 44]. Диурон вызывает увеличение флуоресценции хлорофилла ФС II, осциллирующее с периодом два в зависимости от номера вспышки [21]. Полагают, что этот подъем F является следствием переноса электрона от ${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$ к Q_A индуцированного замещением Q_B ингибитором [28]. Подобная осцилляция F была найдена и для атразина, пиразола, диносеба, иоксинила и бромнитротимола с максимумом на нечетную (начиная с первой) и минимумом на четную (вторую) вспышки [45]. При этом измерение F проводили, используя слабый измерительный свет, не способный вызвать подъем F. Добавление гидроксиламина (HA) нарушает донорную сторону ФС II, а электроны, идущие на фотовосстановление Q_B, поставляются (НА) [46]. Увеличение уровня F₀, индуцированное добавлением ингибитора после темновой адаптации предварительно освещенных хлоропластов в этих условиях, свидетельствует о блокировании потока электронов на акцепторной стороне ФС II. Иоксинил, трифлуралин и нитрофен, в отличие от диурона, не вызывали увеличения F₀ [22]. В то же время, в работе [45] показано, что иоксинил вызывает увеличение F₀. При непрерывном освещении нитрофен, трифлуралин, подобно диурону вызывают возрастание F₀ хлорофилла ФС II, а диносеб и иоксинил – нет [22]. В работе [45], наоборот, показано, что только иоксинил вызывает увеличение F₀. Показано, что фенольные ингибиторы (так же как диурон) блокируют процесс фотопереноса электрона между Q_A и Q_B на серию вспышек света [47], измеряемого по ΔА при 320 нм, связанным с образованием анион-радикала семихинона. Эти ΔА осциллируют с периодом два (с уменьшением поглощения в состояниях Q_AQ_B и Q_AQ_BН₂ и увеличением поглощения в состоянии Q_A${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$) поскольку состояние ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$Q_B за ~200 пс переходит в состояние Q_A${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$. Однако после обработки хлоропластов (НА) в темноте и нескольких циклов освещения диносеб вызывает инвертирование ΔА при 320 нм с увеличением на первую и уменьшением на вторую вспышки [47]. Подобный эффект наблюдается при добавлении 4-динитрофенилового эфира 2‑иод-4-нитротимола – ингибитора реокисления PQBН₂ пластохинон-пластоцианин оксидоредуктазой [42]. Фенольные ингибиторы значительно отличаются от ингибиторов диуронового и триазинового типа по эффектам на ЭПР-сигналы Q_A-Fe(II) и Pheo^– [48]; полосы термолюминесценции ФС II [49]. Ингибирование переноса электрона между Q_A и Q_B ингибиторами диуронового и триазинового типа приводит к исчезновению В-полосы термолюминесценции (+30°С), связанной с рекомбинацией зарядов (В1) S₂${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$, и (В2) S₃${\text{Q}}_{{\text{B}}}^{ - }$ [49]. Вместо нее появляется новая полоса (10°С), связанная с рекомбинацией зарядов S₂${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$. Ее обозначают D или Q [49]. Фенольные ингибиторы вызывают сдвиг D-полосы (15°С) [49]. Сохранение D(Q) полосы в присутствии фенольных ингибиторов свидетельствует об их действии между Q_A и Р_Q-пулом. Разное действие фенольных и диуроновых-триазиновых ингибиторов на D-полосу используется для исследования их конкуренции [49]. Применение термолюминесценции для исследования фотосинтетических объектов и действия на них гербицидов подробно описано [49]. Ряд фактов указывают на существование второго места действия фенольных ингибиторов на донорной стороне ФС II. Так, нитрофлуорфен, иоксинил, бутидазол, бромиксинил, диносеб подавляют фотовосстановление молибдата кремния [37], акцептирующего электроны до или от ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$. Искусственные доноры электрона (Н₂О₂ и дифенилкарбазид) предотвращают блокирование этими ингибиторами фотовосстановления дихлорфенолиндофенола [37]. Однако в более ранней работе [22] показано, что иоксинил и диносеб не подавляют фотосинтетическое выделение кислорода с молибдатом кремния в качестве акцептора электрона. Добавление диурона, атразина, диносеба, иоксинила и бромнитротимола вызывает после предварительной вспышки света высвечивание замедленной люминесценции ФС II. Она обусловлена рекомбинацией отрицательного заряда на ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ и положительного заряда, запасенного на донорной стороне ФС II [45]. При внесении ингибитора диуронового типа замедленная люминесценция на последующие вспышки остается высокой и неизменной. В случае производных фенола происходит постепенное (от вспышки к вспышке) понижение уровня замедленной люминесценции, подобно тому, как это имеет место при добавлении гидроксиламина (0.1 мМ) [45]. В присутствии диурона вспышка света вызывает подъем F до максимального уровня F_M. Спад F в этом случае происходит в основном за счет рекомбинации отрицательного заряда на ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ и положительного заряда, запасенного на донорной стороне ФС II. Разрушение кислородвыделяющего комплекса гидроксиламином предотвращает рекомбинацию. В этом случае F сохраняется на максимальном уровне [45]. F₀ измеряли слабым измерительным светом, а перенос электрона индуцировали 25 мс вспышками, следующими с 20 с темновым интервалом. В подобных экспериментах, в отсутствие диурона и НА, показано, что бромнитротимол, диносеб и иоксинил вызывают постепенное увеличение уровня F. При этом десять 25 мс вспышек оказались в 10 раз эффективнее одной 250 мс вспышки. В то же время, определяющей оказалась и длительность темнового интервала [45]. Сделан вывод, что в ингибировании донорной стороны фенольными ингибиторами, происходящем, вероятно, на участке действия НА, задействован некий продукт, образующийся в фотоакте и претерпевающий модификацию в последующей темновой стадии. Ингибиторы диуронового типа не вызывают подобных эффектов. ЭПР сигнал II_S, приписываемый катион-радикалу тирозина-160 белка D2 ФС II, присутствующий в неосвещенных мембранах ФС II, полностью исчезает при добавлении диносеба, но практически не изменяется в присутствии диурона [48]. Подобный эффект вызывают восстановители и некоторые АDRY-агенты [50]. Фенольные ингибиторы вызывают также ускорение темнового спада ЭПР-сигнала II_f, связанного с фотоокислением вторичного донора электрона тирозина 161 D-белка, в трис-обработанных препаратах ФС II [50]. Этот факт указывает на прямое донирование электрона от ингибитора к ${\text{Y}}_{{\text{Z}}}^{ + }$ либо является следствием индуцированных ингибитором изменений, модифицирующих нормальный путь транспорта электронов в ФС II [51]. Диносеб также превращает восстановленную высокопотенциальную форму цитохрома b₅₅₉, обычно присутствующую в неосвещенных мембранах ФС II, в окисленную низкопотенциальную форму [48]. Добавление фенольных ингибиторов приводит к фотоокислению каротиноидов, регистрируемому по характерному увеличению поглощения при 990 нм после возбуждения вспышкой света, тогда как ни атразин, ни диурон, ни о-фенантролин таких эффектов не вызывают [51]. В порядке уменьшения эффективности окисления каротиноидов они могут быть расположены в следующий ряд: диносеб, бромнитротимол, тринитрофенол, иоксинил, динитро-о-крезол, 2,4-динитрофенол. Количество катион-радикала каротиноида, образованного в присутствии ингибитора, зависит от рН среды и значительно увеличивается при рН ниже 5.5 [51]. При низких значениях рН скорость фотообразования катион-радикала каротиноида в присутствии ингибитора уменьшается при разрушении водоокисляющей системы ФС II [51]. Большинство из рассмотренных свойств характерно для группы соединений, обозначаемых как АDRY-агенты – химических соединений, ускоряющих спад запасающих заряд S-состояний кислородвыделяющего комплекса ФС II [50, 52, 53]. Предполагается, что многие из этих эффектов фенольных ингибиторов обусловлены их прямым взаимодействием с компонентами донорной стороны ФС II. В пользу того, что некоторые ингибирующие эффекты фенольных производных обусловлены их способностью к окислительно-восстановительному взаимодействию с компонентами ФС II свидетельствует ряд литературных данных. Так показано сенсибилизированное хлорофиллом фотовосстановление орто- и пара-динитробензенов, при этом эффективность восстановления связана с окислительно-восстановительным потенциалом исследованных соединений. Сообщается о восстановлении нитрогрупп до аминогрупп известного ингибитора фенольного класса – диносеба [54]. Показано, что механизм ингибирования фотохимической активности ФС II ингибиторами фенольного класса – ионолом и его аналогами (антиоксидантами фенольной природы А1–А0), вероятно, заключается в способности этих соединений донировать электрон в условиях конкуренции с процессами фотосинтетического окисления воды [55]. Об окислительно-восстановительных превращениях фенольных соединений в хлоропластах сообщается в работе [56]. Показано, что фенольный ингибитор кверцетин эффективно подавляет фотосинтетический транспорт электрона, причем в основе механизма его действия лежит способность к окислительно-восстановительному взаимодействию с ФС II, а именно в способности кварцетина при определенных условиях выступать в качестве экзогенного конкурентного донора электрона, альтернативного кислород-выделяющему комплексу ФС II [56]. Обнаружена способность фенольного гербицида диносеба к окислительно-восстановительному взаимодействию с компонентами РЦ ФС II – феофитином и хлорофиллом P₆₈₀ [57]. Показано, что добавление диносеба в концентрации 5 мкМ и выше к субхлоропластным препаратам ФС II гороха вызывает ускорение темновой релаксации и уменьшение величины изменений поглощения (ΔА) и флуоресценции (ΔF), связанных с фотовосстановлением Pheo в анаэробных условиях. Диносеб вызывает также подавление фотоиндуцированных изменений F (ΔF), отражающих фотовосстановление акцептора электрона Q_A и фотоиндуцированных изменений поглощения (ΔА), характеризирующих фотоокисление P₆₈₀ [57]. При добавлении дитионита, вызывающего темновое восстановление диносеба, все описанные выше эффекты исчезают. При этом у диносеба появляется способность к блокированию электрона(ов) на РЦ ФС II. Предполагается, что окислительно-восстановительное взаимодействие с первичной ион-радикальной парой вызывающее уменьшение ее времени жизни, вносит вклад в общий эффект ингибирования диносебом переноса электронов в ФС II [57].

Термолюминесценция (ТЛ) как проба фотохимии ФС II; природа пиков ТЛ ФСII хлоропластов в отсутствии и в присутствии ингибиторов ФС II; данные о действии ингибиторов ФС II, подавляющих поток электронов на акцепторной стороне ФС II, а также о том, как ингибиторы ФС II влияют на ее донорную сторону и вызывают сдвиг окислительно-восстановительного потенциала S-состояний, полученные методом ТЛ; наиболее характерные изменения кривой свечения ТЛ хлоропластов, обработанных химически разными ингибиторами ФС II; метод ТЛ как инструмент изучения конкурентного вытеснения разных ингибиторов ФС II с Q_B-связывающего сайта; влияние ингибиторов ФС II на ТЛ хлоропластов, обработанных трипсином; определение участков действия гербицидов с помощью данных полученных методом измерения кривых ТЛ; механизмы действия химически разных ингибиторов ФС II (мочевины, пиридазиноны, фенилкарбаматы, триазины, гидроксихинолины, гидроксибензонитрилы и динитрофенолы) на фотосинтетический перенос электронов и в целом на фотохимию ФС II на основе данных полученных методом ТЛ; классификация ингибиторов ФС II на основе термодинамических параметров, рассчитанных по результатам исследований термолюминесценции хлоропластов, в присутствии ингибиторов, приводятся в обзоре [58]. Показано, что связывание ингибиторов ФС II влияет на редокс потенциал (E_m) пары Q_A/${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ ФС II. Фенольные ингибиторы снижают E_m примерно на 45 мВ, в то время как диурон повышает E_m на 50 мВ. Эти сдвиги выявляются по изменению температуры пиков полос ТЛ, возникающих в результате рекомбинации зарядов в ион-радикальных парах с участием ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ [59]. Полученные данные позволяют объяснить увеличение чувствительности ФС II к свету при действии фенольных гербицидов и снижение фотоповреждения после обработки диуроном. Предполагается, что продукт рекомбинации зарядов пары [${\text{P}}_{{680}}^{ + }{\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$] определяется величиной свободной энергии между радикальными парами [${\text{P}}_{{680}}^{ + }{\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$] и [${\text{P}}_{{680}}^{ + }$Pheo^–]. Когда этот зазор невелик (то есть, когда E_mQ_A/${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ снижается), предпочтительна истинная обратная реакция, при которой образуется [${\text{P}}_{{680}}^{ + }$Pheo^–], состояние, которое распадается с образованием значительного выхода триплета P₆₈₀. Это триплетное состояние хлорофилла реагирует с кислородом, образуя синглетный кислород, ответственный за фотоповреждения ФС II. Когда величина свободной энергии увеличивается (при возрастании E_mQ_A/${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$), выход [${\text{P}}_{{680}}^{ + }$Pheo^–] уменьшается, и большая часть радикальной пары [${\text{P}}_{{680}}^{ + }{\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$] распадается альтернативным менее разрушительным для ФС II способом [59]. Подробно исследованы эффекты 2,4,6-тринитрофенола (TNP) и других фенольных ингибиторов, бромоксинила и диносеба, на энергетику ФС II [60]. В интактной ФС II фенольные ингибиторы связываются только с 90–95% сайтов Q_B даже при насыщающих концентрациях. В оставшихся РЦ ФС II (5–10%) изменяется перенос электронов от Q_A к Q_B, но при этом сохраняется уязвимость к ингибиторам класса мочевины/триазина. Связывание фенольных ингибиторов с Q_B-сайтом было в 30–300 раз медленнее, чем у ингибиторов класса мочевина/триазин (диурона и атразина) [60]. В первом типе РЦ состояние S₂Q_A было в 10 раз менее стабильным в присутствии фенольных ингибиторов, по сравнению с ингибиторами класса мочевина/триазин. Аффинность связывания фенольных гербицидов снижалась в 10 раз в состоянии S₂Q_A по сравнению с состоянием S₁Q_A. Удаление КВК с внешними белками промывкой HA устраняет медленную кинетику связывания, а также дестабилизирующие эффекты на S₂Q_A состояние [60]. Предложена модель, согласно которой редокс потенциал Q_A снижается за счет краткосрочных конформационных изменений, вызванных связыванием фенольного ингибитора в Q_B-нише. Обработка HA устраняет это взаимодействие, возможно, обеспечивая большую гибкость в Q_B-сайте [60]. Выявлен новый участок преимущественного связывания диурона, диносеба, ТФБ и ADRY-агентов с новым хинон-связывающим сайтом Q_C и показано, что результатом такого связывания является сдвиг среднеточечного потенциала E_m высокопотенциальной формы цитохрома b₅₅₉ в сторону отрицательных величин в результате окисления гемовой группы цитохрома этими агентами [61] Представлены данные об эффектах кратковременной обработки клеток зеленой водоросли Chlorella kessleri и цианобактерии Synechocystis salina, имеющих разную организацию ФС II, ингибиторами семейства фенилмочевины (диурон, изопротурон) и фенольного типа (иоксинил), исследованных методом PAM-флуорометрии F хлорофилла ФС II и по скорости фотосинтетического выделения кислорода с помощью электродов типа Кларка и типа Жолио [62] По эффективности ингибирования агенты были расположены в следующем порядке диурон > > изопротурон > иоксинил. Предполагается, что исследованные ингибиторы влияют не только на акцепторную, но и на донорную сторону ФС II, модифицируя Mn-кластер КВК, и что одной из причин разного ингибирования ФС II этими агентами является их влияние в разной степени на кинетические параметры реакций, связанных с выделением кислорода (начальное распределение состояний S₀–S₁, количество заблокированных центров S_B, время оборота состояний S_i, промахов и двойных попаданий). Обсуждается связь между ингибированием гербицидом и изменением кинетических параметров [62]. Показано, что причиной гибели растения, обработанного ингибиторами ФС II, являются повреждения, вызванные развитием окислительного стресса на свету в результате образования синглетного кислорода в РЦ ФС II. Подробно рассмотрены механизмы развития окислительного стресса при действии на ФС II ингибиторов, относящихся к разным семействам (производные мочевины и триазина и фенольные ингибиторы ФС II) [63]. Методом спиновой ловушки показано фотоиндуцированное образование АФК в ФС II, обработанной ингибитором [64]. Установлено, что в отличие от гидроксильного радикала и супероксидного анион радикала, фотогенерация которых происходила независимо от ингибитора, генерация синглетного кислорода в присутствии ингибиторов была выше, чем без них, причем в случае фенольных ингибиторов в два раза больше, чем с ингибитором на основе мочевины [64]. Это коррелирует с данными о влиянии этих ингибиторов на редокс свойства семихинона ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{{ - \,\centerdot }}$ и согласуется с гипотезой о том, что синглетный кислород образуется в реакциях рекомбинации заряда, которые стимулируются связыванием ингибитора и модулируются его природой. В случае, когда с ФС II связаны фенольные ингибиторы, рекомбинация заряда на уровне первичной ион-радикальной пары [${\text{P}}_{{680}}^{{ + \,\centerdot }}$Pheo^–•] термодинамически благоприятствует образованию триплета хлорофилла и, следовательно, синглетному кислороду. В случае ингибиторов на основе мочевины этот путь менее благоприятен [64]. В результате исследования разностных спектров Фурье-спектроскопии (FTIR – Fourier-transform infrared spectroscopy) при фотовосстановлении предварительно окисленного негемового железа (разница Fe2þ/Fe3þ) на мембранах ФС II в присутствии бромоксинила или иоксинила получены данные о структуре, взаимодействии и расположении фенольных ингибиторов в Q_B-сайте, которые помогли прояснить молекулярный механизм сдвигов редокс потенциала Q_A в присутствии этих агентов [65]. Расчеты взаимодействия ингибиторов с Q_B-сайтом, произведенные на основе полученных данных, подтвердили связывание депротонированного бромоксинила с D1-His215, тогда как протонированная форма бромоксинила и диурон связывались с противоположной стороной Q_B-кармана без взаимодействия с D1-His215. На основании этих результатов предполагается, что сильная водородная связь фенолятной CO-группы с D1-His215 вызывает изменение прочности водородной связи Q_A-CO-группы через мостик Q_A-His-Fe-His-фенолят, вызывая соответствующий сдвиг редокс потенциалаQ_A [65].

ADRY-АГЕНТЫ

Ранее были описаны соединения, дестабилизирующие S₂ и S₃ состояния КВК (АNТ-2р, АNТ-2s, ТРВ и FССР) [52, 66, 67], которые были обозначены как ADRY-агенты (Acceleration of the Deactivation Reactions of the water splitting system Y). АNТ-2р считается наиболее эффективным среди АDRY-агентов [52]. Внесение только одной молекулы АNТ-2р на 40 реакционных центров ФС II оказывается достаточным, чтобы вызвать значительное ускорение спада всех 5-ти состояний. ADRY-агенты действуют как очень подвижные катализаторы внутри тилакоидной мембраны, реагируя с водоокисляющей ферментной системой независимо от ее окислительно-восстановительного состояния и образуя с ней переходный комплекс. Предполагается, что происходит быстрый обмен молекулы ADRY-агента между связывающими участками. Многочисленные вычисления и эксперименты по измерению ТЛ [68] свидетельствуют о высоком сродстве ADRY-агентов к водоокисляющей ферментной системе, с константой диссоциации порядка 0.01 мкМ. В хлоропластах с неповрежденным КВК компонент, ${\text{D}}_{1}^{ + }$ окисленный хлорофиллом ${\text{P}}_{{680}}^{ + }$, ревосстанавливается электронами от КВК менее, чем за 1 мс, так что АDRY-агенты практически не могут предотвратить образование S₂ и S₃ состояний, не успевая конкурировать с ними за восстановление ${\text{D}}_{1}^{ + }$. Поэтому считается, что S₂ и S₃ состояния атакуются непосредственно АDRY-агентами. В обработанных трисом хлоропластах ${\text{D}}_{1}^{ + }$ сохраняется в окисленном состоянии, и в этом случае индуцированный АDRY-агентами восстанавливающий эффект на донорной стороне направлен уже на ${\text{D}}_{1}^{ + }$, скорее всего, посредством еще не установленного эндогенного донора электронов [69]. В нормальных хлоропластах, в которых спад S₂ и S₃ состояний, индуцированный АDRY-агентами, происходит через одноэлектронный переход, ${\text{D}}_{1}^{ + }$ мог бы участвовать в индуцированном АDRY-агентами восстановлении S₂ и S₃ состояний, действуя как интермедиат в переносе электрона [66, 67]. АDRY-агенты не влияют на свойства S₀ → S₁ перехода [69]. Показано, что все АDRY-агенты – разобщители, которые имеют кислую NН или ОН группу с рК между 5.5 и 6.0 [70], ковалентно связанные с ароматической системой электронов. После замещения протона в вышеназванных группах эти вещества полностью теряют их ADRY-активность [66]. Высокие концентрации (>10 мкМ) СССР, типичного разобщителя фосфорилирования, ингибируют реакцию Хилла в изолированных хлоропластах [71]. Это ингибирование стимулируется светом [72] и сопровождается обесцвечиванием каротиноидов [73], которое может предотвращаться восстанавливающими агентами и диуроном [73]. СССР в этих же концентрациях понижает выход флуоресценции хлорофилла ФС II [72]. Ингибирование, индуцированное СССР, отличается от ингибирования аминами тем, что ни один из известных доноров электрона не способен восстановить транспорт электронов в ФС II, ингибированной СССР [71, 74], или повысить подавленную СССР флуоресценцию хлорофилла [72, 74]. Добавление диурона или дитионита все же увеличивает выход флуоресценции хлорофилла, но этот стимулирующий эффект быстро исчезает, если концентрация СССР превышает 0.1 мМ. При этом не происходит освобождения Мn [74], поэтому было высказано предположение, что СССР действует непосредственно на первичный донор электрона ФС II [72] или в непосредственной близости к нему [74]. Тетрафенилборон обладает всеми эффектами СССР, и его ингибирующее действие связано со способностью восстанавливать некий окисленный донор электрона в ФС II [75]. Низкие концентрации СССР значительно укорачивают время жизни интермедиатов КВК. Аминотиофены обладают подобным эффектом [76]. АDRY-соединения индуцируют образование цикла внутри ЭТЦ ФС II, в котором некий донор электрона (отличный от Q_A) восстанавливает S₂ и S₃ состояния [67]. В присутствии СССР выход О₂ на вспышку уменьшается, если темновой интервал между вспышками увеличивается [77]. ADRY-агенты полностью ингибируют замедленную люминесценцию (по крайней мере, в диапазоне >50 мс) [78]. ЭПР сигнал II спадает на 50–60% в течение 12 ч в темноте in vivo и за 1 час in vitro. Спад этого сигнала значительно ускоряется в присутствии СССР или NН₂ОН [79]. АNТ-2р, ТРВ и FССР (подобно липофильным анионам) стимулируют фотообразование катиона каротиноида [53], возможно, понижая величину среднеточечного редокс потенциала, (Е_M) каротиноидов и позволяя, таким образом, ${\text{P}}_{{680}}^{ + }$ стать эффективным оксидантом. ТРВ, FССР, СССР и ТМРD окисляют цитохром b₅₅₉ (вызывают превращение цитохрома b₅₅₉ из высокопотенциальной в низкопотенциальную форму после их окисления вторичным донором электрона ФС II–${\text{Y}}_{{\text{Z}}}^{ + }$ или катион-радикалом Кар⁺ [80, 81]. Многие свойства FССР и других разобщителей пытаются объяснить их способностью образовывать липофильные анионы [53, 82]. В то же время способность стимулировать фотообразование катиона каротиноида не зависит ни от рН, ни от рК (для FССР рК = 5.9) исследованных ADRY-агентов [51]. Способность выступать в качестве окислительно-восстановительного катализатора при взаимодействии с компонентами ФС II была проанализирована на основе данных об электрохимических свойствах ANT-2p и некоторых его структурных аналогов (ANT-2а и ANT-2f) [83]. При проведении циклической вольтамперометрии в водных средах на платиновом электроде ANT-2p и его аналога ANT-2а в каждом случае был выявлен отчетливо выраженный пик окисления в диапазоне потенциалов от +0.9 до +1.0 В. Отсутствие пика при развертке потенциала в восстановительную сторону показало, что образовавшийся продукт окисления этих агентов не способен обратимо восстанавливаться. Однако в случае ANT-2f (аналога, не обладающего ADRY-активностью даже при соотношении 50 молекул на ФС II) имелись четко выраженные пики восстановления продукта окисления этого агента [83]. Полученная величина потенциала окисления ANT-2p (1.0 В) показывала, что в ФС II ANT-2p может быть окислен только первичным донором электрона, хлорофиллом Р₆₈₀. На основе полученных данных был сделан вывод о том, что ADRY-эффект ANT-2p, обусловленный обратимой окислительно-восстановительной реакцией, представляется маловероятным [83]. Показано, что ни ANT-2p, ни о-фенантролин, ни диурон не способны подавлять фотохимическую активность изолированных D1/D2/цит. b₅₅₉ реакционных центров ФС II [84]. Ни один из этих указанных выше агентов не ингибировал фотоиндуцированный перенос электрона от экзогенного донора электрона дифенилкарбазида к экзогенному акцептору электрона силикомолибдату независимо от того, добавлялись указанные агенты до или после добавления силикомолибдата [84]. Показано, что в хлоропластах Ant-2p по-разному действует на разные популяции высокопотенциальной формы цитохрома b₅₅₉ (cytb₅₅₉HP) [85]. В присутствии Ant-2p, начиная с 1 мкM и выше, примерно половина cytb₅₅₉ подвергается автоокислению в темноте. Эта фракция cytb₅₅₉HP подвергается быстрому фотовосстановлению с последующим повторным окислением в темноте. Фотовосстановление может ингибироваться диуроном, но не DBMIB, что предполагает участие в этой реакции Q_A или пула пластохинонов. Другая фракция cytb₅₅₉HP подвергается медленному необратимому фотоокислению в присутствии более низких концентраций Ant 2p [85]. Получены экспериментальные данные об электрохимических свойствах ADRY-агента, (2-(3-хлор-4-трифторметил)-анилин-3,5-динитротиофенола – ANT-2p [86]. Выяснено, что в апротонных растворителях ANT-2p необратимо окислялся при потенциале 1.35 В и необратимо восстанавливался при потенциале –0.03 В. Методом циклической вольтамперометрии определены потенциалы продуктов окисления и восстановления, они составили 0.45 и 0.27 В соответственно [86]. Высказано предположение от том, что наиболее вероятным механизмом взаимодействия ANT-2p с компонентами ФС II может быть первичное восстановление этого агента на акцепторной части ФС II, окисление его образовавшейся восстановленной формы любым окисленным компонентом донорной стороны ФС II и последующая регенерация окисленной формы на акцепторной стороне этой фотосистемы [86]. Возможен был и другой путь (окислительный), когда первичным актом было бы окисление на акцепторной стороне ФС II. Однако авторы публикации считают его менее вероятным с энергетической точки зрения [86]. Показано, что карбонилцианид м-хлорфенилгидразон (CCCP) в хлоропластах ингибировал реакцию Хилла с феррицианидом (Fe₃Cy) в качестве экзогенного акцептора электрона и сопряженное с этой реакцией фотосинтетическое выделение кислорода изолированными хлоропластами [87] и подавлял фотосинтетическое выделение кислорода, сопряженное с фотовосстановлением силикомолибдата (SiMo) [87], но лишь незначительно уменьшал фотовосстановление SiMo. Аналогичные результаты были получены и для другого ADRY-агента, ANT2p [87]. Ингибирование указанных фотореакций было максимальным при значениях рН, соответствующих рК CCCP (5.95). CCCP не ингибировал перенос электрона от восстановленного TMPD или дурохинола к метилвиологену, т. е. с участием только ФС I [87]. CCCP не влиял на наносекундную флуоресценцию хлорофилла в хлоропластах, инкубированных при низкой интенсивности света, но приводил к ее уменьшению при высокой интенсивности света. Эффективность ингибирующего действия CCCP на фотовосстановление FeCy зависит от скорости потока электронов, которая контролируется интенсивностью света [87]. Методом циклической вольтамперометрии CCCP в водном буфере выявлен хорошо разрешаемый пик окисления с соответствующим окислительно-восстановительным потенциалом равным +1.17 В. Последующая восстановительная развертка вольтамперограммы показала пик восстановления с окислительно-восстановительным потенциалом равным +0.34 В [87]. Сделано заключение, что CCCP окисляется на донорной стороне ФС II с последующим восстановлением на акцепторной стороне электронами от мембранного пула пластохинона, конкурируя за электроны с Fe₃Cy и комплексом цитохрома b/f и образуя, таким образом, циклическую цепь переноса электронов вокруг ФС II. Предполагается, что исследованные агенты служат донорами протонов, а не просто донорами электронов на окисляющей стороне ФС II [87]. Получены данные о влиянии CCCP на ФС II в тилакоидах методом регистрации полифазных кинетик индукции быстрой флуоресценции хлорофилла ФCII (OJIP-тест) [88]. Показано, что в отсутствие других добавок CCCP в малых концентрациях увеличивал величину выхода F хлорофилла на J-этапе, выход F на P-этапе оставался неизменным. При постепенном повышении концентрации CCCP выход флуоресценции на J-шаге продолжал постепенно увеличиваться, а выход F на P-шаге начинал постепенно уменьшаться. Кроме того, уже при этих концентрациях СССР подобно диурону начинал проявляться эффект постепенного увеличении уровня F на шаге O (F₀), наиболее выраженным это увеличение становилось при более высоких концентрациях CCCP (60 мкм и особенно 290 мкМ) [88]. В высокой концентрации СССР вызывал ярко выраженное снижение F на шаге P. Возможные детали действия CCCP на ФС II в тилакоидах на полифазную кинетику индукции быстрой флуоресценции хлорофилла ФC II на этапе от J к P были исследованы в присутствии окисленной формы TMPD (TMPD-ox – агент, увеличивающий мембранный пул окисленного пластохинона за счет окисления пластохинола) в условиях, инициирующих фотоиндуцированное проявление отчетливого I-пика в OJIP-кинетике [88]. Показано, что в присутствии TMPD, CCCP при постепенном повышении концентрации, начиная с малых концентраций, также постепенно увеличивал выход F хлорофилла на J-этапе и уровень O (F₀) и приводил к постепенному снижению выхода F на P-этапе. Зависимое от концентрации CCСP возрастание выхода F на J-этапе происходило до достижения максимума равного F на I-этапе, тогда как величина F на этапе P продолжала уменьшаться [88]. Ускоренное возрастание F на J-этапе, вызванное СССР, вероятно, можно объяснить подавлением нефотохимического тушения F Хл (S₂ + S₃)-состояниями кислород-выделяющего комплекса и окисленного P₆₈₀, первичного донора электрона ФС II [88].

ПРОИЗВОДНЫЕ ПФИПДНБ

Недавно была разработана и синтезирована группа новых химических агентов, производных ПФИПДНБ, как ожидалось, возможных потенциальных ингибиторов фотосинтетической активности. Был проведен первичный скрининг, отобраны агенты, действовавшие с разной степенью эффективности на фотосинтетическую активность тилакоидов, и подробно исследовано их действие на функциональную активность фотосинтетического аппарата [6, 9–16]. Далее будет использовано также обозначение K15 – одного из самых эффективных соединений (4-[метоксибис(трифторметил)метил]-2,6 динитрофенилгидразон метил кетона), чье действие на исследованные реакции характерно практически для всей группы исследованных агентов. Было показано, что производные ПФИПДНБ подавляли индуцированное светом выделение О₂ и восстановление НАДФ⁺ хлоропластами, нарушая транспорт электронов от воды к НАДФ⁺, но не влияли на фотовосстановление НАДФ⁺ в условиях, когда в эту реакцию была вовлечена только ФС I. Эти данные, тот факт, что производные ПФИПДНБ подавляли также индуцированные светом ΔF ФС II у хлоропластов и у субхлоропластных препаратов ФС II, а также совпадение зависимостей этих эффектов от концентрации K15 указывало на то, что место действия данных соединений находится на уровне ФС II.

Было показано, что уже в концентрации 10–15 нМ К15 вызывал снижение уровня F_M за счет уменьшения величины ΔF на 15%. В концентрации 80–360 нМ К15 еще больше снижал фотоиндуцированные ΔF вплоть до 90%. Величина I₅₀, концентрация ингибитора, вызывающая 50%-е подавление ΔF, для К15 равнялась 70 нМ [9]. Ингибирующее действие на ΔF полностью сохранялось при длительном (>5 мин) освещении актиничным светом даже при использовании очень малых концентраций ингибитора. Этот факт, а также отсутствие ускорения темновой релаксации ΔF, связанной с фотовосстановлением Q_A, свидетельствовали о том, что подавление ΔF и понижение общего уровня F, вероятно, не являлось следствием акцептирования электронов агентом К15 от ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ [9]. С другой стороны, ΔF ФС II, подавленные агентом К15, не реактивировались последующим добавлении экзогенных доноров электрона ФС II независимо от последовательности внесения реагентов [9]. Известно, что понижение F_M за счет подавления ΔF наблюдалось в результате полного удаления эндогенного Мn при инактивации донорного участка ФС II. Однако при этом, в отличие от К15, добавление экзогенных доноров электрона ФС II восстанавливало ΔF практически до исходного значения, как это неоднократно отмечалось и ранее [3]. Было предположено, что подавление фотоиндуцированных ΔF ФС II агентом К15, вероятно, не связано с блокированием переноса электронов на донорной стороне ФС II [9].

В отличие от диурона, К15 не блокировал перенос электрона на акцепторной стороне ФС II, т. к. не приводил ни к увеличению уровня F₀ ни к замедлению темнового спада ΔF [9]. Кроме того, К15 (в отличие от диурона) не приводил к прерыванию взаимодействия ФС II и ФС I через цепь переноса электронов, измеряемого по уменьшению F ФС II вследствие окисления Q_A при дополнительном возбуждении ФС I в хлоропластах.

Ингибирующие эффекты К15 на ΔF ФС II полностью устранялись в присутствии дитионита (>0.8 мг/мл). Флуоресценция поднималась до максимального уровня. Включение актиничного света приводило к тому, что F уменьшалась, приводя к отрицательным значениям ΔF, отражающим восстановление Pheo. Полосы поглощения К15 при 200–500 нм с максимумом при 420 нм исчезали, свидетельствуя о темновом восстановление К15 дитионитом [9].

Ранее [4] было показано, что индуцированное светом восстановление Pheo до Pheo^– в ФС II возможно в анаэробных условиях. В этом случае F также достигала уровня F_M вследствие фотовосстановления Q_A до ${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ слабым измерительным светом, а при освещении актиничным светом наблюдалось уменьшение флуоресценции (–ΔF) и изменения поглощения (ΔА), связанные с обратимым восстановлением Pheo. Внесение 30–40 нМ К15 приводило к резкому (более, чем в 15–20 раз) ускорению темновой релаксации соответствующих ΔА и –ΔF, указывая на возрастание скорости темнового окисления Pheo^– [9].

В больших концентрациях агент К15 вызывал значительное уменьшение фотоиндуцированных –ΔF и ΔА, а также уменьшение уровня F_М. При этом освещение актиничным светом не вызывало увеличения F, связанного с фотовосстановлением Q_A. Однако при использования вместо К15 известных акцепторов электрона ФС II, вызывающих темновое окисление Q_A, подобное уменьшение F в анаэробных условиях сопровождалось появлением фотоиндуцированного увеличения F. Диурон в концентрации до 50–100 мкМ не изменял ни кинетику, ни величину ΔА и –ΔF, связанных с фотовосстановлением Pheo, ни величину F_M в анаэробных условиях [9].

В дополнительных экспериментах было показано, что К15 в концентрации до 100 мкМ не уменьшает F хлорофилла светособирающих пигмент-белковых комплексов, а также раствора хлорофилла в 1% тритоне Х-100. Резкое ускорение темновой релаксации спектральных эффектов, отражающих светоиндуцированное восстановлением Pheo в результате реакции [P₆₈₀Pheo]${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$ → [P₆₈₀Pheo^–]${\text{Q}}_{{\text{A}}}^{ - }$, и, как следствие этого, уменьшение величины этих эффектов свидетельствовали в пользу того, что в присутствии К15 значительно сокращается время нахождения Pheo в восстановленном состоянии ввиду его быстрого реокисления. Тогда уменьшение величины положительных ΔF в аэробных условиях и понижение уровня F_M в анаэробных условиях могло быть интерпретировано как результат ускорения распада пары [${\text{P}}_{{680}}^{ + }$Pheo^–], индуцированного соединениями К15 вследствие окисления Pheo^– [9].

Можно было бы предположить, что действие К15 на окислительно-восстановительное состояние Pheo было обусловлено не прямым его участием в акцептировании электрона от Pheo^–, а, например, вследствие увеличения доступа кислорода к Pheo^–. Однако сохранение характерной эффективности ингибирующего действия К15 и в анаэробных условиях свидетельствовало против этого предположения [9].

В то же время ингибирующее действие соединений К15 нельзя было объяснить только акцептированием электронов от Pheo^–. Ведь в таком случае должен был бы наблюдаться эффект истощения ингибирующего действия К15 при длительном освещении вследствие накопления ингибиторов в восстановленном состоянии, чего в действительности не происходило [9].

Ранее было показано, что скорость фотоиндуцированных ΔF, отражающих обратимое фотовосстановление Pheo, в восстановительных условиях (в присутствии дитионита) на препаратах ФС II, лишенных Mn, возрастает в 1.5–2 раза при добавлении экзогенного донора электрона, Mn²⁺ [3]. Подобный эффект наблюдался также в присутствии K15 [9]. Скорость темнового окисления Pheo^– при этом не изменялась. Ускорение реакции фотовосстановления Pheo при добавлении К15 в присутствии дитионита указывало на способность восстановленной дитионитом формы К15 донировать электроны на компоненты РЦ ФС II.

Добавление К15 приводило к уменьшению величины фотоиндуцированных ΔА при 678 нм, связанных с фотоокислением первичного донора электрона Р₆₈₀, в препаратах ДТ20, лишенных Мn, в присутствии феррицианида калия и молибдата кремния. Подобное уменьшение величины ΔА при 678 нм наблюдалось также и ранее при добавлении к таким препаратам Мn²⁺ (0.1–3 мкМ), приводящим к реактивации донирования электрона на РЦ ФС II [9]. Агент К15 подавлял также ΔА при 820 нм, связанные с фотоокислением Р₆₈₀ при измерении этой фотореакции с микросекундным временным разрешением как в присутствии, так и в отсутствие феррицианида калия и модибдата кремния. Кроме того, производные ПФИПДНБ подавляли также фотоиндуцированный ЭПР-сигнал II, связанный с фотоокислением вторичного донора электрона Z.

Было показано, что производные ПФИПДНБ (K15) ингибировали перенос электрона в изолированных комплексах D1/D2, цит.b₅₅₉ РЦ ФС II, измеренный по фотохимическому восстановлению молибдата кремния в присутствии дифенилкарбазида и фотоокислению хлорофилла P₆₈₀ с эффективностью, сравнимой с таковой для субхлоропластных препаратов, обогащенных ФС II [12].

Производные ПФИПДНБ вызывали резкое падение квантового выхода и уменьшение длительности медленной (наносекундной) компоненты кинетики затухания F. Длительность и амплитуда быстрой (300 пс) компоненты F практически не изменялась. В присутствии дитионита ПФИПДНБ не влияли на ФC II, при этом длительность и относительный вклад квантового выхода медленной компоненты F принимали свои исходные значения, а кинетика затухания полностью, совпадала с контрольной [6]. Эти данные указывали на увеличение скорости распада первичной ион-радикальной пары [${\text{P}}_{{680}}^{ + }$Pheo^–] за счет взаимодействия ПФИПДНБ с компонентами РЦ ФС II [6].

Совпадение концентрационных зависимостей ингибирующего действия ПФИПДНБ для всех рассмотренных выше фотореакций, а именно: 1) фотоиндуцированных ΔF, связанных с фотоиндуцированным восстановлением Q_A, 2) величины F_M в анаэробных и в аэробных условиях, 3) фотоиндуцированных –ΔF и ΔА при 685 нм, связанных с фотоиндуцированным восстановлением Pheo, а также 4) фотоиндуцированных ΔА при 678 нм, связанных с фотоокислением хлорофилла Р₆₈₀, свидетельствовало об единой природе их ингибирования [9]. Предполагалось, что ПФИПДНБ, принимая электрон от Pheo^– и передавая его на ${\text{Y}}_{{\text{Z}}}^{ + }$ (или непосредственно на ${\text{P}}_{{680}}^{ + }$), замыкали перенос электрона в ФС II. Не исключалось, что производные ПФИПДНБ, попадая в РЦ ФС II, выполняли роль, подобную Q_A, или даже замещали Q_A. Было показано, что окислительно-восстановительный потенциал ПФИПДНБ лежит в области –400 мВ. Вследствие этого, принимая электрон от Pheo^–, производные ПФИПДНБ, (в отличие от Q_A, имеющего потенциал около ‒0.130 мВ), не способны задерживать его на достаточно длительное время, и он вновь возвращается на ${\text{P}}_{{680}}^{ + }$ или на ${\text{Y}}_{{\text{Z}}}^{ + }$, что и приводило к нарушению базального переноса электрона в ФС II [9].

Было показано, что величина I₅₀ для подавления реакций ФС II в случае наиболее активных ПФИПДНБ составляет от 50 нМ до 0.1 мкМ, что соответствует примерно одной молекуле ингибитора на РЦ ФС II. У менее активных соединений она достигала значения 1 мМ, т. е. более 1000 молекул на РЦ ФС II [10]. В результате исследований зависимости ингибирующей эффективности в ряду ПФИПДНБ от некоторых физико-химических свойств молекулы ингибитора было показано, что более высокая (в ∼100 раз) ингибирующая активность в ряду исследованных ПФИПДНБ у соединений, имеющих две нитрогруппы (NO₂) в структуре молекулы по сравнению с соединениями с одной нитрогруппой [10]. Этот факт свидетельствует в пользу того, что в окислительно-восстановительные превращения, ответственные за процесс подавления электронного транспорта в ФС II, вовлечены, вероятно, нитрогруппы бензола. Была выявлена положительная зависимость между повышением ингибирующей эффективности и увеличением степени гидрофобности молекулы исследованных ПФИПДНБ, а, следовательно, степени доступности молекулы ингибитора к участку ее связывания, находящемуся, судя по функциональным данным, на уровне промежуточного акцептора электрона ФС II феофитина, расположенного в гидрофобной области РЦ [10]. Для исследованных производных ПФИПДНБ был проведен поиск количественных соотношений структура-свойство – QSAR-анализ (Quantitative Structure-Activity Relationship). Были получены данные количественной зависимости эффективности ингибирования от структуры ингибитора, которые показали, что эффективность ингибирующего действия соединений типа К15, в основном, зависит от наличия второй нитрогруппы в составе молекулы и степени липофильности боковых заместителей [89]. Зависимость ингибирующей активности от степени гидрофобности для известных гербицидов (в том числе и фенольного класса) отмечалась и ранее [8]. С другой стороны, заместители боковой цепи ингибитора, вероятно, влияют на степень пространственного соответствия между структурой молекулы ингибитора и конфигурацией связывающей ниши [10].

В водных растворах в присутствии детергента при рН 8.0 большая часть исследованных ПФИПДНБ принимает первый электрон при потенциалах от –0.28 до –0.41 В (нормальный водородный электрод). Восстановление не обратимо, зависимость потенциала восстановления от рН составляет 60 мВ/рН, что свидетельствует о протонировании восстановленных форм [11]. Наибольший интерес представляет поведение ингибиторов в неводных растворах, в апротонной среде, поскольку вследствие своей липофильности они способны встраиваться в гидрофобные области фотосинтетических мембран. Показано, что в безводном диметилформамиде большинство исследованных ПФИПДНБ способно к одноэлектронному обратимому восстановлению при потенциалах от –0.3 до –0.53 В [11]. Эти результаты позволяют обосновать предложенный выше механизм ингибирующего действия ПФИПДНБ, заключающийся в их окислительно-восстановительном взаимодействии с парой [${\text{P}}_{{680}}^{ + }$Pheo^–]. Значения редокс-потенциалов ингибиторов подтверждают их способность к перехвату электрона в реакционных центрах ФС II на уровне Pheo^–, а обратимость восстановления указывает на возможность быстрого возврата электрона от восстановленного ингибитора на подходящий акцептор, которым могут быть ${\text{P}}_{{680}}^{ + }$ или ${\text{Y}}_{{\text{Z}}}^{ + }$. Показана зависимость ингибирующего действия от редокс-потенциала исследованных соединений [11].

В пользу достоверности предполагаемого механизма действия производных ПФИПДНБ свидетельствует также данные полученные в работе Аллахвердиева с соавт. [13]. Было показано, что циклический транспорт электронов вокруг ФС II, образующийся при участии агента К15, эффективно защищает ФС II от фотоингибирующего повреждения как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Тушение максимального уровня флуоресценции и уменьшение изменений оптической плотности при 685 нм, связанные с фотовосстановлением феофитина, наблюдаемым при фотоингибирующем освещении необработанных или лишенных эндогенного Mn субмембранных фракций ФС II; фотодеградация цитохрома b₅₅₉ и фотообесцвечивание β-каротина и хлорофилла-670 измеренные в препаратах, лишенных эндогенного MnФС II, значительно ослабляются в присутствии K15 [13].

Для идентификации ПФИПДНБ использовали их способность испускать характерную флуоресценцию при 440–450 нм при возбуждении на длине волны 270 нм. Показано, что ПФИПДНБ прочно связываются с ФС II: только промыванием в присутствии детергента удается удалить К15 из препаратов ФС II. Это свидетельствует в пользу высокой аффинности связывания ПФИПДНБ в ФС II, которое имеет, вероятно, нековалентную природу [15].

Методом фотоаффинного мечения с использованием азидсодержащего аналога ПФИПДНБ (К15-N₃) показано, что в препаратах ФС II до и после удаления суммы водорастворимых белков ПФИПДНБ интенсивно метят одну белковую полоса в области 30–34 кДа (исходя из условий проведения ПААГ электрофореза, вероятно, D2‑белок) и, в меньшей степени, полосу в области 65–55 кДа (гетеродимер D1- и D2-белков) [15].

В препаратах РЦ ФС II в присутствии 6 М мочевины удается отчетливо разделить полосы D1- и D2-белков. В этих препаратах фотоаффинно связанные ПФИПДНБ метят только полосы 30 кДа и 55 кДа. Учитывая данные об аномальном изменении электрофоретической подвижности гербицид-хинон-связывающего белка D1 в зависимости от концентрации мочевины в среде [90, 91], сделан вывод о том, что местом связывания исследованных ПФИПДНФ, вероятно, может быть D2-белок [15]. В пользу достоверности этого предположения свидетельствуют также данные о преимущественной защите белка D2 от фотодеструкции в изолированных комплексах D1/D2/цитохром b₅₅₉ с помощью К15 [14].

В результате исследований способности диурона “снимать” ингибирующее действие ПФИПДНБ путем регистрации тушение уровня F_M хлорофилла ФС II (связанного с восстановлением Q_A) в анаэробных условиях, в присутствии ПФИПДНБ (K15) было показано отсутствие конкуренции между ПФИПДНБ и диуроном за участок связывания с РЦ ФС II [16]. Этот факт подтверждает предположение о том, что местом связывания ПФИПДНБ служит, вероятно, белок D2, несущий на себе, как известно, акцептор Q_A. Полученные результаты отклоняются от принятой схемы связывания гербицидов с ФС II, но в то же время согласуются с результатами функциональных измерений, обосновывающими предполагаемый механизм ингибирующего действия ПФИПДНБ на ФС II [6, 9–16].

МЕТАЛЛСОДЕРЖАЩИЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ

Исследовано действия новых химических соединений производных сульфамида и их комплексов с ионами меди (Cu), никеля (Ni), хрома (Cr), кобальта (Co) и цинка (Zn) (30 соединений) на обратимую реакцию гидратации двуокиси углерода и скорость фотосинтетического транспорта электрона осуществляемых ФС II [17]. Из них одиннадцать агентов являются органическими основаниями, двадцать четыре – их органическими производными, а четырнадцать – их комплексами с некоторыми атомами металлов. Эти соединения исследованы на предмет выявления их действия на фотосинтетическую активность (ФСА) ФС II, а также на карбоангидразную активность (КАА) ФС II и альфа карбоангидразы (КА) из эритроцитов быка. Среди этих агентов было выявлено несколько групп ингибиторов [17]. Некоторые из них оказались способны подавлять одну, две или все из исследованных активностей. Примером подавления всех исследованных активностей служит, медь(Cu(II))-содержащий комплекс производного фенилсульфонилгидрозона (соединение 25), который подавляет КАА альфа-КА на 88%, КА ФС II на 100% и ФСА на 66.2%. Агенты на основе Шиффова основания (соединения 12 и 15) и медь(Cu(II))-содержащие комплексы на основе фенилсульфонилгидрозона (соединение 25 и 26) значительно ингибируют КАА и ФСА ФС II [17]. Методами циклической вольтамперометрии, квадратно-волновой вольтамперометрии, хроноамперометрии, а также методом объемного электролиза также определен целый ряд электрохимических параметров (коэффициент диффузии, количество переносимых электронов, константа скорости гетерогенной реакции, наклон Котрелла, предельный ток на ультрамикроэлектроде, потенциал пика Epc) для всех 30 производных сульфамида и их комплексов с ионами металла. Кроме того, определены значения констант кислотной диссоциации pKa новых соединений в неводных и водных средах. Выявлена зависимость эффективности подавления указанных реакций ФС II от физико-химических свойств исследованных агентов [17].

Исследованы эффекты девятнадцати металлорганических комплексов, содержащих катионы сурьмы(III) на фотосинтетический перенос электрона и карбоангидразную активность ФС II, а также глутатионредуктазную активность хлоропластов и глутатион редуктазы из дрожжей (S. сerevisiae) [18]. Шесть из них были разработаны и синтезированы впервые, и их структуры были идентифицированы с использованием элементарного анализа, ¹H-ЯМР, ¹³C-ЯМР, ИК-Фурье, LCMS, магнитной восприимчивости и путем измерения проводимости. Для всех девятнадцати исследованных комплексов, содержащих катионы сурьмы(III), их наиболее устойчивые формы были определены методом DFT/B3LYP/LanL2DZ. Среди исследованных комплексов были выявлены агенты, эффективно подавляющие одну две, три или сразу все четыре из исследованных активностей [18].

Разработан, синтезирован, охарактеризован и исследован в качестве ингибиторов фотосинтетической и карбоангидразной активности ФС II, α‑карбоангидразы из эритроцитов быка, а также активности глутатионредуктазы из хлоропластов и классической глутатионредуктазы из дрожжей (S. сerevisiae) новый класс металлсодержащих органических комплексов на основе ионов меди Cu(II) [19]. Среди новых агентов выявлены Cu(II)-содержащие комплексы и лиганды, эффективно ингибирующие глутатионредуктазу, α-карбоангидразу, карбоангидразную и фотохимическую активность ФС II [19].

ИНГИБИТОРЫ КАРБОАНГИДРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ФС II

Ранее были выявлены четыре источника карбоангидразной активности в субхлоропластных мембранных частицах, обогащенных ФС II– гидрофильные белки кислородвыделяющего комплекса ФС II с молекулярными массами 33 (белок PsbO), 24 (белок PsbP) и 18 кДа (белок PsbQ), а также источник КАА, остающийся связанным с пигмент-белковым комплексом ФС II после удаления трех гидрофильных белков с помощью солевой обработки [92].

Было показано, что истощение ФС II по ${\text{HCO}}_{3}^{ - }$/CO₂, а также подавление карбоангидразной активности ФС II известным ингибитором α‑карбоангидраз, ацетазоламидом (AZM), сопровождается снижением скорости переноса электронов на донорной стороне ФС II. Ингибирование, вызванное AZM, полностью устраняется HCO₃ или известными искусственными донорами электрона (ферроцианидом калия и TMPD). Был сделан вывод о том, что для максимальной фотосинтетической активности ФС II необходима ее карбоангидразная активность. Однако не исключено, что АZM мог иметь два независимых механизма действия на ФС II: специфический и неспецифический [93].

Чтобы исследовать специфическое влияние ингибирования карбоангидразной активности ФС II на ее фотосинтетическую активность, был использован другой известный ингибитор α-карбоангидраз, неисследованный ранее по его эффектам на карбоангидразную и фотосинтетическую активность ФС II, трифторметансульфонамид (TFMSA). Молекулярная структура TFMSA и его физико-химические свойства сильно отличаются от таковых AZM [94]. Впервые было показано, что TFMSA одновременно с подавлением карбоангидразной активности ФС II вызывает также снижение: 1) величины фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла ФСII и 2) скорости фотосинтетического выделения кислорода [94]. Добавление экзогенных доноров электрона ФС II или HCO₃ приводило к исчезновению ингибирующего действия TFMSA на перенос электрона в ФС II, указывая на то, что сайт ингибирования TFMSA расположен на донорной стороне ФС II [94].

ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ ФС II

Имеются публикации, свидетельствующие о значимости ингибиторов ФС II как в качестве инструментов научного познания, так и для реального практического использования. Показано существенное увеличение фотоиндуцированной генерации молекулярного водорода клетками морской зеленой водоросли Platymonas subcordiformis, в присутствии разобщителя фотофосфорилирования, CCCP [95]. Увеличение выхода H₂ за счет добавления CCCP в основном связано с комбинацией нескольких механизмов. CCCP, как ADRY-агент, ингибировал активность КВК ФС II, что приводило к заметному снижению фотовыделения кислорода, и хотя окислительное дыхание митохондрий лишь слегка инактивировалось CCCP, тем не менее эффективно достигался анаэробиоз на стадии фотогенерации H₂, предотвращающий инактивацию кислородом обратимой гидрогеназы в клетках. Разобщающий эффект CCCP ускорял перенос электронов из воды, нарушал ΔpH через тилакоидную мембрану и, таким образом, увеличивал доступность электронов и протонов для гидрогеназы. Электроны для фотогенерации водорода в основном поставлялись в результате фотолиза воды (90%) [95].

Использование ингибиторов, искусственных акцепторов и доноров электронов в качестве экспериментальных инструментов для изучения фотосинтетического аппарата, а также их значение в историческом развитии представлений о свойствах, функциях и последовательности переносчиков электрона в электрон-транспортной цепи фотосинтеза подробно рассмотрено в обзоре Требста [96].

Представлен подробный обзор достижений и открытий в исследованиях биохимических путей и физиологических процессов растений, сделанных благодаря использованию разных ингибиторов фотосинтеза [97]. Высокое сродство ингибиторов к соответствующим сайтам-мишеням делает их полезными экспериментальными инструментами. В качестве лишь одного из примеров их значимости указывается работа, связанная с открытием сайта связывания ингибиторов, подавляющих ФС II, награжденная Нобелевской премией в 1988 году.

Показано, что ингибиторы могут быть использованы в промышленных масштабах для увеличения выработки определенных каротиноидов клетками зеленой водоросли Dunaliella bardawil, способными накапливать большое количество каротина в стрессовых условиях (диурон увеличивал биосинтез лютеина в 2 раза) [98].

Показано, что существует возможность увеличения эффективности производства молекулярного водорода от 3-х до 5-ти раз клетками одноклеточной галотолерантной цианобактерии Aphanothece halophytica, которая является потенциальным темновым ферментативным продуцентом, если обрабатывать клетки CCCP и DCMU, комбинируя условия освещения или время инкубации в темноте [99]. Одним из основных факторов, ограничивающих фотогенерацию водорода, выступает кислород, ингибитор активности двунаправленной гидрогеназы в клетках A. halophytica. Кислород интенсивно выделяется как побочной продукт фотосинтетической активности ФС II на свету в результате расщепления молекул воды, но может поглощаться в результате дыхания. С помощью CCCP и DCM-U подавляли фотосинтетическое выделение кислорода, и таким образом достигали низких уровней кислорода. Кроме того, CCCP усиливал частоту дыхания, еще больше снижая уровень кислорода [99].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основная информация по химическим ингибиторам ФС II была получена в 70–80 гг. прошлого столетия. В эти годы существовала серьезная экономическая заинтересованность в разработке и исследованиях химических средств борьбы с сорняками (гербицидов). В эти годы было опубликована большая часть информации о механизмах действия гербицидов, их участках связывания и основных эффектах на характерные реакции фотосистем и состояния интермедиатов электрон-транспортной цепи фотосинтеза. Поэтому в обзоре так много ссылок на публикации тех лет. В последующем, в связи с развитием и расширением других технологий, в том числе использующих генетически модифицированные сорта экономически значимых растений, а также с существенным повышением внимания к проблемам экологии и загрязнения сельхозугодий химическим поллютантами, исследования, направленные на выявление, разработку новых химических гербицидов стали менее актуальными и, соответственно, это отразилось на количестве научных публикаций. Однако, поскольку основные эффекты были уже достаточно широко известны больше стало публикаций об использовании этих химических агентов в качестве инструментов научных исследований, а также в качестве средств управления определенными этапами фотосинтетического процесса для производства необходимых соединений, продуктов фотосинтеза. Примером такого управления может быть применение диурона и CCCP для увеличения генераций молекулярного водорода клетками одноклеточной галотолерантной цианобактерии Aphanothece halophytica [99]. В тоже время в современных исследованиях продолжает появляться новая информация об эффектах, механизмах и участках действия даже известных химических ингибиторов ФС II. Выявлен новый участок преимущественного связывания диурона, диносеба, ТФБ и ADRY-агентов с новым хинон-связывающим сайтом Q_C и показано, что результатом такого связывания является сдвиг среднеточечного потенциала E_m высокопотенциальной формы цитохрома b₅₅₉ в сторону отрицательных величин в результате окисления гемовой группы цитохрома этими агентами [61]. В обзоре невозможно рассмотреть все публикации вследствие обоснованных ограничений в объеме текста и использованных ссылок. Поэтому авторы приносят искренние извинения читателю за то, что, возможно, некоторые, эффекты химических ингибиторов ФС II или публикации по указанной теме оказались не представлены в обзоре.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 19-14-50341.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.