Физиология растений, 2021, T. 68, № 2, стр. 170-176

ВВЕДЕНИЕ

Увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур, эффективное и ограниченное использование удобрений и средств защиты растений, а также повышение устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным агроклиматическим условиям и антропогенным воздействиям являются актуальными вопросами современного сельского хозяйства. Одно из важных направлений – поиск продуцентов биопрепаратов нового поколения с ярко выраженными комплексными свойствами (ростстимулирующими, стресспротекторными). Подобные исследования будут способствовать разрешению проблем не только получения экологически безопасных агропродуктов, но и повышению экологической устойчивости агроэкосистем.

Перспективным в этом плане является углубленное изучение свойств бактерий Azospirillum. В ризосфере злаковых эти бактерии формируют высокоэффективные ассоциации, оказывающие стимулирующий эффект на рост и развитие растений, включая пшеницу. Однако детали этого взаимодействия пока остаются не до конца известными. В природе они могут колонизировать как поверхность, так и внутренние ткани корней растений, и образование подобных симбиозов приводит к повышению продуктивности злаковых [1–3].

Известно, что положительное воздействие бактерий рода Azospirillum на рост, развитие и урожайность растений носит многофакторный характер. В этой связи значимыми признаками считаются не только высокая азотфиксирующая активность, способность к продукции фитогормонов, фунгицидная и бактерицидная активность, но также синтез высокомолекулярных биологически активных веществ [3, 4]. К таким веществам относятся лектины – (глико)протеины, связывающие строго определенные углеводные группы на поверхности клетки-мишени. С поверхности двух отличающихся по способу колонизации растений штаммов ассоциативных азотфиксирующих бактерий – A. brasilense Sp7 (эпифит) и A. brasilense Sp245 (эндофит) – были изолированы лектины, являющиеся гликопротеинами с различными молекулярными массами и углеводной специфичностью [5, 6].

Накопившийся обширный массив экспериментальных данных по лектинам азоспирилл позволяет говорить о полифункциональности этих белков. Лектины способны не только обратимо и специфически связываться с клетками-мишенями, но и быть биологически активными веществами, способными вызывать клеточные ответы в низких концентрациях. Этот факт нашел подтверждение в наших предыдущих исследованиях [7–13]. Были получены данные, подтверждающие способность лектинов изменять содержание стрессовых метаболитов в растительной клетке [14, 15]. Последнее свидетельствует о способности лектинов выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы.

Цель работы – сравнительное исследование влияния лектинов эпифитного штамма A. brasilense Sp7 и эндофитного штамма A. brasilense Sp245 на всхожесть и изменение ростовых процессов путем регистрации морфометрических характеристик корней проростков растения-хозяина при смоделированных абиотических стрессах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микроорганизмы и условия культивирования. Объектом исследования служили два штамма азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum – A. brasilense Sp7 (ATCC 29145) и A. brasilense Sp245 (IBPPM 219) – из коллекции микроорганизмов И Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (http:// collection.ibppm.ru).

Получение препаратов лектинов. Выделение лектинов с поверхности клеток бактерий проводили методом Эшдата [16]. Очистку изучаемых белков осуществляли гель-фильтрацией на колонке (30 × 2.2 см) с сефадексом G-75 (диаметр частиц 40–120 мкм). Выход белковых фракций фиксировали на приборе Uvicord S11 (LKB) при λ = 278 нм. В качестве элюентов использовали 0.1 М СН₃СОО-Н (рН 4.8), а также 0.05 М фосфатный буфер (рН 7.0), содержащий 0.15 М NaCl. Скорость потока – 1.5 мл/мин. Лектиновую активность определяли реакцией агглютинации, используя 2% суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов. Лектин A. brasilense Sp7 имел молекулярную массу 36 кДа и проявлял специфичность к L-фукозе (1.87 mM) и D-галактозе (20 mM). Лектин A. brasilense Sp245 проявлял сродство к собственному полисахариду – кислому D-рамнану и имел молекулярную массу 67 кДа.

Определение концентрации белка. Количество белка определяли по методу Бредфорд [17].

Стерилизация семян, получение корней проростков. Семена пшеницы Triticum aestivum L. сорта Саратовская 29 (ГНУ НИИ Сельского хозяйства Юго-Востока РСХА, Саратов, Россия) были поверхностно стерилизованы в 70% (v/v) этаноле 1 мин, отмыты многократно стерильной водой.

Для лабораторного моделирования условий загрязнения тяжелыми металлами, гипо-, гипертермии, засоления и засухи семена пшеницы проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге с добавлением лектинов (концентрация 5–40 мкг/мл; использованные концентрации были подобраны в предварительных экспериментах) и солей тяжелых металлов – CoSO₄, ZnSO₄, Pb(CH₃COO)₂, CuSO₄ (концентрация 1 мМ), 1% NaCl и 5% сахарозы (наиболее используемый метод оценки устойчивости растений к дефициту влаги). Для анализа действия гипо- и гипертермии на показатели развития зерна пшеницы выращивали в среде с добавлением лектинов при температуре 5 и 42°С, соответственно. В качестве контроля выступали корни проростков, выращенные на дистиллированной воде при 25°С. Объем выборки составлял 20 семян в 3-кратной повторности для каждого варианта.

В экспериментах использовали 4-суточные проростки. Определяли всхожесть зерновок. Для измерения ростовых показателей корней проростков использовали морфометрические показатели: число и длину корней, их сырую массу.

Статистическая обработка результатов. Все измерения выполняли в трех биологических и трех аналитических повторностях. Анализ проводился с использованием пакета программ AGROS для статистического и биометрическо-генетического анализа при селекции и селекции растений (версия 2.09; Отдел статистического анализа Российской академии сельскохозяйственных наук). На рисунках приведены средние арифметические значения и их стандартные отклонения. Значимость отличий между средними значениями определяли, используя t-критерий Стьюдента при уровне P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В литературе представлено достаточно сведений о негативном воздействии различных стрессов на физиологические процессы растительного организма, особенно на этапе прорастания [18, 19]. В лабораторных условиях в первую очередь оценивают всхожесть семян и рост корней проростков.

Для исследований были взяты концентрации лектинов от 5 до 40 мкг/мл. Выбор диапазона концентраций в данном случае играет важную роль и был основан на ранее проведенных исследованиях и полученных результатах [7–15]. На рис. 1 представлены результаты изучения лабораторной всхожести семян пшеницы на четвертые сутки после начала эксперимента. Смоделированные абиотические стрессы – соли тяжелых металлов (СuSO₄, CoSO₄, ZnSO₄, Pb(CH₃COO)₂), термостресс (гипо-, гипертермия), засоление и засуха приводили к снижению всхожести семян. При проращивании семян в присутствии лектинов A. brasilense Sp7 и Sp245 происходило нивелирование отрицательного воздействия стрессов. В ходе эксперимента было установлено повышение показателя во всех вариантах опыта по сравнению с контролем. Лектин эндофитного штамма проявлял повышенную способность увеличивать всхожесть семян. Для всех видов стрессовых воздействий в случае лектина A. brasilense Sp7 максимальный показатель был отмечен при концентрации – 10 мкг/мл, для лектина A. brasilense Sp245 при концентрации лектина – 5 мкг/мл (рис. 1а, б). Самый максимальный эффект для обоих штаммов в отношении всхожести наблюдался в случае воздействия Pb(CH₃COO)₂. Для лектина эпифитного штамма он составлял 75% и для эндофитного штамма 80% от контроля (рис. 1б). Несколько ниже были значения в вариантах с солями меди и кобальта, а также при гипертермии и засолении. Достоверных отличий между этими вариантами обнаружено не было (рис. 1б).

Рис. 1.

Влияние лектинов Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 на всхожесть семян при воздействии абиотических стрессов. Результаты представлены как средние арифметические значения со стандартной ошибкой. Разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины (P < 0.05). 1 – контроль, 2–5 − лектин, концентрации которого составляли 5, 10, 20, 40 мкг/мл, соответственно.

Семена, проращиваемые в условиях изучаемых стрессов, формировали зародышевые корни меньшей длины по сравнению с контролем. Длина корней проростков в контроле в среднем составляла 4.4 ± 0.2 см. При проращивании семян пшеницы в присутствии лектинов происходил рост показателя для всех вариантов опыта (рис. 2а, б). Для обоих изучаемых лектинов наблюдалась идентичная картина – наибольшее повышение происходило в случае смоделированной засухи. Также как и в предыдущем случае, лектин эндофитного штамма был эффективнее. Максимальное значение показателя было зафиксировано при концентрации лектина 10 мкг/мл (6.2 ± 0.2 см), в тоже время для лектина A. brasilense Sp7 максимальный эффект был отмечен при концентрации 20 мкг/мл (5.7 ± 0.1 см) (рис. 2а). Несколько меньшим, но также достаточно высоким был рост показателя в случае гипертермического воздействия. Максимальные значения были зафиксированы при тех же концентрациях лектинов и составляли 5.2 ± 0.1 см для лектина A. brasilense Sp7 и 5.7 ± 0.3 см для Sp245 (рис. 2а).

Рис. 2.

Влияние лектинов Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 на длину и массу корней при воздействии абиотических стрессов. Результаты представлены как средние арифметические значения со стандартной ошибкой. Разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины (P < 0.05). 1 – контроль, 2–5 − лектин, концентрации которого составляли 5, 10, 20, 40 мкг/мл, соответственно.

Сырая масса зародышевых корней при проращивании зерновок в условиях стрессов варьировала в пределах от 1.1 ± 0.3 до 1.3 ± 0.2 г. В контроле этот показатель был 1.6 ± 0.2 г. Как показали результаты опытов, при воздействии лектинов обоих штаммов по этому признаку изменений практически не наблюдалось. Все исследуемые варианты оказались довольно однородными по изучаемому показателю и не проявляли достоверных отличий между собой и с контролем (рис. 2а, б).

Проращивание зерновок в присутствии лектинов приводило к увеличению количества зародышевых корней (рис. 3а, б). При этом максимальное воздействие на признак установлено в вариантах засухи и гипертермии. Для лектина эпифитного штамма эффект был отмечен при концентрации – 10 мкг/мл, в случае другого лектина – при 5 мкг/мл. При проращивании образцов на 5% растворе сахарозы в присутствии изучаемых лектинов количество корней увеличилось с 3.7 ± 0.2 до 4.5 ± 0.2 шт. в случае лектина А. brasilense Sp7 и до 5.1 ± 0.3 шт. в случае лектина Sp245 (рис. 3а). При гипертермии присутствие изучаемых лектинов увеличило количество корней с 2.7 ± 0.2 до 3.6 ± 0.2 шт. в случае лектина А. brasilense Sp7 и до 4.0 ± 0.1 шт. в случае лектина Sp245 (рис. 3а).

Рис. 3.

Влияние лектинов Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 на количество зародышевых корней при воздействии абиотических стрессов. Результаты представлены как средние арифметические значения со стандартной ошибкой. Разными буквами обозначены достоверно отличающиеся величины (P < 0.05). 1 – контроль, 2–5 − лектин, концентрации которого составляли 5, 10, 20, 40 мкг/мл, соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Неблагоприятные климатические условия, создающие абиотические стрессы, являются основными ограничивающими факторами снижения продуктивности сельскохозяйственных культур. Доминирующие абиотические стрессы – это засуха, низкая/высокая температура, засоление, воздействие тяжелых металлов. Стрессы являются причиной замедления темпов роста и снижения общей урожайности разнообразных культур, оказывая влияние на целый спектр физиолого-биохимических и метаболических процессов.

Многочисленные результаты исследований последних десятилетий показали, что ответ растения независимо от природы воздействия происходит по некоторой общей схеме, что позволяет говорить о существовании неспецифической стрессовой реакции на различные воздействия [20–22]. Ввиду этого одним из прикладных направлений современной физиологии растений является создание препаратов на основе биологически активных молекул с антистрессовым эффектом. Учитывая мировую тенденцию к экологизации сельского хозяйства, предпочтение отдается веществам, продуцируемым высшими растениями, грибами и микроорганизмами.

Известно, что инокуляция растений пшеницы ассоциативными бактериями Azospirillum brasilense при стрессах, вызванных различными абиотическими воздействиями, улучшает морфогенез растений и приводит к увеличению корневой и надземной биомассы растений (на 40–60% в зависимости от штамма) [23, 24]. Азоспириллы отличаются по способу колонизации корней растений. Например, эндофитный штамм A. brasilense Sp245 был найден в ксилеме корня, в тоже время эпифитный штамм A. brasilense Sp7 был обнаружен на поверхности корня [25]. Эндофитные бактерии представляют особый интерес, поскольку считается, что способность существовать внутри растительных тканей позволяет им в меньшей степени зависеть от внешних воздействий и формировать более длительную защиту макроорганизма от стрессовых факторов окружающей среды.

Азоспириллы способны синтезировать лектины – гликопротеины, связывающие строго определенные углеводные группы на поверхности растительной клетки. С поверхности клеток бактерий A. brasilense Sp7 и Sp245 были выделены эти белки. Они имели различные молекулярные массы и углеводную специфичность.

Рост растений, особенно начальные этапы онтогенеза, является одним из важных показателей адаптации растений к условиям обитания. В результате проведенных исследований было показано, что лектины с различной эффективностью нивелировали отрицательное воздействие тяжелых металлов, гипо-, гипертермического стресса, засоления и смоделированной засухи на корни проростков пшеницы. При этом участие лектинов в адаптации растений к стрессу, вызванному тяжелыми металлами, и засухе оказалось более существенным.

Стимулирующий эффект обнаруживался уже на самых ранних стадиях развития растений, начиная с прорастания семян, так как лектины существенно влияли на их всхожесть. Анализ морфометрических показателей позволил сделать вывод о том, что лектины способны стимулировать ростовые показатели корней растений, которые, как известно, претерпевают значительные изменения в условиях стресса. Лектины оказывали положительное влияние в основном на количество и размеры корней, при этом не затрагивая их массу.

Полученные данные о влиянии лектинов азоспирилл на ростовые процессы растений, возможно, объясняются активацией этими белками биохимических процессов в прорастающем семени. Лектины азоспирилл способны воздействовать на активность различных ферментов корней проростков растений – пектинолитических, протеолитических [10–12], антиоксидантных [15], изменять содержание ряда стрессовых метаболитов – перекиси водорода [14], цАМФ [13], оксида азота, диацилглицерина, салициловой кислоты [14], низкомолекулярных антиоксидантов [26 ] . Было показано, что лектины обладали различной степенью функциональной активности, что согласуется с описанными в настоящей работе данными. Всегда эффект для лектина A. brasilense Sp245 проявлялся в большей степени и при более низких концентрациях, чем для лектина Sp7. Это может быть связано с различиями в углеводной специфичности и структуре белков, в результате чего изменяется взаимодействие с поверхностью растительной клетки, что является определяющим фактором для проявления функций лектинов. [5, 6].

Вероятным объяснением продемонстрированных концентрационных различий, при которых лектины проявляли эффекты, может быть влияние изучаемых неблагоприятных факторов на процесс связывания лектинов с рецепторами на корнях. Изучение концентрационных зависимостей достаточно актуально для понимания процессов, происходящих при адаптации растений к условиям окружающей среды, а также при практическом использовании регуляторов роста, к которым можно отнести лектины.

Результаты настоящей работы продемонстрировали участие лектинов азоспирилл в повышении способности растений переносить воздействие абиотических факторов, развивая эколого-биологические реакции, направленные на усиление жизнестойкости растения в данных условиях. Полученные результаты являются дополнением к полученным ранее данным о том, что лектины азоспирилл могут участвовать в адаптации и вызывать индукцию защитных механизмов растений. Таким образом, стресс-толерантный эффект лектинов в растениях носит мультинаправленный (полифункциональный) характер. Это является одной из причин считать эти белки способными повышать выживаемость растений в условиях действия стрессоров различной физической природы и тем самым выполнять роль одного из компонентов общих клеточных защитных систем. Все это позволяет рассматривать лектины как перспективное для практического применения соединения для защиты растений от стресса и повышения их продуктивности.

Информация о вкладе авторов: Аленькина С.А. – разработка эксперимента, обработка экспериментальных данных, обсуждение результатов и подготовка статьи; Никитина В.А. – разработка эксперимента, обсуждение результатов и подготовка статьи.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.