Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2023, T. 59, № 7, стр. 559-658

7.1. Гетеротримерные G-белки

Гетеротримерные G-белки и β-аррестины специфически взаимодействуют с различными по локализации участками ICLs и цитоплазматического C-концевого домена, в первую очередь с проксимальными к мембране сегментами ICL2 и ICL3, а также с интерфейсами между ICLs и ТМs. Ключевую роль в сопряжении GPCR с G-белками и β-аррестинами играет полость, расположенная в цитоплазматическом преддверии трансмембранного тоннеля и сформированная цитоплазматическим окончанием ТМ6 (в некоторых рецепторах также ТМ5) и гидрофобной спиралью H8. Эта полость доступна для взаимодействия как с α5-спиралью, расположенной в C-концевой области Gα-субъединицы, так и с “пальцеобразным” участком β‑аррестина, который отвечает за образование комплекса c GPCR [186]. После активации рецептора гормоном или аллостерическим агонистом α5-спираль Gα-субъединицы приобретает способность проникать в полость ТМ6/(ТМ5)/H8, что приводит к ГДФ/ГТФ-обмену в ее гуаниннуклеотидсвязывающем сайте, диссоциации αβγ-гетеротримерного комплекса и запуску соответствующего внутриклеточного каскада. В то же время сразу вслед за этим GPCR фосфорилируется киназами GRK-семейства, что вызывает рекрутирование β-аррестинов, которые конкурентно вытесняют Gα-субъединицу из полости ТМ6/(ТМ5)/H8, тем самым прерывая передачу сигнала через G-белки. В дальнейшем либо осуществляется β-аррестин-опосредуемый эндоцитоз лиганд-рецепторного комплекса внутрь клетки, либо запускается механизм β-аррестинового сигналинга [186].

Неактивный G-белок, который представляет собой Gαβγ-комплекс и включает Gα-субъединицу, связанную с ГДФ, при взаимодействии с GPCR индуцирует его “закрытую” конформацию. Ее особенностью является то, что, находясь в этой конформации, GPCR имеет повышенное сродство к ортостерическому агонисту, что обеспечивает более высокую чувствительность рецептора к гормональной активации. Это обусловлено тем, что в “закрытой” конформации диссоциация лиганда из ортостерического сайта затруднена, и он как бы попадает в “ловушку”. Как следствие, число лиганд-рецепторных комплексов резко повышается [187]. Образование комплекса между неактивным αβγ-гетеротримерным G-белком и конституитивно активным GPCR, например, вследствие активирующих мутаций, также приводит к стабилизации рецептора в “закрытой” конформации, причем в этом случае ортостерический сайт оказывается свободным от лиганда. Более того, особенностью “закрытой” конформации в конституитивно активных рецепторах является воспрепятствование проникновению в ортостерический сайт лигандов с различным профилем фармакологической активности [187]. В то же время, несмотря на различные эффекты “закрытых” конформаций GPCR на связывание ортостерических лигандов, они представляют собой результат аллостерического влияния неактивного G-белка на связывающие характеристики рецептора. После активации G-белка и его диссоциации на мономерную, ГТФ-связанную, Gα-субъединицу и Gβγ-димер, с одной стороны, осуществляется активация различных эффекторных белков, таких как АЦ, PLCβ, фосфатидилинозитол-3-киназа, G-белок-регулируемые кальциевые и калиевые каналы, и, с другой, дестабилизируется “закрытая” конформация и снижается сродство лиганда к ортостерическому сайту.

Аллостерические механизмы, лежащие в основе влияния тройного комплекса ортостерический лиганд–GPCR–G-белок на сродство лиганда к рецептору и на сигнальную трансдукцию в целом, остаются до конца не выясненными. Еще меньше информации о механизмах, которые могут быть вовлечены в предпочтительность включения в такой комплекс в качестве трансдукторного компонента определенного типа G-белка или β-аррестина, а также о возможном аллостерическом влиянии тройного комплекса ортостерический лиганд–GPCR–β-аррестин на связывающие характеристики рецептора. При этом совершенно очевидно, что состав и структурная организация такого комплекса должны во многом определять предвзятый агонизм, обеспечивая избирательную активацию определенного типа трансдукторных белков ортостерическим агонистом [115]. Для обеспечения предвзятости сигнальной трансдукции с помощью аллостерических механизмов предложены две основные модели [57, 188, 189]. В одной из них триггером предвзятого агонизма является смещенный ортостерический агонист, который обеспечивает рекрутирование в тройной комплекс определенного типа G-белка или β-аррестина. Во второй модели сначала образуется предактивационный двойной комплекс между свободным от агониста рецептором и определенным типом G‑белка (в неактивном ГДФ-связанном состоянии) или β-аррестина, после чего они уже предопределяют связывание определенного лиганда, стабилизируя только одну “закрытую” конформацию.

Первая модель, в основе которой лежит “лигандный” механизм, была предложена в 1997 г. американским биохимиком Henry Bourne и опиралась на результаты многочисленных исследований 1980–1990-х годов, свидетельствующих о том, что связывание GPCR c ортостерическим агонистом приводит к рекрутированию G-белков с образованием тройного комплекса, и это является триггером предвзятого внутриклеточного сигналинга [190]. Поначалу эта модель казалась безальтернативной [191–194], но постепенно стали накапливаться данные, которые не укладывались в парадигму “лигандного” механизма. Этому механизму противоречили результаты исследований, указывающие на то, что конституитивно активный рецептор, в отсутствие ортостерического агониста, сохранял способность рекрутировать и активировать G-белки [195, 196], и даже избирательно активировал определенные типы G-белков и β-аррестинов [197, 198]. Тем самым был сделан вывод о том, что ортостерический агонист не способен детерминировать формирование комплекса GPCR с определенным типом трансдукторного белка. К тому же “лигандный” механизм не поддерживался кинетическими данными, которые свидетельствовали о высокой скорости и высокой эффективности образования тройного комплекса, что недостижимо в случае выбора в качестве начальной стадии процесса связывания ортостерического агониста. К тому же не понятно, как в таком случае осуществляется сортинг G-белков или β-аррестинов, учитывая низкую доступность требуемого для предвзятой передачи сигнала определенного их типа в примембранном пространстве.

Ограничения и противоречия, имеющиеся в отношении “лигандного” механизма, в значительной степени преодолеваются в рамках второй модели. В ней на первом этапе образуется двойной предактивационный комплекс, включающий лиганд-свободную форму GPCR и определенный тип трансдукторного белка. Аллостерические влияния, осуществляемые трансдукторным белком на конформацию ортостерического сайта, предопределяют высокоаффинное связывание с ним определенного ортостерического агониста, что и лежит в основе предвзятого сигналинга [189]. Важно, что существование таких предактивационных комплексов показано для различных семейств GPCR и различных типов G-белков [199–204]. При этом в состав таких комплексов входят те типы G-белков, которые преимущественно сопряжены с определенным типом GPCR. Так, например, G_o-белок-сопряженный α₂-AR образует предактивационный комплекс преимущественно с G_o-белками, G_s-белок-сопряженные простациклиновый рецептор и 5-HT₇-серотониновый рецептор – с G_s-белками [199, 203, 205], G_i-белок-сопряженный PAR1 – с G_i1-белками [200], и G_q/11-белок-сопряженный mACh₃R – с G_q/11-белками [201].

Молекулярный механизм, опосредующий изменение связывающих характеристик рецептора в составе комплекса с неактивным G-белком, включает ослабление взаимодействия между ТМ3 и ТМ6, что приводит к большей доступности ортостерического сайта для связывания агониста. В случае конституитивно активного рецептора смещение ТМ6 наружу, обусловленное повышением подвижности этой ТМ, оказывается достаточным для активации G-белка, в то время как в рецепторах с базальной активностью для эффективного смещения необходим ортостерический агонист. В то же время образование комплекса GPCR–неактивный G-белок существенно снижает энергетический порог для такого смещения, снимая, тем самым, термодинамические препятствия для агонист-индуцированной активации G-белка. Смещение ТМ6 наружу из трансмембранного тоннеля приводит к изменению локализации α5-спирали Gα-субъединицы, что способствует замене в ней ГДФ на ГТФ, диссоциации гетеротримерного комплекса и запуску сигнальной трансдукции [189].

Для доказательства аллостерических влияний, вызываемых G-белками, успешно применяются антитела или их фрагменты (нанотела), имитирующие неактивные ГДФ-связанные G-белки. Они также обладают способностью стабилизировать “закрытую” конформацию ортостерического сайта GPCR [206–208]. В 2011 г. Rasmussen и соавт. выработали антитела Nb80 (14 кДа) на агонист-активированный β₂-AR, и эти антитела обладали свойствами G-белка при связывании с этим рецептором [206]. Антитела Nb80 не опознавали свободную от ортостерического лиганда, неактивную конформацию рецептора, но при этом с высокой эффективностью связывались с агонист-активированной формой рецептора и вызывали в ней конформационные изменения, сходные с таковыми при связывании β₂-AR с G_s-белком и β₂-агонистом изопротеренолом. В дальнейшем были разработаны антитела Nb60, которые действовали противоположным образом, стабилизируя неактивную конформацию GPCR, характеризующуюся низким сродством к лиганду [208]. Изопротеренол при связывании с β₂‑AR в присутствии антител Nb80 имел сродство к рецептору в 15 тысяч раз выше, чем в присутствии антител Nb60. При этом различия в аффинности связывания других лигандов с β₂-AR в присутствии антител Nb80 и Nb60 сильно варьировали, что указывает на отчетливо выраженный их аллостерический эффект на связывающие характеристики ортостерического сайта [208]. В совокупности эти данные свидетельствуют в пользу аллостерической природы регуляторного влияния G-белка на сродство GPCR к ортостерическим лигандам. С помощью антител и других подходов было показано, что аллостерические сайты рецептора, являющиеся мишенями для G-белка, расположены на границе между цитоплазматическими окончаниями ТМs и проксимальными к мембране участками ICL2 и ICL3, в цитоплазматическом преддверии трансмембранного тоннеля [207]. Однако в отдельных случаях в формировании таких сайтов могут принимать участие и более дистальные участки ICLs и цитоплазматического С-хвостового домена. Необходимо принимать во внимание тот факт, что если Gα-субъединица в основном взаимодействует с преддверием трансмембранного канала, то Gβγ-димер использует для связывания другие молекулярные детерминанты, расположенные в том числе в дистальных участках ICLs.

7.2. β-Аррестины

Компонентами предактивационного комплекса, включающего GPCR, наряду с G-белками, могут быть β-аррестины, которые также облегчают связывание ортостерических агонистов, в том числе предвзятых по отношению к β-аррестин-специфичным каскадам [57, 209]. Существование тройного комплекса ортостерический агонист–GPCR–β-аррестин было предсказано еще в 1997 г. Gurevich и соавт. на основе изучения комплексов β-аррестинов с β₂-AR и mACh₂R [210]. Было показано, что в комплексе с β-аррестинами эти рецепторы имеют существенно более высокое сродство к агонистам, но не к антагонистам ортостерического сайта, причем мутации в β-аррестинах, препятствующие эффективному связыванию с рецептором, полностью предотвращали повышение аффинности GPCR к агонисту [210, 211]. В дальнейшем было показано, что повышение сродства рецептора к ортостерическим агонистам было наиболее отчетливо выражено в случае агонистов, предвзятых в отношении активации β-аррестин-специфичных сигнальных путей, что, как можно полагать, лежит в основе предпочтительного связывания комплекса GPCR–β-аррестин с β-аррестин-предвзятым агонистом и соответствует рассмотренной выше второй модели, основанной на образовании двойного предактивационного комплекса, только теперь в приложении к β-аррестинам [59].

С помощью криоэлектронной микроскопии была установлена структура комплекса, включающего β₁-AR, βarr1 и β-аррестин-предвзятый агонист формотерол (formoterol), и показано, что конформационные изменения, которые индуцирует βarr1 в структуре трансмембранного домена β₁-AR, существенно отличаются от таковых в случае комплекса β₁-AR с G_s-белком и затрагивают в основном ТМ7. Это обусловлено тем, что, в сравнении с α5-спиралью Gα-субъединицы, пальцевая петля (finger loop) βarr1 занимает более узкую щель во внутриклеточном вестибюле трансмембранного тоннеля [209]. В этой связи необходимо отметить, что β-аррестины способны опосредовать сигнальную трансдукцию независимо от G-белков, осуществляя регуляции каскада MAPKs [212, 213]. Тем самым модель предактивационного комплекса GPCR–β-аррестин является функционально значимой и может указывать на универсальность механизма образования предактивационного комплекса между рецептором и трансдукторным белком.

Еще одна, сравнительно недавно развиваемая модель, авторами которой являются выдающиеся специалисты в области сигнальной трансдукции Anthony Nguyen и лауреат Нобелевской премии 2012 г. Robert Lefkowitz, описывает в качестве ключевого этапа предвзятого GPCR-опосредуемого сигналинга формирование комплексов с “мегаплексной” (megaplex) структурой, включающих лиганд-связанный GPCR и оба трансдуктора – G‑белок и β-аррестин [214]. Предпосылкой для этой модели стали наблюдения, что после интернализации комплекса лиганд–GPCR, индуцируемой β-аррестинами, в ряде случаев рецепторы сохраняют способность устойчиво передавать сигналы через посредство G-белков. При этом рассматриваются различные механизмы для реализации такого необычного эффекта. В их основе лежит представление о том, что β-аррестины не только обеспечивают везикулярный транспорт рецепторного комплекса, но, обеспечивая его удерживание в подходящей конформации внутри сигнальной эндосомы, способствуют длительной активации G‑белков. Имеются данные о том, что β-аррестины могут поддерживать и даже усиливать G-белок-опосредуемый сигналинг, препятствуя реассоциации Gα-субъединицы и Gβγ-димера путем образования комплекса, включающего GPCR, Gβγ-димер и β-аррестин [215]. Способность β-аррестинов в составе комплекса с GPCR функционально взаимодействовать с Gβγ-димером была продемонстрирована на примере химерного рецептора β₂V₂R, в котором С-концевой домен β₂-AR заменен на таковой V₂-вазопрессинового рецептора [216]. Важно отметить, что взаимодействие Gβγ-димера с комплексом β₂V₂R–βarr1 было отчетливо выражено только в том случае, когда гетеротримерный комплекс G_s-белка подвергался диссоциации на Gα_s-субъединицу и Gβγ-димер в присутствии негидролизуемого аналога ГТФ.

В настоящее время аллостерические влияния, которые могут реализовываться при формировании “мегаплексной” структуры лиганд–GPCR–Gβγ-димер–β-аррестин, остаются не изученными, но их роль, особенно на стадии “позднего”, эндосомального, сигналинга может быть определяющей. Известно, что одним из механизмов прекращения передачи сигнала через интернализованный GPCR является снижение pH в просвете эндосом, что приводит к снижению сродства лиганда к рецептору, как это показано для рецептора паратиреоидного гормона [217]. Вследствие этого для поддержания эндосомального сигналинга необходимы механизмы для сохранения высокого сродства GPCR к лиганду в условиях закисления просвета эндосом, что, возможно, и обеспечивает “мегаплексная” структура. При этом в основе таких стабилизирующих влияний может быть повышение устойчивости “закрытой” конформации ортостерического сайта, что затрудняет диссоциацию связанного с ним лиганда в условиях закисления. Следует отметить и тот факт, что конформационные изменения в GPCR, индуцируемые образованием “мегаплексной” структуры лиганд–GPCR–Gβγ-димер–β-аррестин, влияют на предвзятость внутриклеточного сигналинга и на интенсивность продукции, распределения и транспорта вторичных посредников внутри эндосомы [214].

Поскольку β-аррестины могут выступать в качестве аллостерических регуляторов GPCR, то стратегии, направленные на регуляцию их активности, способны влиять на аллостерические взаимодействия между GPCR и β-аррестинами, а следовательно, контролировать GPCR-опосредуемый сигналинг. В качестве примера можно привести недавнее исследование по разработке высокоспецифичных внутриклеточных антител к βarr1, которые аллостерически модулировали эндосомальный сигналинг мутантного V₂-вазопрессинового рецептора [218]. Замена в этом рецепторе остатка Thr³⁶⁰, мишени для фосфорилирования GRK-киназами и компонента одного из двух сайтов для связывания с βarr1, на аланин сохраняла способность βarr1 транслоцироваться в мембрану и образовывать комплекс с агонист-активированным мутантным рецептором, но предотвращала эндосомальную локализацию комплекса рецептора с βarr1 и блокировала βarr1-опосредуемую активацию ERK1/2, нижележащего компонентов каскада MAPKs, наблюдаемую в случае V₂-вазопрессинового рецептора дикого типа [219]. В присутствии антител Ib30, которые специфически связываются с βarr1, находящимся в комплексе с мутантным V₂-вазопрессиновым рецептором, агонист-индуцированный эндосомальный транспорт лиганд-рецепторного комплекса восстанавливался и одновременно с этим нормализовалась активация ERK1/2-сигнальных путей. Возможными механизмами здесь являются стабилизация активной конформации βarr1 в комплексе с рецептором и аллостерически индуцированное усиление взаимодействия βarr1 с белком β2-адаптином, роль которого в эндосомальном GPCR-сигналинге в последние годы интенсивно изучается [220].

В предвзятости сигналинга большую роль играет соотношение молекул GPCR и β-аррестинов, поскольку в случае гиперэкспрессии рецепторов количества экспрессируемых β-аррестинов, необходимого для нормального обеспечения β-аррестин-специфичного сигналинга, начинает не хватать, и тогда даже при связывании GPCR c β-аррестин-предвзятым агонистом парадоксальным образом начинает запускаться G-белок-специфичные сигнальные каскады [221–223]. При этом чем больше дисбаланс между GPCR и β-аррестинами в пользу рецепторов, тем выше вероятность передачи сигнала через G-белок-опосредуемые пути. Показано, что при физиологических, сравнительно низких, уровнях экспрессии ангиотензинового рецептора 1 типа (angiotensin II type 1 receptor, AT1R) при действии β-аррестин-предвзятого лиганда TRV026 активируются преимущественно β-аррестин-специфичные пути. В то же время в условиях гиперэкспрессии AT1R соединение TRV026 приобретает способность активировать G_i- и G_q/11-белки, вызывая, тем самым, мощную стимуляцию кальциевых каскадов, что указывает на потерю этим соединением функциональной селективности [223]. Одной из причин потери селективности β-аррестин-предвзятых лигандов при гиперэкспрессии GPCR является то, что даже при стехиометрическом соотношении GPCR и β-аррестинов небольшая часть рецепторов все же остается в конформации, способствующей их эффективному взаимодействию с G-белками. При повышении количества рецепторов доля их молекул, не связанных с β-аррестинами, возрастает, и это неизбежно приводит к значительному увеличению доли GPCR в G-белок-адаптированной конформации. Сходная ситуация наблюдается и при нокауте генов, кодирующих β-аррестины, или вследствие экспрессии мутантных их форм, неспособных к связыванию с GPCR [222, 223]. Все эти закономерности хорошо укладываются в представленную выше парадигму “мегаплексной” структуры, включающей GPCR, G-белок и β-аррестин.

7.3. GPCR-акцессорные белки

Отдельную группу белков, влияющих на функциональную активность GPCR, составляют GPCR-акцессорные белки (GPCR Accessory Proteins), среди которых наиболее значимы белки RAMP-семейства.

Семейство RAMP включает три представителя, RAMP1, RAMP2 и RAMP3, которые взаимодействуют, по крайней мере, с 46 типами GPCR [224]. Все RAMP один раз пронизывают плазматическую мембрану, имеют значительный по размеру внеклеточный N-концевой домен и небольшой цитоплазматический С-хвостовой домен, причем во взаимодействии с GPCR участвуют внеклеточный домен и, в меньшей степени, ТМ [225, 226]. Образуя комплексы с GPCR, RAMP модулируют селективность рецептора к ортостерическому агонисту, влияют на предвзятость активации внутриклеточных эффекторов, регулируют везикулярный транспорт агонист-активированного GPCR и его рециклизацию. Наряду с этим RAMP могут функционировать как шапероны, обеспечивая нормальное протекание посттрансляционного процессинга GPCR и способствуя надлежащему их встраиванию в плазматическую мембрану, а также опосредованно регулируют генную экспрессию GPCR, как это продемонстрировано на примере рецептора, подобного рецептору кальцитонина (calcitonin receptor-like receptor, CALCRL) и чувствительного к внеклеточному кальцию рецептора CaSR [224, 225, 227, 228].

В настоящее время установлена локализация аллостерических сайтов, которые потенциально способны взаимодействовать с RAMP, одни из которых локализованы в ECLs, в то время как другие на боковой поверхности трансмембранного домена, в месте его контакта с липидной фазой мембраны. Ключевым результатом взаимодействия RAMP с GPCR является изменение конформации TM6 и ICL2, которые участвуют в формировании карманов ортостерического сайта, играют важную роль в стабилизации его “закрытой” конформации, тем самым, определяя сродство рецептора к агонисту. ТМ6, как отмечалось выше, непосредственно вовлечена во взаимодействие рецептора с G-белком и β-аррестинами [224]. В зависимости от того, с каким RAMP рецептор образует комплекс, он способен взаимодействовать с вполне определенным типом ортостерического агониста, как это показано для рецептора CALCRL [224]. В случае образования комплекса CALCRL c RAMP1, рецептор активируется кальцитонин-ген-родственным пептидом (CGRP), при образовании комплекса с RAMP2 он активируется адреномедуллином, в то время как при образовании комплекса с RAMP3 – адреномедуллином и адреномедуллином-2 (интермедином). Более того, кальцитониновый рецептор, находясь в комплексе с определенным типом RAMP, приобретает способность связывать не свойственный для этого рецептора лиганд – гормон амилин [229–231]. RAMP также определяют специфичность и эффективность активации гормонами внутриклеточных сигнальных каскадов. Они усиливают взаимодействие кортиколиберинового рецептора 1-го типа с G-белками [232], а также обеспечивают селективность активации G-белков и β-аррестинов при связывании рецептора 2-го типа вазоактивного интестинального пептида (VPAC₂R) и кальцитонинового рецептора с ортостерическими агонистами [233, 234].

При детальном рассмотрении влияния различных RAMP на активность рецептора глюкагона (GCGR), GLP-1R и GLP-2R были получены свидетельства в пользу рецепторной специфичности RAMP-опосредуемой модуляции зависимых и независимых от G-белков сигнальных путей для глюкагонового семейства GPCR [235]. Показано, что RAMP1 модулирует стимулирующие эффекты агонист-связанных рецепторов GCGR и GLP-1R как на G_s- и G_q/11-белок-зависимые каскады, так и на рекрутирование β-аррестинов к лиганд-рецепторному комплексу, в то время как аллостерические эффекты RAMP2 были специфичны только в отношении β-аррестинов для всех трех изученных рецепторов. В свою очередь, RAMP3 негативно влиял на все сигнальные пути, осуществляемые через GCGR, GLP-1R и GLP-2R [235]. Позднее другими авторами было установлено, что RAMP2 является негативным аллостерическим модулятором для рецептора глюкагона, повышая подвижность его внеклеточного домена и, тем самым, снижая стабильность агонист-активированной конформации и препятствуя активации рецептором G_s-белка и цАМФ-зависимых сигнальных путей [236].

Важность изучения RAMP, как аллостерических регуляторов GPCR, обусловлена их ключевой ролью в функционировании сердечно-сосудистой, выделительной и дыхательной систем, в регуляции воспалительных процессов [237–242]. Интерфейс, который определяет взаимодействие между GPCR и RAMP, является одной из мишеней для создания фармакологических регуляторов GPCR-опосредуемого сигналинга [226, 228, 243, 244]. Одним из таких регуляторов является препарат Olcegepant для лечения мигрени, который встраивается в карман, образуемый RAMP1 и N-концевым участком CALCRL, обеспечивая негативную регуляцию сигнальных путей, активируемых CGRP [245–248].

Наряду с RAMP, в аллостерическую регуляцию отдельных типов GPCR могут быть вовлечены другие GPCR-акцессорные белки, в том числе рецептор-транспортирующие белки (receptor-transporting proteins, RTP), белки, повышающие экспрессию рецепторов (receptor expression-enhancing proteins, REEP), белки, являющиеся компонентами рецепторных комплексов (receptor-component protein, RCP), а также специфичные для меланокортиновых рецепторов дополнительные белки (melanocortin receptor-accessory proteins, MRAP) [249–251].

Рецептор-транспортирующие белки RTP1S и RTP2, представляющие собой интегральные белки, имеющие значительный цитоплазматический N-концевой домен, выполняют функции шаперонов для одорантных рецепторов, играя важную роль в регуляции их экспрессии и комплексообразования, участвуют в интернализации их лиганд-рецепторных комплексов [252, 253]. Белки RTP3 и RTP4 вовлечены в модуляцию внутриклеточного GPCR-транспорта и функциональной активности вкусового рецептора человека TAS2R [254], а RTP4 также опосредует повышение количества μ- и δ‑опиоидных рецепторов на поверхности мембраны и усиление ответа клетки-мишени на агонисты этих рецепторов [255]. Имеются основания считать, что шаперон-подобная функция RTP осуществляется вследствие их взаимодействия с микродоменами липидных рафтов, поскольку нарушение такого взаимодействия предотвращает образование функционально активного комплекса RTP с GPCR [256].

Семейство белков REEP включает два подсемейства, REEP1-REEP4 и REEP5-REEP6, представители которых участвуют не только в регуляции морфогенеза, ремоделировании эндоплазматического ретикулума и в формировании цитоскелета, но посредством образования комплексов с GPCR, контролируют внутриклеточный транспорт рецепторов, их экспрессию, посттрансляционные модификации и функциональную активность [257, 258]. REEP локализованы преимущественно во внутриклеточных компартментах и практически отсутствуют в плазматической мембране. Вследствие этого отмечаемое в их присутствии повышение плотности рецепторов на клеточной поверхности обусловлено способностью REEP облегчать транслокацию GPCR из внутриклеточных депо к плазматической мембране. Тем самым они функционируют как транспортные белки для рецепторов, которые в дальнейшем диссоциируют от рецепторного комплекса [257]. Взаимодействие REEP даже с близкородственными GPCR сильно варьирует, поскольку они способны образовывать комплексы и транспортировать α_2C-AR, контролируя процесс их гликозилирования, но не влияют на внутриклеточный транспорт и посттрансляционный процессинг α_2A-AR. Продемонстрирована предпочтительность взаимодействия REEP с негликозилированными и слабо гликозилированными формами α_2C-AR [257].

Семейство RCP представлено внутриклеточными примембранными белками, сравнительно небольшими по размеру (в среднем около 148 АКО), которые являются компонентами комплекса РНК-полимеразы III и необходимы для функционирования GPCR класса B [259]. Продемонстрировано участие RCP в контроле экспрессии CALCRL и его сродства к лигандам ортостерического сайта, причем этот белок влияет на активность рецептора совместно с белками RAMP-семейства [260]. Основным сайтом для связывания с RCP является ICL2, имеющая критическое значение для передачи сигнала с лиганд-активированного рецептора на G-белки и β-аррестины, как это показано для комплекса CALCRL–RAMP1–RCP [261]. Изменение конформации ICL2 рецептора вследствие его взаимодействия с RCP является молекулярным механизмом, контролирующим взаимное расположение ТМ3 и ТМ6, вовлеченных в формирование ортостерического сайта.

Семейство белков MRAP включает MRAP1 и имеющий с ним 40%-гомологию MRAP2, каждый из которых пронизывает мембрану один раз и имеет по две сплайсинговых формы [262]. MRAP1 был идентифицирован с помощью генетического скрининга у пациентов с наследственной формой дефицита глюкокортикоидных гормонов. Этот белок с высокой интенсивностью экспрессируется в надпочечниках, где усиливает экспрессию меланокортинового рецептора 2 типа (MC₂R) на поверхности клеток и повышает его чувствительность к адренокортикотропному гормону (ACTH) [263]. MRAP2 характеризуется высокой консервативностью у различных представителей позвоночных животных и экспрессируется в мозге, надпочечниках и в ряде других тканей [264]. Достаточно необычен тот факт, что в гликозилированном состоянии MRAP образуют антипараллельные гомодимеры, вследствие чего у этих белков, как с внешней, так и с внутренней стороны мембраны располагаются и N-концевой (от одного протомера), и С-концевой (от другого протомера) участки [265]. В негликозилированном состоянии они образуют параллельные гомодимеры, в которых оба N-концевых участка с близкой вероятностью расположены либо во внеклеточном, либо в цитоплазматическом пространстве.

Длительное время считали, что MRAP функционально взаимодействуют почти исключительно с MC₂R [262], но в последние годы было показано, что MRAP образуют комплексы и с другими типами меланокортиновых рецепторов MC₃R и MC₄R, которые специфично связываются с пептидами меланокортинового семейства – α-, β- и γ-меланоцитстимулирующими гормонами (α-, β- и γ-MSH) [266]. Важно, что воздействие различных форм MRAP, в том числе разных их сплайсинговых вариантов, на связывающие характеристики, транслокацию и встраивание в мембрану меланокортиновых рецепторов сильно варьирует. Так MRAP1 в значительной степени повышает число MC₃R на поверхности клетки, в то время как MRAP2a и MRAP2b его снижают. В присутствии MRAP1 и MRAP2a снижается эффективность ответа MC₃R на α-MSH и ACTH, в то время как в присутствии MRAP2b ослабляется ответ только на α-MSH. В случае MC₄R число рецепторов повышается в присутствии MRAP1 и MRAP2a, а сродство рецептора к α-MSH и ACTH повышается в присутствии всех трех MRAP. При этом MRAP2a повышает реализуемый через MC₄R стимулирующий активность АЦ эффект ACTH, в то время как MRAP2b снижает соответствующий эффект как ACTH, так и α-MSH. Тем самым MRAP, в зависимости от изоформы, а также типа рецептора и ортостерического агониста, реализуют широкий спектр аллостерических влияний на аффинность связывания лиганда с ортостерическим сайтом и на величину гормонального ответа, в первую очередь, на активацию цАМФ-зависимых сигнальных путей [266].

7.4. Простые ионы

Универсальными аллостерическими модуляторами GPCR являются некоторые простые ионы, в первую очередь катионы натрия, цинка, магния, кальция и марганца и анионы хлора. При этом однозарядные ионы натрия снижают связывание рецепторов с агонистами, стабилизируя их неактивное состояние, и при этом потенцируют связывание рецепторов с антагонистами. Двухзарядные ионы кальция и магния, как правило, действуют противоположным образом, стабилизируя активные конформации GPCR и повышая их ответ на стимуляцию ортостерическими агонистами [267–269]. В то же время эффекты ионов цинка на активность рецепторов являются разнонаправленными, и характер их аллостерических влияний в значительной степени зависит от концентрации ионов Zn²⁺, типа рецептора, а также химической природы и связывающих характеристик ортостерического лиганда [270–272].

Ионы натрия

Еще в 1970–1980-е годы было обнаружено, что ионы натрия могут негативно влиять на связывание опиоидных рецепторов с агонистами [273], усиливать их связывание с антагонистами [274], а также влиять на паттерн конформационных состояний этих рецепторов [275]. В то же время молекулярные механизмы этого оставались невыясненными, а эффекты ионов Na⁺ рассматривались как специфичные только для опиоидных рецепторов. На рубеже 1980-1990-х годов были получены данные о влиянии ионов Na⁺ на связывающие характеристики и функциональный ответ на действие агонистов для ряда других GPCR, что свидетельствует о присущих этому иону свойствах аллостерического модулятора [276–279]. При изучении D₂-дофаминового рецептора было установлено, что в присутствии ионов Na⁺ аффинность рецептора к селективному D₂-агонисту квинпиролу снижается, в то время как его сродство к неселективному D₂/D₃-антагонисту эпидеприду повышается [278]. Это свидетельствует о стабилизации в присутствии ионов натрия неактивной конформации рецептора. Были обнаружены потенциальные мишени для связывания ионов Na⁺ – боковые карбоксилаты высококонсервативных остатков аспарагиновой кислоты, локализованных внутри трансмембранного домена, что указывало на расположение Na⁺‑связывающего аллостерического сайта в трансмембранном тоннеле, вблизи локализованного там в большинстве GPCR класса А ортостерического сайта. Замены остатка Asp⁷⁹ в α₂-AR и двух остатков Asp⁷¹ и Asp¹²² в mACh₁R, расположенных примерно в середине трансмембранного тоннеля и способных связывать моновалентные катионы, на аспарагин, лишенный такой способности, повышали аффинность этих рецепторов к агонистам и предотвращали негативное влияние на них ионов натрия [276, 277].

В дальнейшем исследования по локализации и конфигурации Na⁺-связывающих сайтов в GPCR были продолжены [268, 269, 280–282]. Было показано, что ключевую роль в формировании таких сайтов, наряду с остатком аспарагиновой кислоты, локализованным в ТМ2 (позиция 2.50), играют и ряд других, пространственно сближенных с ним АКО, также высококонсервативных в структуре большинства GPCR класса A [268, 280]. В A_2A-аденозиновом рецепторе, наряду с остатком Asp^52(2.50), ответственным за связывание иона Na⁺, в формировании Na⁺-связывающего сайта принимают участие остатки Ser^91(3.39), Trp^246(6.48), Asn^280(7.45) и Asn^284(7.49) [268, 281]. Замены остатков Asp⁵² и Asn²⁸⁴ на аланин полностью предотвращают негативный модулирующий эффект ионов Na⁺ на агонист-индуцированную активацию рецептора, в то время как замены остатков Ser⁹¹, Trp²⁴⁶ и Asn²⁸⁰ лишь частично его ослабляют [268]. При этом рецептор с заменами остатков Ser⁹¹ и Asn²⁸⁰ характеризуется повышенной базальной активностью, что является следствием подавления негативного модулирующего влияния ионов Na⁺ на устойчивость его активных конформаций [281]. Несмотря на то что Asp^52(2.50) локализован вне ортостерического сайта, он существенно влияет на его доступность для агонистов, а также контролирует перемещение агонистов в этот сайт и подходящее для активации рецептора расположение молекул агонистов в нем [268, 281].

Структурное изучение Na⁺-связывающего сайта в трансмембранном тоннеле δ-опиоидного рецептора показало, что имеются две координационные оболочки, с которыми взаимодействует ион натрия, будучи прочно связанным солевым мостиком с отрицательно заряженным карбоксилатом Asp^(2.50). Первую оболочку формируют пять атомов кислорода, три из которых относятся к боковым цепям Asp^95(2.50), Ser^135(3.39) и Asn^131(3.35), а два других атома кислорода к молекулам воды. Вторую координационную оболочку формируют боковые цепи еще трех АКО, Trp^274(6.48), Asn^310(7.45) и Asn^314(7.49), и еще две молекулы воды, которые осуществляют контакт с первой оболочкой [283–285]. Все эти остатки являются высококонсервативными среди GPCR класса А и у представителей некоторых других классов GPCR, что указывает на раннее происхождение в эволюции Na⁺-опосредуемого механизма аллостерической регуляции GPCR. В частности, они включены в высококонсервативные мотивы F^(6.44)XXW^(6.48)XP в ТМ6 и N^(7.49)PXXY^(7.53) в ТМ7, определяющие активацию GPCR и передачу гормонального сигнала к G-белкам и β-аррестинам [268, 280, 283]. При изучении D₂-дофаминового рецептора показано, что, как и в случае δ-опиоидного рецептора, ионы натрия опосредованно взаимодействуют с остатком Trp^(6.48), который функционирует как переключатель вращения ТМs при переходе от неактивной к активной конформации, и это позволяет стабилизировать неактивную конформацию рецептора в Na⁺-связанном состоянии [286].

При исследовании 3D-структур β₁-AR [287], A_2A-аденозинового рецептора [288], PAR1 [289] и δ-опиоидного рецептора [283] было установлено, что в Na⁺-связанном состоянии стабилизируется неактивное состояние рецептора, в то время как при потере ионов натрия, в том числе в результате связывания GPCR с ортостерическим агонистом, происходит его переход в активное состояние. Тем самым ионы Na⁺ выполняют функцию сохранения GPCR в неактивной конформации в отсутствие гормональной стимуляции [280].

В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные исследования Libin Ye и соавторов, в котором было изучено аллостерическое влияние ионов Na⁺ на различные конформеры A_2A-аденозинового рецептора и установлено, что в диапазоне относительно низких концентраций ионы Na⁺ стабилизируют неактивные конформации S-1 и S-2 и повышают долю переходной активной конформации S-3 [269]. Повышение доли конформаций S-1, S-2 и S-3 происходит вследствие снижения стабильности полностью активной конформации S-3*. Важно, что при повышении концентрации ионов Na⁺ доля конформации S-3 повышается, и это может указывать на наличие в молекуле рецептора второго сайта для связывания Na⁺ с более низким сродством к этому иону. Среднее время пребывания ионов Na⁺ в апо-форме A_2A-аденозинового рецептора составляет всего 480 миллисекунд. Процесс их выхода из сайта связывания с рецептором является непростым и не до конца понятым процессом. Потеря ионов натрия индуцирует возмущение расположенных по соседству с ним молекул воды, образующих высокоупорядоченную систему внутри трансмембранного тоннеля, в результате чего конформационные изменения охватывают не только центральную часть трансмембранного тоннеля, но и преддверие внеклеточного входа в него. После высвобождения ионов Na⁺ из аллостерического сайта их стабилизирующий эффект на неактивные и промежуточную активную конформации рецептора исчезает, что приводит к повышению доли активной конформации S-3* и эффективному связыванию ортостерического агониста [269]. Таким образом, для успешной активации рецептора ортостерический агонист, воспользовавшись очень узким энергетическим окном, возникающим после диссоциации ионов Na⁺ из связывающего его сайта, должен успеть достичь ортостерического сайта и прочно связаться с ним.

После того, как агонист связался с ортостерическим сайтом, доступ иона натрия к Na⁺-связывающему сайту прекращается. В противоположность полному ортостерическому агонисту, инверсионный агонист стабилизирует Na⁺-связанное состояние A_2A-аденозинового рецептора до 630 миллисекунд, что сокращает время существования рецептора в свободном от ионов натрия состоянии и снижает вероятность его активации полным или частичным агонистом [269]. В полном соответствии с этим находятся результаты, полученные с использованием масс-спектрометрии, по изучению конформационных состояний GPCR в среде с высоким содержанием ионов натрия. Показано, что агонисты существенно снижают связывание ионов Na⁺ с трансмембранным Na⁺-связывающим сайтом, в то время как антагонисты способствуют такому связыванию [290]. Имеются данные о том, что агонист способствует выталкиванию ионов натрия из трансмембранного тоннеля не во внеклеточное пространство, как описывает большинство моделей, а в цитоплазматическое пространство, чему способствует изменение протонирования внутренней полости трансмембранного тоннеля [291], и это хорошо соответствует модели “ионного тоннеля” для GPCR, предложенной еще в 1998 г. Zhorov и Ananthanarayanan [292, 293]. Расчеты показывают, что процесс передвижения ионов натрия в цитозоль характеризуется низкими энергетическими барьерами и может управляться физиологическими значениями мембранных потенциалов. Если исходить из такой модели, то транспорт ионов Na⁺ из внеклеточного в цитоплазматическое пространство через трансмембранный тоннель GPCR является одним из ключевых этапов активации рецептора и обеспечивает устойчивость активных его конформаций в процессе сигнальной трансдукции [291].

С использованием методологии молекулярной динамики, на примере 5HT_2B-серотонинового рецептора установлено, что ионы натрия транспортируются в Na⁺-связывающий сайт вдоль ТМ3, ТМ6 и ТМ7, после чего образуют сильные водородные связи с остатком Asp^(2.50) [294]. Дистанция между карбоксилат-анионом и ионом Na⁺ составляет в среднем 2.4 ангстрема, и колеблется в сравнительно узком диапазоне от 2 до 4 ангстрем, что предполагает высокую вероятность обнаружения ионов натрия на этом расстоянии от карбоксилата [294].

Следует, однако, отметить, что в 2020 г. появились данные о том, что наряду с “классической” локализацией Na⁺-связывающего сайта в центральной части трансмембранного домена, еще один, дополнительный Na⁺-связывающий сайт, может быть локализован во внеклеточном преддверии трансмембранного тоннеля, причем его функции существенно отличаются от таковых трансмембранного сайта [295]. Открытие второго сайта, расположенного в интерфейсе между ECL2 и соседними с ним ТМ4 и ТМ5, опиралось на результаты изучения 3D-структуры комплекса D₂-дофаминового рецептора и агониста MLS1547 с помощью молекулярного докинга. Связанный с этим сайтом ион Na⁺ осуществлял координацию взаимодействия между имидазольным кольцом остатка His^393(6.55) и отрицательно заряженной группой агониста MLS1547, причем это взаимодействие осуществлялось с участием двух молекул воды [295].

В настоящее время роль ионов Na⁺, как аллостерических модуляторов, продемонстрирована для большого числа GPCR, включая рецепторы биогенных аминов, нуклеотидов, пептидных гормонов и липидов [269, 280, 282, 285, 288, 296, 297]. C учетом структурного анализа трансмембранных доменов, можно с высокой вероятностью предполагать, что все GPCR наиболее обширного класса А регулируются ионами натрия, выполняющими функции NAM, в то время как в отношении других классов GPCR наличие Na⁺-связывающих сайтов показано лишь в некоторых случаях. Только в последние годы способность ионов натрия функционировать как NAM была продемонстрирована и детально изучена для различных типов дофаминовых рецепторов (D2, D3 и D4) [298, 299], 5-HT_1A-серотонинового рецептора [300], mACh₂R [301], δ‑ и µ-опиоидных рецепторов [285, 299], гистаминового рецептора 1-го типа [302], окситоцинового рецептора [303], V2-вазопрессинового рецептора [304], грелинового рецептора [305], хемокинового рецептора CXCR4 [306], ET_B-эндотелинового рецептора [307], рецептора лейкотриена B₄ (leukotriene B₄ receptor BLT1) [308], сопряженного с G‑белками цистеиниллейкотриенового рецептора 1-го типа (G protein-coupled cysteinyl leukotriene receptor, CysLT₁R) [309]. Исключительно важно, что обнаруженные эффекты ионов натрия реализуются при физиологических или близких к ним концентрациях, что свидетельствует об участии ионов Na⁺ в регуляции GPCR-сигналинга не в модельных (in vitro), а в реальных живых системах.

С учетом активности ионов Na⁺, как аллостерического регулятора GPCR, в экспериментах по оценке активности GPCR необходимо строго контролировать концентрацию ионов натрия во внешней среде, включая наличие в ней Na⁺-содержащих буферов и хелаторов, чтобы стандартизировать условия измерения и не искажать связывающие характеристики рецептора по отношению к агонистам и антагонистам. Следует отметить, что до настоящего времени отсутствуют надежные свидетельства того, что ионы калия могут аллостерически влиять на GPCR, в связи с чем K⁺-содержащие буферы относительно нейтральны по отношению к GPCR-сигнальным путям [267]. Хотя нельзя исключить того факта, что, замещая ионы натрия в среде инкубации, они могут опосредованно влиять на сигнальную трансдукцию, способствуя созданию Na⁺-дефицитных условий.

Ионы цинка

Ионы Zn²⁺ являются регуляторами более 300 ферментов и более тысячи транскрипционных факторов и зависимых от них физиологических процессов [310, 311]. Современные данные указывают на то, что это может быть обусловлено не только непосредственным влиянием ионов цинка на биологическую активность этих белков, но и присущими им свойствами аллостерических регуляторов GPCR. Еще в 1980–1990-годах было показано, что ионы цинка являются негативными регуляторами агонист-стимулированной активности μ-, κ- и δ-опиоидных рецепторов [312–314]. В дальнейшем было установлено, что ионы Zn²⁺ избирательно ингибируют связывание лигандов ортостерического сайта с D₁-, D₂- и D₄-дофаминовыми рецепторами, что было обусловлено повышением значения K_d для связывания этих лигандов, причем эффект ионов цинка был дозо-зависимым и полностью блокировался в присутствии хелатора двухвалентных катионов ЭДТА [315–317].

Показано влияние ионов цинка на активность различных типов адренергических рецепторов [318–320]. Так, установлено, что ионы Zn²⁺, как и близкие им по некоторым физико-химическим характеристикам ионы Cu²⁺, подавляют связывание антагониста празозина с α_1A-AR, снижая доступность для него ортостерического сайта [320]. В то же время в экспериментах по оценке специфичного связывания α_1A-AR с агонистами было продемонстрировано, что ионы Zn²⁺, в отличие от ионов меди, сдвигают влево концентрационную кривую связывания с рецептором агониста адреналина. Между тем, в экспериментах на клеточных культурах было показано, что как ионы цинка, так и ионы меди, сходным образом снижают эффективность ответа α_1A-AR на адреналин. На основании этого авторы делают заключение, что эффекты ионов цинка на функционирование предстательной железы, являющейся одной из мишеней агонистов α_1A-AR, регулирующих ее тонус, во многом обусловлены модулирующим воздействием ионов Zn²⁺ на α_1A-AR и зависимые от него сигнальные каскады [320].

В отношении β₂-AR показано, что ионы цинка являются PAM для связывания с рецептором β-агониста изопротеренола, существенно повышая его аффинность к β₂-AR, и также потенцируют стимулирующий эффект изопротеренола на активность АЦ и цАМФ-зависимые сигнальные каскады [318]. Для идентификации Zn²⁺-связывающего аллостерического сайта в β₂-AR была применена стратегия сайт-направленного мутагенеза, предусматривающая замены остатков гистидина, которые являются основными мишенями для ионов цинка. В результате было установлено, что замены His²⁶⁹, а также расположенных вблизи него остатков Cys²⁶⁵ и Glu²²⁵ на аланины приводили к полному блокированию (His²⁶⁹) или значительному снижению (Cys²⁶⁵, Glu²²⁵) позитивного аллостерического влияния ионов Zn²⁺ на активность β₂-AR [319]. Все эти остатки локализованы в цитоплазматических продолжениях ТМ5 и ТМ6. Тем самым Zn²⁺-связывающий сайт в β₂-AR расположен в области внутриклеточного вестибюля трансмембранного тоннеля. Этот сайт предопределяет взаимное расположение ТМ5 и ТМ6, которые вовлечены в формирование ортостерического сайта, контролирует его доступность для агониста и играет ключевую роль во взаимодействии рецептора с G-белками и β-аррестинами [319]. Недавно было показано, что усиление притока ионов цинка в кардиомиоциты, обусловленное активацией каналов TRPC6, приводит к повышению активности β₂-AR и усилению продукции цАМФ, что также может быть обусловлено активностью ионов цинка, как PAM для β₂-AR. Мутации в гене TRPC6, нарушающие приток ионов цинка в кардиомиоциты, полностью блокируют потенцирующий эффект этих ионов, способствуют снижению β₂-AR-опосредуемого положительного инотропного ответа и способствуют развитию хронической сердечной недостаточности [321].

Достаточно интригующими оказались результаты изучения аллостерических эффектов ионов цинка на меланокортиновые рецепторы, в первую очередь, на MC₄R [271, 322, 323]. Исследование влияния ионов цинка, а также ионов меди на связывающие характеристики MC₄R показало, что оба этих иона выступают в качестве NAM [322–324], в то время как в отношении их влияния на базальную и стимулированную агонистами активность рецептора данные оказались противоречивыми. Так, Holst и соавт. показали, что ионы Zn²⁺ сами способны повышать активность MC₄R и одновременно с этим потенцировать стимулирующие эффекты MC₄R-селективных агонистов на активность АЦ, функционируя, тем самым, как аго-PAM, причем в присутствии хелаторов стимулирующие эффекты ионов цинка утрачиваются [322, 324]. В то же время Lagerström и соавт. обнаружили, что ионы цинка сами характеризуются агонистической активностью, но при этом подавляют стимулирующие эффекты MC₄R-селективных агонистов, функционируя, в соответствии с приведенной нами современной классификацией, как аго-NAM [323]. Предпринятое в 2020 г. Link и соавт. более детальное исследование эффектов ионов цинка на MC₄R подтвердило их свойства, как NAM для связывания MC₄R-селективных агонистов, причем для этого необходимо было присутствие ионов кальция, которые сами являются PAM для такого связывания [271]. При этом ионы Zn²⁺ в низких, микромолярных концентрациях, которые были сопоставимы с их физиологическими концентрациями, проявляли агонистическую активность по отношению к MC₄R, но при этом, в зависимости от степени конституитивной активности рецептора, индуцированной Zn²⁺, отмечалось потенцирование или, напротив, ослабление стимулирующих эффектов ионов цинка. Другими словами, в отношении эффективности стимуляции MC₄R ионы цинка могли вести себя и как аго-PAM, и как аго-NAM [271]. Интересно отметить, что ионы меди функционировали как NAM для связывания MC₄R-селективных агонистов, и при этом снижали базальную и агонист-стимулированную активность MC₄R, функционируя как инверсионные агонисты и NAM [271]. Все это указывает на порой весьма сложный профиль фармакологической активности ионов цинка даже в отношении одних и тех же типов GPCR.

Если для β₂-AR Zn²⁺-связывающий сайт был идентифицирован вблизи цитоплазматического входа в трансмембранный тоннель, то в меланокортиновых рецепторах он предположительно локализован во внеклеточном его вестибюле [322, 323]. Так, в MC₁R этот сайт включает остаток Cys²⁷¹ в ECL3 и остаток Asp¹¹⁹ во внеклеточном сегменте ТМ3, и эти остатки высококонсервативны во всех типах меланокортиновых рецепторов [322]. В MC₄R Zn²⁺-связывающий сайт более утоплен в трансмембранный тоннель, располагаясь между внеклеточно ориентированными окончаниями ТМ2 и ТМ3, играющими важную роль в формировании ортостерического сайта, который в MC₄R имеет сложную конфигурацию и включает элементы внеклеточного вестибюля рецептора [323]. Предпочтительная внеклеточная локализация (между проксимальным к мембране сегментом ECL1 и внеклеточно ориентированным окончанием ТМ7) Zn²⁺-связывающего сайта была показана и для молекулы бычьего родопсина, модельной структуры для различных GPCR, включая MC₄R [325].

Сложный фармакологический профиль для ионов цинка был продемонстрирован и в случае 5‑HT_1A- и 5-HT₇-серотониновых рецепторов [270, 326, 327]. При изучении влияния ионов цинка на 5‑HT_1A-серотониновые рецепторы был обнаружен бифазный эффект, который включал аллостерическое потенцирование связывания агониста при субмикромолярных концентрациях Zn²⁺ (10 мкМ) и ингибирование связывания агониста при субмиллимолярных концентрациях этого иона (500 мкМ) [270]. В условиях in vivo ионы цинка сами не вызывали эффектов, характерных для селективных 5-HT_1A-агонистов, за исключением гипотермического эффекта, но при этом влияли на эффекты 8-OH-DPAT, агониста 5-HT_1A-серотониновых рецепторов, причем разнонаправленно. Вызываемое ионами цинка снижение температуры тела у грызунов полностью блокировалось в случае нокаута гена, кодирующего 5-HT_1A-серотониновый рецептор, что указывает на непосредственное его участие в этом эффекте ионов Zn²⁺. Важно, что эти ионы действовали как на пресинаптические, так и на постсинаптические рецепторы, но их эффекты на пресинаптические 5-HT_1A-серотониновые рецепторы были существенно более выраженными [270]. При действии на 5-HT₇-серотониновый рецептор ионы цинка демонстрировали свойства нейтрального антагониста при низких концентрациях (10 мкМ) и свойства мощного NAM и инверсионного агониста при высоких концентрациях (500 мкМ) [327]. В пользу ингибирующего влияния ионов цинка свидетельствуют следующие данные. В концентрации 500 мкМ ионы Zn²⁺ подавляли специфическое связывание с рецептором его агониста 5-карбоксиамидотриптамина и антагонистов SB-269970 и месулергина, а также снижали их сродство к рецептору, на что указывает повышение значений K_d, в наибольшей степени для 5-карбоксиамидотриптамина и месулергина [327].

Нейропептид галанин специфически связывается с тремя типами рецепторов, такими как GALR1, GALR2 и GALR3, два из которых сопряжены с G_i/o-белками (GALR1, GALR3), в то время как рецептор 2-го типа – с G_s-белком. Ионы цинка очень избирательно влияют на их активность, что во многом предопределяет селективность активации галанином внутриклеточных каскадов и опосредует физиологический ответ, который для галанина охватывает широкий спектр регуляторных эффектов на энергетический обмен, нейропатическую боль, сон, эпилептическую активность [272, 328]. Так, показано, что ионы Zn²⁺ ингибируют стимулированную галанином активность GALR1, в основе чего лежит снижение подвижности ТМ6 в присутствии ионов цинка [272]. При этом они не влияют на стимуляцию галанином GALR2, отличающегося по своей функциональной активности от GALR1, поскольку этот рецептор не ингибирует, а стимулирует активность АЦ и цАМФ-зависимых сигнальных каскадов [272]. Ингибирующий эффект ионов цинка был продемонстрирован в постсинаптических глутаматергических и GABA-ергических нейронах, в связи с чем интересен тот факт, что ионы цинка, высвобождаемые в синаптическую щель, ингибируют также ионотропные глутаматные рецепторы AMPA- и NMDA-типов [329, 330]. Важно отметить, что чувствительный к ионам цинка рецептор GPR39, вовлеченный в контроль синаптической пластичности [331], также вовлечен в регуляцию передачи сигналов через ионотропные глутаматные и GABA_A-рецепторы, и роль ионов цинка в этом случае может быть определяющей [332].

Еще 10 лет назад было установлено, что ионы Zn²⁺ регулируют активность рецептора GPR83 [333], который обладает уникальными свойствами, поскольку его эндогенными агонистами являются представители двух различных семейств пептидов – нейропептида PEN и холецистокинина, причем в зависимости от паттерна изоформ этих пептидов активируются как G_i/o-, так и G_s-сопряженные сигнальные каскады [334]. Установлено, что ионы цинка, взаимодействуя с остатками His¹⁴⁵, His²⁰⁴, Cys²⁰⁷ и Glu²¹⁷, локализованными в ECL2 и ECL3, формирующими внеклеточный вход в трансмембранный тоннель, и меняя подвижность ТМ6 и ТМ7, усиливают активацию рецептора агонистами, повышая стабильность активной конформации GPR83 [333]. Сходный эффект оказывает и близкий иону цинка по своим физико-химическим свойствам ион марганца. Мутации в сегментах, ответственных за связывание ионов цинка, существенно влияют как на базовую, так и на агонист-стимулированную активность GPR83 [333].

Все вышесказанное свидетельствует о том, что ионы цинка могут функционировать как аллостерические модуляторы различных типов GPCR, проявляя как положительный, так и отрицательный эффекты в отношении аффинности связывания и функциональной активности ортостерических агонистов, и эти эффекты могут зависеть от уровня конституитивной активности рецептора. Кроме того, ионы цинка действуют селективно на определенные подтипы рецепторов, что определяется структурными особенностями связывающего их аллостерического сайта, а также могут быть связующим звеном между регуляторными свойствами метаботропных и ионотропных рецепторов, как это показано в отношении ионотропных глутаматных и GABA_A-рецепторов, с одной стороны, и рецептором галанина 1-го типа и GPR39, с другой.

Ионы магния

Катионы магния являются регуляторами множества ферментов и сигнальных белков. Они являются важнейшими кофакторами, необходимыми для функционирования G-белков, взаимодействуя с сайтом их Gα-субъединиц, ответственным за связывание и обмен гуаниновых нуклеотидов, а также вовлечены в регуляцию ГТФазной активности, позволяющей Gα-субъединице переходить в ГДФ-связанное состояние и реассоциировать с Gβγ-димером [335]. При снижении концентрации ионов магния существенно ниже ее физиологических значений, в том числе вследствие добавления в инкубационную смесь хелаторов, активность G-белков и сопряженных с ними сигнальных каскадов в значительной степени снижается. Эти ионы совершенно необходимы для большого числа внутриклеточных эффекторов, мишеней GPCR-сигналинга, в том числе для специфической активности мембранно-связанных изоформ АЦ, активируемой через посредство G_s-белков и генерирующей универсальный вторичный посредник цАМФ [336]. Это может быть обусловлено как необходимостью ионов Mg²⁺ для сохранения надлежащего уровня активности компонентов GPCR-сигналинга, так и интенсивно изучаемыми в последние годы аллостерическими свойствами этого иона в отношении GPCR.

В настоящее время имеются свидетельства того, что ионы Mg²⁺ могут аллостерически регулировать мускариновые ацетилхолиновые, β-адренергические, опиоидные и дофаминовые рецепторы [269, 314, 336–341]. Первые сведения о способности ионов магния модулировать активность GPCR были получены почти полвека назад в отношении µ-опиоидных рецепторов [337], и этот факт в дальнейшем был подробно исследован [314, 341]. Было установлено, что ионы магния стабилизируют активную конформацию рецептора, в то время как ионы натрия оказывают противоположный эффект, стабилизируя неактивную его конформацию [314]. Тем самым ионы магния функционируют как PAM, в то время как ионы натрия для µ‑опиоидного рецептора являются NAM. В 2020 г. Hu и соавт. идентифицировали в µ-опиоидном рецепторе сайт, ответственный за связывание ионов Mg²⁺, который включал отрицательно заряженные остатки Asp²¹⁶ и Glu³¹⁰, локализованные соответственно в ECL2 и ECL3 [341]. Эти остатки обеспечивают закрытие и открытие внешнего входа в ортостерический сайт и потому их конформационная подвижность непосредственно влияет на аффинность рецептора к ортостерическому агонисту. Сайт, связывающий ионы натрия, находится в глубине трансмембранного тоннеля, традиционно включая высококонсервативный остаток Asp^(2.50), и не пересекается с сайтом связывания ионов Mg²⁺. В то же время продемонстрирована отрицательная кооперативность между связыванием ионов Mg²⁺ и Na⁺, поскольку в присутствии ионов натрия связывание ионов магния ослабляется, и наоборот [341].

Сходные аллостерические влияния ионов магния и натрия продемонстрированы и для A_2A-аденозинового рецептора, хотя механизмы и локализация Mg²⁺-связывающего аллостерического сайта в этом случае немного отличаются [269]. Показано, что ионы Mg²⁺, как и ионы Ca²⁺, увеличивают долю конформеров, соответствующих активированному состоянию A_2A-аденозинового рецептора, индуцированному как его обработкой 5'-N-этилкарбоксамид-аденозином (NECA), смешанным агонистом A₁- и A₂-аденозиновых рецепторов, так и добавлением С-концевого пептидного фрагмента Gα_s-субъединицы, который влияет на функциональное сопряжение рецептора с G_s-белками. Данные молекулярного докинга показывают, что оба иона, Mg²⁺ и Ca²⁺, способны проникать в трансмембранный тоннель и связываются там с сайтом, расположенным вблизи Na⁺-связывающего сайта, препятствуя негативному эффекту ионов Na⁺ на связывающие характеристики рецептора. Показано также, что ионы Mg²⁺ и Ca²⁺ взаимодействуют с отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка Glu^228(6.30), который является ключевым звеном в “ионном замке”, предотвращающим возвращение рецептора в неактивную конформацию [269].

Основными кандидатами для первичного взаимодействия с ионами Mg²⁺ и Ca²⁺ являются остатки Glu¹⁵¹, Glu¹⁶¹, Glu¹⁶⁹ и Asp¹⁷⁰, локализованные в ECL2 A_2A-аденозинового рецептора, во внеклеточно ориентированном вестибюле трансмембранного тоннеля [342]. Такое взаимодействие, согласно результатам молекулярного моделирования, суживая вход в трансмембранный тоннель, повышает доступность цитоплазматических G-белок-связывающих сайтов для образования функционально активного комплекса с G-белком. С другой стороны, такое суживание входа в тоннель может затруднить проникновение агониста к ортостерическому сайту. Важно и то, что ион Fe²⁺ не оказывает потенцирующего эффекта на агонист-индуцированную активацию A_2A-аденозинового рецептора, что может указывать на необходимость очень тонкой подгонки двухзарядного катиона к связывающему его сайту [269]. Остается открытым вопрос, оказывают ли двухзарядные катионы свой эффект на рецептор еще до его активации агонистом, или этот эффект реализуются уже после того, как рецептор перешел в активную форму.

Достаточно подробно изучено влияние ионов Mg²⁺ на активность mACh₂R, причем и в этом случае они проявляют свойства PAM [339, 340]. Показано, что в основе потенцирующего влияния Mg²⁺ на активность mACh₂R лежит его способность замедлять диссоциацию агониста из ортостерического сайта рецептора и, тем самым, существенно повышать устойчивость его активированной агонистом конформации. На это указывает значительный сдвиг вправо кривых конкурентного вытеснения N-метилскополамина, ортостерического селективного лиганда mACh₂R, в присутствии ионов магния, взятых в концентрации 3 мМ и выше [339].

Ионы кальция

Ионы Ca²⁺ являются одними из важнейших вторичных посредников, регулируя активность большого числа кальций-зависимых эффекторных белков, а также контролируют функциональную активность множества транскрипционных факторов, мишеней гормонов, действующих через посредство GPCR. Тем не менее большое значение в контроле сигнальной трансдукции также отводят аллостерическому влиянию ионов кальция на связывающие характеристики и степень активации GPCR. Выше отмечалось, что ионы кальция, наряду с ионами магния, могут функционировать, как PAM, при регуляции активности MC₄R и A_2A-аденозинового рецептора [269, 271]. В то же время спектр GPCR, которые аллостерически регулируются ионами кальция, существенно шире, хотя идентификация аллостерических эффектов ионов Ca²⁺ во многих случаях затруднена из-за проблем с их надежным дифференцированием от других эффектов этого иона.

Ионы кальция, а также близкие им по физико-химическим характеристикам ионы марганца повышают эффективность связывания агониста μ-опиоидного рецептора, [d-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ол]-энкефалина, с гомогенатами мозга морской свинки [314], а также усиливают высокоаффинное связывание гидроксибензилизопротеренола, агониста β-AR, с адренергическими рецепторами эритроцитарных мембран лягушки [336]. Повышение концентрации ионов кальция во внеклеточной среде аллостерически влияет на связывание ортостерических и аллостерических лигандов с метаботропным глутаматным рецептором 1α-подтипа (mGluR1α) и на величину стимулирующего эффекта mGluR1-агонистов [343]. Внеклеточный Ca²⁺ усиливает стимулирующий эффект ортостерического mGluR1α-агониста L-квисквалата на стимуляцию инозитол-специфичной PLСβ и внутриклеточный кальциевый сигналинг, и при этом снижает ингибирующие эффекты ортостерического mGluR1α-антагониста (S)-α-метил-4-карбоксифенилглицина на агонист-стимулированную активность mGluR1α. Идентифицированы АКО, локализованные в области внеклеточного вестибюля, ведущего в трансмембранный тоннель mGluR1α, которые формируют Ca²⁺-связывающий сайт и одновременно с этим участвуют в первичном опознавании ортостерических и аллостерических агонистов, мишенями которых являются связывающие карманы внутри трансмембранного тоннеля рецептора. Замены этих остатков приводят не только к нарушению аллостерического влияния ионов кальция на мутантный рецептор, но и вызывают изменение ответа mGluR1α как на ортостерический агонист L-квисквалат, так и на соединение Ro 67-4853 со свойствами PAM [343]. Полученные данные свидетельствуют о том, что внеклеточные ионы кальция способны аллостерически положительно модулировать выход ионов кальция из внутриклеточных депо через посредство активации системы mGluR1–G_q/11-белок–PLСβ [344].

Установлена важная роль ионов кальция в позитивной аллостерической регуляции меланокортиновых рецепторов MC₁R и MC₄R [345–347]. Ионы кальция, как и ионы магния, усиливали связывание полных и частичных агонистов с MC₁R в клетках меланомы мыши линии B16F10 [345]. В дальнейшем была установлена локализация Ca²⁺-связывающего сайта в MC₁R, для чего с помощью криоэлектронной микроскопии исследовали структуру комплекса MC₁R–G_s-белок с различными агонистами – эндогенным MCR-агонистом α-MSH, синтетическими MCR-агонистами афамеланотидом (afamelanotide) и SHU9119. В результате был выявлен уникальный и консервативный Ca²⁺-связывающий сайт, включающий Glu^(2.64), Asp^(3.25) и Asp^(3.29) в MC₁R, с которым взаимодействовали боковые функциональные группы α-MSH или его синтетических аналогов [347]. Наличие ионов Ca²⁺ препятствует образованию канонической дисульфидной связи между TM3 и ECL2, которая играет важную роль в доступности и аффинности ортостерического сайта в большом числе GPCR класса A. Снижение концентрации ионов кальция во внеклеточной среде или разрушение структуры Ca²⁺-связывающего сайта ослабляет агонист-стимулированную активность рецептора и ингибирует вызываемое MC₁R-агонистами повышение уровня цАМФ внутри клетки-мишени.

При анализе кристаллической структуры комплекса MC₄R–SHU9119 было показано, что во внеклеточном вестибюле он включает сайт с повышенной электронной плотностью, который способен с высокой эффективностью связывать двухзарядные катионы, включая ионы кальция [346]. В составе такого комплекса ионы Ca²⁺ образуют координационные связи с двумя карбонильными атомами кислорода, локализованными в основной цепи соединения SHU9119, пептидного аналога α-MSH, и с тремя отрицательно заряженными остатками Glu^100(2.60), Asp^122(3.25) и Asp^126(3.29), подобно тому, как это происходит в случае MC₁R. Ионы кальция повышали сродство α-MSH к MC₄R в 37 раз, а эффективность ответа к агонисту более чем в 600 раз, причем аллостерический эффект выявлялся только для внеклеточных ионов кальция (физиологические концентрации в структурах мозга около 1.2 мМ), в то время как изменение концентрации ионов Ca²⁺ внутри клетки на связывающие характеристики MC₄R существенно не влияли [346]. Эти данные указывают на решающую роль внеклеточных ионов Ca²⁺ в распознавании лигандов ортостерического сайта MC₁R и MC₄R и в активации MC_1/4R-опосредуемых сигнальных каскадов [346, 347].

Другие катионы

Информация о вкладе других катионов в аллостерическую регуляцию GPCR не столь многочисленна. Катионы меди ингибируют связывание антагониста празозина с α_1A-AR, экспрессируемым в культуре COS7-клеток, не влияя при этом на диссоциацию празозина от рецептора. Наряду с этим ионы Cu²⁺ оказывают модулирующее влияние на связывание эндогенного агониста адреналина с α_1A-AR и на трансдукцию адреналинового сигнала к эффекторным системам клетки [320]. Установлено, что ионы двухзарядного кобальта снижают аффинность связывания агонистов с µ-опиоидными рецепторами в гомогенатах мозга морской свинки [314]. Следует отметить, что какие-либо данные о возможном аллостерическом эффекте трехзарядных катионов на GPCR в настоящее время отсутствуют. Возможно, это указывает на отсутствие в их структуре потенциальных аллостерических сайтов для специфичного связывания таких ионов.

При анализе воздействий различных катионов на GPCR необходимо учитывать тот факт, что в ряде случаев их мишенями могут быть и другие сигнальные белки, образующие функционально активные комплексы с рецепторами. Наряду с этим ионы металлов могут образовывать комплексы с лигандами, модифицируя их способность связываться с ортостерическим или аллостерическим сайтами. В высоких концентрациях ионы металлов способны влиять на структурную организацию GPCR и устойчивость их комплексов, изменяя осмолярность среды и влияя на физико-химические свойства мембран. Вследствие этого для окончательного суждения об аллостерическом характере воздействия ионов металлов на структуру и функциональную активность GPCR часто требуются дополнительные разноплановые исследования. С другой стороны, обнаружение в GPCR сайтов, опосредующих их специфичное связывание с ионами металлов, и постоянно возрастающее число примеров аллостерической регуляции этими ионами указывают на то, что катионы металлов являются важнейшим, физиологически релевантным компонентом аллостерической регуляции GPCR, функционируя как NAM, PAM, аго-PAM, аго-NAM.

Хлорид-анионы

Имеются данные об аллостерическом влиянии хлорид-анионов на GPCR класса C. Эти анионы, как известно, модулируют активность множества других сигнальных белков (ионные каналы, рецепторы натрийуретических пептидов, и др.). Еще в 1995 году были получены данные о том, что хлорид-анионы повышают связывание [³H]-L-2-амино-4-фосфонобутирата с mGluR4, в то время как ни один из изученных двухзарядных катионов (Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺) на связывающие характеристики этого рецептора не влиял [348]. В дальнейшем было установлено, что значение EC₅₀ для связывания L-2-амино-4-фосфонобутирата с mGluR4 составляет 63 мМ, что соответствует примерно 50% концентрации хлорид-анионов во внеклеточной среде [349]. При воздействии глутамата на клетки с экспрессированным в них mGluR4 в среде с концентрацией хлорид-анионов в концентрациях, близких физиологическим, отмечали активацию этого рецептора, в то время как в среде с низкими концентрациями ионов Cl^– рецептор mGluR4 был мало чувствителен к глутамату [350]. Отмечалась высокая положительная кооперативность между хлорид-анионами и глутаматом (коэффициент Хилла около 6), вследствие чего даже небольшое повышение концентрации ионов Cl^– во внеклеточной среде приводило к значительному усилению глутамат-индуцированной активации mGluR4 [350]. Рецептор mGluR3 также чувствителен к хлорид-анионам, но в отличие от mGluR4 аллостерически регулируется и двухзарядными катионами. Хлорид-анионы позитивно регулируют эффекты агонистов на mGluR6 и mGluR8 [351]. В то же время некоторые представители глутаматных метаботропных рецепторов, такие как mGluR1 и mGluR2, не чувствительны к хлорид-анионам, при этом, например, рецептор mGluR1 является мишенью для аллостерического влияния ионов кальция и магния [349, 351]. Тем самым показана селективность аллостерической регуляции хлорид-анионами и двухзарядными катионами различных типов метаботропных глутаматных рецепторов, что позволяет дифференцированно контролировать их сигнальные каскады [351, 352].

С помощью сайт-направленного мутагенеза и молекулярного моделирования показано, что в основе PAM-эффекта хлорид-анионов в случае mGluR3 и mGluR4 лежит их связывание с двумя аллостерическими сайтами, расположенными в значительном по размеру внеклеточном домене метаботропных глутаматных рецепторов, что приводит к стабилизации индуцированного глутаматом активного состояния рецептора. Это является следствием формирования уникальной интерактивной сети “хлоридных замков” (interactive “chloride-lock” network), затрудняющих выход глутамата из ортостерического сайта [350, 352]. Тем самым хлорид-анионы существенно снижают эффективные концентрации глутамата и способствуют активации глутаматных рецепторов существенно более низкими концентрациями глутамата или его аналогов, вследствие чего полноценные функциональные ответы этих рецепторов на глутамат реализуются даже при микромолярных концентрациях этого агониста во внеклеточной среде. Фактически хлорид-анионы являются дирижерами такого ответа.

PAM-эффект хлорид-анионов показан также для кальций-чувствительного рецептора CaSR, который эффективно активируется ионами Ca²⁺ в среде, содержащей ионы Cl^–, но не ионы глюконата, которые хотя и имеют сходный с хлорид-анионами отрицательный заряд, но существенно превышают их по размеру, что не позволяет ионам глюконата эффективно взаимодействовать с Cl^–-связывающими сайтами рецептора [353]. Необходимо отметить, что в молекуле CaSR выявлено три сайта, структурно сходных с Cl^–-связывающими сайтами метаботропных глутаматных рецепторов, которые претендуют на роль аллостерических сайтов, специфично связывающих ионы Cl^– [353].

Учитывая вовлеченность хлорид-анионов в контроль вкуса, в последние годы значительные усилия были предприняты для исследования зависимости активности различных подтипов вкусовых рецепторов 1-го типа (T1r1, T1r2, и T1r3), относящихся к классу С GPCR, от содержания во внеклеточной среде ионов Cl^– [354, 355]. Необходимо отметить, что эти рецепторы в функционально активном состоянии образуют гетеродимеры T1r2a/T1r3 и T1r1/T1r3, что обеспечивает распознавание широкого спектра сладкого и пикантного вкусов, присущего сахарам и аминокислотам. При исследовании кристаллической структуры внеклеточного домена T1r3 в составе гетеродимера T1r2a/T1r3 японской рисовой рыбы, который кристаллизовали в присутствии хлорида натрия, были выявлены сайты, способные специфично связывать хлорид-анионы. Замена этих ионов на бромид-анионы вызывала критические изменения в структуре внеклеточного домена T1r3, в том числе в сайтах связывания аминокислот, результатом чего было снижение их связывающих характеристик [354]. Хлорид-анионы взаимодействовали с боковой гидроксильной группой остатка Thr¹⁰⁵ и с амидными группами остова пептидной цепи, принадлежащими остаткам Gln¹⁴⁸ и Ser¹⁴⁹. Остатки, с которыми взаимодействуют хлорид-анионы, координируются с остатком Ser¹⁵⁰, играющим критическую роль в связывании аминокислот, а также вовлечены в стабилизацию агонист-активированного состояния рецептора и его гетеродимерной структуры [354]. Тем самым хлорид-анионы важны как для поддержания конформации ортостерического сайта, обеспечивающей эффективную активацию рецептора пищевыми аминокислотами, так и для ди- и олигомеризации вкусовых рецепторов, определяющей их способность адекватно воспринимать внеклеточные сигналы. Важно, что хлорид-анионы в относительно низких, миллимолярных концентрациях были способны индуцировать в гетеродимере T1r2a/T1r3 конформационные изменения, вызываемые “классическими” агонистами этих рецепторов. Так, пероральное введение мышам хлорид-анионов повышало частоту импульсов во вкусовых нервах, где были экспрессированы различные подтипы T1r [355]. Тем самым, помимо модулирующей, хлорид-анионам присуща и собственная агонистическая активность, что позволяет их характеризовать в отношении вкусовых рецепторов T1r-семейства, как ago-PAM.

Нельзя исключить, что существуют и другие анионы, наделенные свойствами аллостерических регуляторов, но в настоящее время среди простых анионов такие свойства показаны только для хлорид-анионов. Эти свойства иона Cl^– должны учитываться в связи с тем, что многие лекарственные препараты и новые биологически активные тестируемые соединения представляют собой хлористоводородные соли, и нельзя исключить возможность манифестации собственной активности хлорид-анионов на физиологические и биохимические процессы. В определенной степени это относится и к некоторым катионам, в первую очередь к ионам натрия, также используемым в качестве противоионов в фармакологических препаратах.

7.5. Липиды

За последние годы для большого числа липидов показана способность аллостерически регулировать GPCR, причем наибольшее значение в этом отношении отводят мембранным липидам – холестерину и фосфолипидам. Изначально считали, что роль мембранных липидов обусловлена в основном их влиянием на физико-химические свойства плазматической мембраны и структурно-функциональную организацию рафтов, представляющих собой мембранные микродомены, ответственные за транслокацию и встраивание в мембрану сигнальных молекул и сборку сигнальных комплексов. При этом такое влияние, как правило, является неспецифическим и обусловлено свойствами липидов, функционирующих как структурная матрица для формирования многокомпонентных комплексов лиганд–GPCR–G-белок/β-аррестин–эффектор. В дальнейшем эти представления стали пересматриваться. Выяснилось, что действие липидов, в том числе и такого универсального аллостерического модулятора, как холестерин, во многих случаях является высоко специфичным по отношению к определенным типам GPCR, а в молекулах рецепторов имеются аллостерические сайты, ответственные за специфичное взаимодействие с различными классами липидов. Эти сайты, как правило, расположены на боковой поверхности трансмембранной части GPCR, контактирующей с липидами мембраны, и также включают сегменты проксимальных к мембране участков ECLs и ICLs. Тем самым липиды могут непосредственно влиять на конформацию и стерическую доступность ортостерических и аллостерических сайтов, локализованных внутри трансмембранного тоннеля рецептора, а также сайтов, локализованных во внеклеточных и внутриклеточных вестибюлях трансмембранного домена.

Основываясь на вышесказанном, предложены два основных механизма аллостерического воздействия липидов на GPCR. Первый из них является не специфичным или низко специфичным и зависит в основном от физико-химических свойств рецептора, его гидрофобности, площади контакта с мембраной, его микроокружения. Как известно, физико-химические свойства плазматической мембраны, такие как текучесть, упругость и механическая прочность, зависят от соотношения различных липидов в мембране, и это оказывает значительное влияние на структурные свойства GPCR и его комплексов, на стабильность и соотношение активных и неактивных конформаций рецептора, на сопряжение рецептора с трансдукторными и эффекторными белками. Это показано для различных типов GPCR, наиболее отчетливо для светочувствительного рецепторного белка родопсина.

Показано, что физико-химические свойства мембраны, ее толщина и текучесть, непосредственно влияют на переход между метародопсинами I и II, что предопределяет эффективность фототрансдукции [356–359]. Взаимосвязь между толщиной мембраны и конформационными характеристиками родопсина была наглядно продемонстрирована с помощью ступенчатого изменения толщины мембраны (фосфатидилхолиновые слои с толщиной гидрофобной фазы от 21 до 38 ангстрем), достигаемого путем изменения содержания холестерина в модельной мембране [359]. Добавление холестерина к мембране, толщина которой была меньше, чем средняя длина гидрофобных TM (менее 27 ангстрем), смещало равновесие в сторону метародопсина II, в то время как добавление холестерина к мембране, толщина которой превосходила длину TM, вызывало увеличение доли метародопсина I. В первом случае холестерин в небольшой степени повышал и, тем самым, нормализовал толщину мембраны, в то время как во втором случае он менял упругость мембраны и индуцировал образование олигомерных комплексов родопсина, стабилизируя конформацию метародопсина I [359].

Недавно было изучено прямое влияние физико-химических свойств мембраны на β₁-AR и AT₁-ангиотензиновый рецептор [360, 361]. В случае β₁-AR было обнаружено, что холат натрия, будучи встроен в мицеллы, образуемые додецил-β-D-мальтозидом, индуцирует димеризацию рецептора, усиливая контакты между ТМ1, ТМ2 и H8 протомеров [360]. В случае AT₁-ангиотензинового рецептора показано изменение его функциональной активности при изменении толщины и натяжения плазматической мембраны, причем паттерн активных конформаций в этом случае отличался от такового в случае активации рецептора эндогенным агонистом – ангиотензином II [361]. Описан двойственный механизм влияния холестерина на активность A_2A-аденозинового рецептора, путем влияния на физико-химические свойства мембраны и посредством специфичного связывания с молекулой рецептора [362]. Полученные данные указывают на то, что могут реализовываться два различных сценария активации AT₁-ангиотензинового и A_2A-аденозинового рецепторов, один из которых зависит от физико-химических свойств мембраны, в то время как второй реализуется вследствие специфичного связывания липида с рецептором, хотя нельзя исключать и совмещения этих сценариев.

Важная роль при реализации первого механизма, посредством которого липиды влияют как на связывающие характеристики и эффективность активации GPCR, так и на предпочтительность активации агонистом определенного сигнального каскада (предвзятость сигнальной трансдукции), принадлежит их способности регулировать субклеточную компартментализацию рецепторных и связанных с ними акцессорных и эффекторных белков и контролировать образование кавеол и липидных рафтов, представляющих собой scaffold-платформы для высокоупорядоченных многокомпонентных GPCR-содержащих комплексов [363–365].

С точки зрения машинерии липид-опосредуемой аллостерической регуляции наиболее интересен второй механизм, который состоит в непосредственном, высокоспецифичном взаимодействии липидов с аллостерическими сайтами, локализованными в молекуле GPCR. В качестве аллостерических регуляторов GPCR могут выступать такие липиды, как эндоканнабиноиды (анандамид, 2-арахидоноилглицерин) [366–370], липоксин А4 (производное арахидоновой кислоты) [371–373], олеамид [374–376], а также стероидные гормоны – прегненолон, прогестерон, 17β-эстрадиол и некоторые их метаболиты [377–382]. Эндоканнабиноиды, являясь эндогенными лигандами каннабиноидных рецепторов, негативно влияют на передачу сигналов через серотониновые рецепторы [366], mACh₁R и mACh₄R [367, 368], а также через A₃-аденозиновые рецепторы [369]. При этом отмечается высокая их селективность в отношении определенного типа близкородственных рецепторов, поскольку, например, 2-арахидоноилглицерин ингибирует связывание агонистов с A₃-аденозиновым рецептором, но не влияет на родственные ему A₁- и A_2A-аденозиновые рецепторы [369].

Наиболее изученным липидным аллостерическим регулятором GPCR является холестерин, основной компонент клеточных мембран, липидных рафтов, предшественник большого числа биологически активных липидов, включая стероидные гормоны [133, 383, 384]. Важную роль в аллостерической регуляции GPCR также имеют фосфолипиды, которые, как и холестерин, воздействуют на компоненты сигнальной трансдукции еще на ранних стадиях эволюции GPCR-систем [385, 386]. Их эффекты и механизмы действия подробно рассмотрены ниже.

Холестерин

Холестерин представляет собой стерол-подобный липид, который составляет до 30% мембран в клетках животных, и его основная функция состоит в регуляции текучести мембраны путем формирования упорядоченных структур между различными ее липидными компонентами. Поскольку в отличие от фосфолипидов холестерин представляет собой жесткую молекулу, при повышении его содержания в мембране ее текучесть снижается, в то время как толщина мембраны варьирует в меньшей степени. Несмотря на то что гидроксильные группы холестерина могут быть вовлечены во взаимодействие между двумя молекулами холестерина с образованием димеров, чаще с помощью водородных связей они взаимодействуют с гидроксильными группами других липидов или с молекулами белков и гликозильными группами [387].

Как отмечалось выше, холестерин может оказывать влияние на активность GPCR и их сигнальных каскадов, определяя физико-химические свойства мембраны или с высокой специфичностью взаимодействуя с аллостерическими сайтами в молекуле GPCR. Используя различные подходы, включая кристаллографический анализ комплексов рецепторов с холестерином, в настоящее время связывание холестерина продемонстрировано для большого числа рецепторов, в том числе для адренергических (α_2C-AR, β₂-AR), серотониновых (5-HT_1AR, 5‑HT_2BR), ангиотензиновых (AT₁R), хемокиновых (CCR9, CXCR2, CXCR3), опиоидных (κOR, μOR), аденозиновых (A_2AR), пуринергических (P2Y₁R, P2Y₁₂R), эндотелиновых (ET_BR), каннабиноидных (CB₁R, CB₂R) и метаботропных глутаматных (mGluR1a) рецепторов, рецепторов окситоцина, N-формилпептида и гонадолиберина, цистеиниллейкотриенового рецептора 2-го типа (CysLT₂R), холецистокининового рецептора 1-го типа (CCK1R) и ряда других GPCR, в основном принадлежащих к классу А [133, 182, 267]. При этом холестерин в таких комплексах может находиться как в форме мономера, так и димера. Существенно варьирует локализация молекулы холестерина в комплексе с GPCR, включая такую неожиданную ориентацию, как параллельное расположение в середине липидного бислоя или параллельное расположение относительно поверхности плазматической мембраны, как это показано для CB₁- и CB₂-каннабиноидных рецепторов соответственно [388, 389].

Еще в 1990–2010-е годы было показано, что повышенное содержание холестерина в липидных рафтах приводит к значительному усилению сродства рецептора окситоцина, mGluR1a, 5-HT_1AR и CCK1R к лигандам ортостерического сайта, в то время как в рафтах с низким содержанием холестерина аффинность рецепторов к агонистам резко ослабляется [390–393]. При этом восстановление содержания холестерина в обедненных им липидных рафтах восстанавливало число функционально активных рецепторов и их аффинность к лигандам [390, 391]. В обедненных холестерином мембранах снижалась не только активность рецепторов, но и нарушался процесс передачи гормонального сигнала, осуществляемого через GPCR. При недостаточности мембранного холестерина ослаблялась активация PLСβ и кальциевых сигнальных путей, опосредуемая агонистами CCK1R, и подавлялась стимуляция ERK1/2 и транскрипционного фактора c-Fos, вызываемая гонадолиберином при его стимулирующем воздействии на рецептор этого рилизинг-фактора. Нормализация содержания холестерина приводила к полному восстановлению этих эффектов [393, 394]. Важно подчеркнуть, что содержание мембранного холестерина может по-разному влиять на сигнальную трансдукцию даже в случае близкородственных рецепторов, что необходимо принимать во внимание. Так снижение содержания холестерина нарушает передачу сигнала с агонист-активированного μ-опиоидного рецептора, но мало влияет на сигнальные пути, реализуемые через δ-опиоидный рецептор [395]. Нормализация содержания холестерина в липидных рафтах приводит к восстановлению аффинности CCK1R к агонистам, но слабо влияет на сродство к агонистам холецистокининового рецептора 2-го типа (CCK2R) [393].

Обнаружение специфичных по отношению к определенным типам GPCR аллостерических эффектов холестерина поставило перед исследователями задачу выявить сайты, ответственные за взаимодействие рецепторов с этим липидом. Первые работы были осуществлены в 2008 г. Hanson и соавт., которые с помощью рентгеноструктурного анализа исследовали кристаллические структуры комплекса β₂-AR с двумя молекулами тимола и двумя молекулами холестерина [396]. Было показано, что в TM β₂-AR локализованы АКО, которые способны образовывать координационные связи с димерной формой холестерина – три остатка локализованы в ТМ4 и один в ТМ2, причем наиболее значимым было взаимодействие димера холестерина с остатком Trp^158(4.50). На основе полученных данных был предложен консенсусный мотив для связывания холестерина (cholesterol consensus motif, CCM), который включал 4 высококонсервативных АКО, имеющихся в большом числе других рецепторов (не менее, чем в 96 GPCR) [396]. В β₂-AR этот мотив, наряду с остатком Trp¹⁵⁸, включал остатки Tyr⁷⁰, Arg¹⁵¹ и Leu¹⁵⁵. Этот консенсусный мотив, находящейся в канавке между двумя или тремя TM-спиралями, включал положительно заряженный АКО в позиции 4.39-4.43 (Lys или Arg), алифатический АКО в положении 4.46 (Ile, Val или Ile) и ароматические АКО в положениях 4.50 (Trp или Tyr) и 2.41 (Phe, Tyr или Trp). В общем виде его можно представить как R/K-X5-I/V/L-X5-Y/W в одной TM-спирали (ТМ4 в случае β₂-AR) и F/Y в противоположной ей ТМ-спирали (ТМ2 в случае β₂-AR). При этом АКО Arg/Lys и Phe/Tyr в CCM находятся на внутриклеточном конце ТМ, что обеспечивает взаимодействие гидроксилов холестерина с их положительно заряженными боковыми группами. Остатки Tyr/Trp находятся в средней части трансмембранного домена, что лежит в основе гидрофобных и ароматических взаимодействий между ТМs и димерной формой холестерина, причем определяющую роль здесь играют π-π-стэкинговые взаимодействия [396, 397].

Однако в дальнейшем было показано, что в структуре GPCR могут быть и другие холестерин-связывающие консенсусные мотивы, поскольку ряд рецепторов, в которых отсутствует β₂-AR-подобный CCM, подвергаются аллостерической регуляции холестерином. Так, ССМ отсутствует в рецепторе эндотелина и в CB₂-каннабиноидном рецепторе несмотря на то, что оба этих рецептора образуют функционально активные комплексы с холестерином и являются мишенями его аллостерического влияния [307, 389]. В дополнение к этому, наличие такого β₂-AR-подобного CCM вовсе не является условием для зависимости активности рецептора от присутствия холестерина, как это показано для имеющего такой мотив CCK2R, активность которого, однако, не снижается при истощении запасов холестерина в липидных рафтах [393], и для ряда других GPCR, включая мускариновые ацетилхолиновые рецепторы [133, 398, 399]. Так, CMM были выявлены во всех пяти типах mAChR, но во всех известных для них 16 кристаллических структурах связывания с холестерином показано не было [400]. И только в двух кристаллических структурах mACh₁R была обнаружена совместная кристаллизация рецептора с водорастворимой формой холестерина – холестерил гемисукцинатом (cholesteryl hemisuccinate, CHS), но этот аналог существенно отличается от нативного холестерина по своим связывающим характеристикам с белковыми молекулами [398, 399].

В некоторых GPCR, несмотря на наличие CCM или подобного ему мотива, связывание холестерина было продемонстрировано в другом месте рецепторной молекулы, что указывает на наличие в GPCR альтернативных холестерин-связывающих сайтов. Один из таких сайтов локализован во внутриклеточном вестибюле трансмембранного тоннеля и включает цитоплазматическое окончание ТМ1 и спираль H8, как это показано для β₂-AR [12], κ-опиодиного рецептора [401], 5-HT_2BR [402, 403] и AT₁R [404]. Связывание холестерина с этим сайтом требует ковалентной модификации остатка цистеина, локализованного в спирали H8, жирнокислотным остатком (обычно пальмитатом), что обеспечивает подходящую для связывания липида конформацию этой спирали. Другой неканонический сайт располагается во внеклеточном вестибюле трансмембранного тоннеля и включает внеклеточное окончание ТМ6, как это показано для δ- и κ‑опиоидных рецепторов и А_2А-аденозинового рецептора [288, 386, 405, 406]. Существенные изменения по сравнению с каноническим CCM отмечаются в холестерин-связывающем мотиве μ-опиоидного рецептора, где вместо положительно заряженного остатка на границе ICL1 и TM2 располагается остаток Gln³¹⁴, образующий водородную связь с гидроксилом димерной формы холестерина [407, 408].

В настоящее время предложена обширная классификация локализации аллостерических сайтов для холестерина, причем немаловажную роль в предпочтительности выбора сайта связывания играет то, находится ли холестерин в мономерной или димерной формах. Как показано для β₂-AR [396], холестерин в димерной форме связывается с сайтом, расположенным в бороздке, образованной ТМ2, ТМ3 и ТМ4, включающей внутриклеточный вестибюль трансмембранного тоннеля. Сходная локализация сайта связывания димера холестерина показана в P2Y₁₂-пуринергическом рецепторе, рецепторе N-формилпептида и хемокиновом рецепторе CXCR2 [409–411]. Другая локализация холестерин-связывающего сайта также включает бороздку, образованную ТМ2, ТМ3 и ТМ4 (или ТМ6 вместо ТМ4), но направленную к внеклеточному входу в трансмембранный тоннель рецептора. Такая локализация, впервые изученная для A_2A-аденозинового рецептора [288, 386, 405], показана также для P2Y₁-пуринергического рецептора [163], κ-опиоидного рецептора в активной конформации [406, 412], μ-опиоидного рецептора в активной и неактивной конформациях [407, 408] и хемокинового рецептора CXCR3 в активной конформации [413], причем с рецептором и в этом случае взаимодействует исключительно димерная форма холестерина. В случае окситоцинового рецептора мономер холестерина связывается с расположенным во внеклеточном вестибюле сайте, образованном внеклеточными окончаниями ТМ4 и ТМ5 [414], а в случае α_2C-AR, P2Y₁₂-пуринергического рецептора и эндотелинового рецептора мономерный холестерин связывается с сайтом, также расположенным во внеклеточном вестибюле, но более вытянутым и образованным внеклеточными окончаниями ТМ1 и ТМ7 [133, 307, 409]. Мономерная форма может связываться и с внутриклеточным вестибюлем трансмембранного тоннеля, как это показано для κ-опиоидного рецептора [406], хемокинового рецептора CCR9 [146], цистеиниллейкотриенового рецептора CysLT₂R [415] и рецептора N-формилпептида [416]. Достаточно необычной является локализация холестерин-связывающего сайта, вынесенного за пределы трансмембранного домена и включающего в основном гидрофобную спираль H8 и внутриклеточное окончание ТМ1, как это продемонстрировано в случае 5-HT_2B-серотонинового рецептора [402, 403], AT₁R [404] и одной из кристаллических форм β₂-AR [12].

Необходимо отметить, что локализация сайтов связывания холестерина с GPCR и форма холестерина (мономер или димер) никак не коррелируют с типом G-белка или β-аррестина и особенностями внутриклеточных сигнальных путей, что указывает на раннее формирование в эволюции GPCR механизма их аллостерической регуляции холестерином и родственными ему липидами и указывает на отсутствие значимого влияния холестерина на предвзятость сигнальной трансдукции. Не выявлено и отчетливо выраженных закономерностей в связывании холестерина с активными и неактивными конформациями GPCR, что указывает на сложный паттерн влияния холестерина на связывающие характеристики рецептора и эффективность его активации агонистами. Однако делать окончательные выводы в этом случае преждевременно, поскольку требуются специальные исследования по вкладу холестерина в предвзятость и селективность сигнальной трансдукции.

Вот лишь некоторые примеры сложности и неоднозначности холестерин-опосредуемой регуляции функций GPCR и их каскадов. Показано, что холестерин способен повышать связывание агонистов с хемокиновым рецептором CXCR4 [417], но при этом негативно влияет на связывание агонистов с другим хемокиновым рецептором CCR5, структурно близким CXCR4 [418]. При этом удивительно, что в кристаллических структурах обоих хемокиновых рецепторов не было обнаружено холестерина. При повышении уровня холестерина в мембранах мозга отмечается повышение базальной активности CB1-каннабиноидного рецептора, что обусловлено стабилизацией активной конформации рецептора в присутствии холестерина, но при этом снижается его чувствительность к ортостерическим агонистам [419]. В кристаллической структуре A_2A-аденозинового рецептора идентифицированы сразу два сайта для связывания с димером холестерина. Один в наружном листке плазматической мембраны, включающий остатки Arg/Gln^(6.35) и Leu/Ile^(6.46), локализованные в ТМ6, и другой вблизи него, но включающий внеклеточные окончания ТМ2, ТМ3 и ТМ4, причем оба сайта находятся вблизи ортостерического сайта и даже могут, хотя и в небольшой степени, с ним перекрываться [404, 405]. Именно в связи с таким расположением этих сайтов отмечали снижение связывания A_2A-антагониста ZM241385 с рецептором в присутствии 3 мМ холестерина гемисукцината [420]. С другой стороны, не было выявлено существенного влияния содержания холестерина в мембране на связывание агонистов с A_2A-аденозиновым рецептором [421]. Как отмечалось выше, холестерин не был выявлен в кристаллических структурах всех пяти подтипов мускариновых ацетилхолиновых рецепторов, несмотря на наличие холестерин-связывающего сайта в их внеклеточном вестибюле [400, 422]. Снижение уровня холестерина в мембране приводило к снижению связывания mACh₁R, mACh₂R и mACh₃R с антагонистом N-метилскополамином, в то время как восстановление содержания холестерина приводило к повышению связывания этого антагониста с mACh₂R, но в еще большей степени снижало связывание с ним mACh₁R и mACh₃R [423, 424]. При этом эффекты повышения содержания холестерина в мембране оказывали противоположные эффекты на связывание рецепторов с агонистом карбахолом, что указывает на возможность присутствия в молекулах mAChR не одного, а двух холестерин-связывающих сайтов [133, 425]. Необычен тот факт, что некоторые GPCR, имеющие в своей структуре CCM или родственные им мотивы, нормально экспрессируются в мембранах, лишенных холестерина, и проявляют при этом специфическую активность, как показано для GPCR в холестерин-дефицитных мембранах бактерии Escherichia coli [426].

В отношении влияния холестерина на предвзятость GPCR-сигналинга имеется обнадеживающее исследование чешских ученых, Michal и соавт., в котором они изучили зависимость внутриклеточного сигналинга, осуществляемого через различные типы mAChR, от содержания мембранного холестерина [423, 424]. Было установлено, что истощение мембранного холестерина в случае mACh₂R приводит как к повышению активации G_i-белок-сопряженного каскада, направленного на снижение внутриклеточного уровня цАМФ, так и к усилению G_s-белок-опосредуемого усиления синтеза этого вторичного посредника. Наряду с этим отмечали ослабление стимуляции фосфоинозитидного обмена, реализуемого через активацию PLСβ, индуцированную как высвобождаемым при активации G_i-белка Gβγ-димером, так и α-субъединицей G_q/11-белка [423]. Необходимо отметить, что значительное повышение (+137%) содержания холестерина в мембране в сравнении с контролем не вызывало заметных изменений в сигнальной трансдукции, как цАМФ-зависимой, так и зависимой от продуктов гидролиза фосфоинозитидов. При изучении mACh₁R и mACh₃R было показано, что снижение содержания холестерина в мембране также приводит к повышению G_s-белок-опосредуемой активации АЦ. В то же время как повышение, так и снижение содержания мембранного холестерина вызывало значительное ослабление фосфоинозитидных путей, опосредуемых через G_q/11-белок [423, 424]. Сложные взаимоотношения между предвзятостью сигнальных путей mACh_1-3R и содержанием холестерина в мембране связывают с множественностью холестерин-связывающих сайтов в рецепторах, с различными механизмами влияния холестерина на активные и неактивные конформации рецептора (сайт-специфичное связывание и(или) влияние на текучесть и толщину мембраны), а также на стабильность комплексов рецепторов с другими компонентами сигнальной трансдукции [133, 422]. Важно и то, что аффинность холестерин-связывающих сайтов к холестерину также может в значительной степени варьировать, что приводит к различному паттерну их активации при различных концентрациях холестерина.

Отдельную и до конца не решенную проблему представляет влияние холестерина на стабильность ди- и олигомерных рецепторных комплексов, которые не только важны для функциональной активности GPCR, но в ряде случаев полностью определяют способность рецептора селективно активировать эффекторные системы [133, 427]. В настоящее время имеются свидетельства того, что холестерин, в первую очередь его димерные формы, оказывают регуляторное влияние на ди- и олигомеризацию для большого числа GPCR, включая β₂-AR [12, 428], CB1- и CB2-каннабиноидные рецепторы [429], хемокиновый рецептор CXCR4 [430], 5-HT_1AR [383, 431, 432], 5-HT_2AR [433], 5‑HT_2CR [432, 434], mACh₃R [435].

Еще в 2007 г. Vadim Cherezov и соавторы, осуществляя пионерские исследования по изучению пространственной структуры β-AR, показали, что кристаллическая структура β₂-AR, связанного с инверсионным агонистом, представляет собой гомодимер, в котором интерфейс между мономерами образован ТМ4-ТМ5 одного протомера и ТМ1-H8 другого протомера, причем каждый такой димер стабилизирован шестью молекулами холестерина и двумя молекулами пальмитиновой кислоты [12]. При этом в каждом мономере димер холестерина связан с ТМ2 и ТМ4, а мономер холестерина с ТМ1 и гидрофобной спиралью H8, в то время как жирнокислотная цепь пальмитата ковалентно связана с остатком цистеина в положении 341, что обеспечивает прочную ассоциацию H8 с липидной фазой мембраны. Эти результаты продемонстрировали как зависимость олигомеризации β₂-AR от присутствия холестерина, так и существование в молекуле рецептора, по крайней мере, двух холестерин-связывающих сайтов. В дальнейшем были проведены прямые исследования влияния содержания мембранного холестерина на димеризацию β₂-AR, и это позволило установить, что при низком содержании холестерина образуется β₂-AR-димер, в котором протомеры соединены посредством гидрофобных контактов между ТМ1 и ТМ2 одного протомера и ТМ4 и ТМ5 другого протомера. При повышении содержания холестерина, который взаимодействует с сайтом, включающим ТМ4, образуется β₂-AR-димер, соединенный посредством гидрофобных контактов ТМ1 и ТМ2 для обоих протомеров [428]. Таким образом, содержание холестерина в мембране является фактором, контролирующим организацию димерного комплекса β₂-AR, переводя комплексы с гетероинтерфейсом (ТМ4/ТМ5–ТМ1/ТМ2) в комплексы с гомоинтерфейсом (ТМ1/ТМ2–ТМ1/ТМ2), что, безусловно, влияет на эффективность и селективность сигнальной трансдукции.

В отсутствие холестерина при изучении димеризации 5-HT_2CR было идентифицировано до 17 различных интерфейсов, обеспечивающих взаимодействие протомеров, в то время как в присутствии холестерина их число сокращалось и преобладал интерфейс, включающий ось TM1–TM7–H8 [434]. Это может свидетельствовать в пользу того, что в обогащенных холестерином мембранах происходит уменьшение числа энергетически выгодных гомо- и гетероинтерфейсов с предпочтительным образованием какого-то одного типа комплекса [432]. В случае mACh₃R показано, что холестерин может стабилизировать и более сложные GPCR-комплексы, включающие четыре протомера, стабилизируя взаимодействия между рецепторными димерами [435]. Молекулы холестерина располагались в этом случае между димерами, обеспечивая более тесный контакт между ними и внося значимый вклад в стабилизацию тетрамерного комплекса. Это указывает на возможную роль холестерина в образовании многомерных GPCR-комплексов, в первую очередь для класса А GPCR [436].

Следует, однако, отметить, что холестерин также вовлечен в стабилизацию олигомерных комплексов и для GPCR класса С, в которых ключевую роль в стабилизации рецепторных комплексов играют внеклеточные домены [437]. Он является PAM для CaSR, обеспечивая эффективное образование гомодимерной формы рецептора посредством взаимодействия молекул холестерина с боковым гидрофобным радикалом остатков Ile⁸¹⁶, локализованных в ТМ6 каждого из протомеров [438]. Определяющая роль холестерина в образовании функционально активного гомодимерного комплекса показана в отношении орфанного рецептора GPR158, который экспрессируется в мозге и посредством регуляции цАМФ-зависимых каскадов вовлечен в синаптогенез, контролируя, тем самым, когнитивные функции и развитие депрессивных состояний [439]. Молекулы холестерина локализованы как в интерфейсе между протомерами рецептора, делая димерный комплекс более устойчивым, так и снаружи, что позволяет сохранить GPR158 в неактивной конформации, предотвращая активацию им G-белков. Важно, что молекулы холестерина также влияют на образование комплекса GPR158 с RGS-белком (RGS7-Gβ5) [439]. Три молекулы холестерина способны специфично связываться с GABA_BR, который находится в комплексе с PAM, тем самым, обеспечивая повышение его активности, направленной на открытие калиевых каналов, снижение активности цАМФ-зависимых и кальциевых сигнальных путей [440]. Интересно, что с рецептором, в ортостерическом сайте которого находится антагонист, способны взаимодействовать от 10 до 16 молекул холестерина, как в мономерной, так и в димерной формах, и это обеспечивает формирование прочного гомодимерного GABA_BR-комплекса [441]. В свободном от лиганда состоянии GABA_BR, напротив, не способен специфично взаимодействовать с холестерином, и это позволяет сделать вывод о том, что сайты для связывания холестерина, которые вовлечены в процесс олигомеризации рецептора, имеют различную доступность в зависимости от занятости ортостерического или аллостерических сайтов [437].

Поскольку уровень холестерина и соотношение его форм существенно меняются при различных патологических состояниях, то имеются веские основания полагать, что индуцированные этим изменения аллостерических эффектов холестерина на GPCR-сигналинг вносят заметный вклад в этиологию и патогенез многих заболеваний [432, 437, 439, 442–444].

Фосфолипиды

Несомненно, что фосфолипиды плазматической мембраны влияют на ее физико-химические характеристики и, тем самым, непосредственно регулируют активность GPCR, предвзятость сигнальной трансдукции, устойчивость олигомерных рецепторных комплексов и комплексов GPCR с другими компонентами сигнальной трансдукции, причем, как правило, фосфолипиды действуют в ансамбле с холестерином и другими мембранными липидами [181, 385, 386, 445]. В 2016 г. Dawaliby и соавт. показали, что различные фосфолипиды, такие как диолеилфосфатидилглицерин, диолеилфосфатидилсерин и диолеилфосфатидилинозитол (DOPG, DOPS и DOPI), взаимодействуя с сайтами, локализованными во внутриклеточном вестибюле трансмембранного тоннеля, стимулируют как базальную, так и агонист-индуцированную активность β₂-AR, в то время как диолеилфосфатидилэтаноламин действует противоположным образом, стабилизируя неактивное состояние рецептора [180]. Действие фосфолипидов осуществлялось в том числе и в отсутствие β₂-агониста, что указывает на независимость их влияния от конформационных перестроек, вызываемых лигандами ортостерического сайта, и позволяет рассматривать фосфолипиды как самодостаточные аллостерические регуляторы. В дальнейшем было изучено влияние фосфолипидов на активность различных представителей класса А GPCR, включая β₁-AR, A_2A-аденозиновый рецептор и нейротензиновый рецептор 1-го типа (NTSR1) [181, 386]. Во всех случаях, как и в β₂-AR, фосфолипид-связывающие сайты были локализованы в области цитоплазматического входа в трансмембранный тоннель.

При изучении β₁-AR было показано, что две молекулы фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (PIP2) стабилизируют комплекс рецептора с α‑субъединицей G_s-белка, основным трансдукторным белком для β₁-AR, но при этом не влияют на образование комплекса с другими типами α-субъединиц (Gα_i, Gα_q) или с антителами, выработанными на цитоплазматические участки рецептора [181]. При этом другие изученные фосфолипиды, например, фосфатидилсерин, слабо или вовсе не влияли на связывание β₁-AR с Gα_s-субъединицей и на активацию нижележащих сигнальных каскадов, что указывает на специфичность PIP2, как PAM для этого рецептора. Связывание PIP2 с рецептором повышается в условиях его активации изопротеренолом, неселективным β-агонистом, и это обусловлено конформационными изменениями в ICL2, которая не только тесно связана с агонист-индуцированной активацией G_s-белка, но и, как можно полагать, является одной из мишеней для связывания с фосфолипидами. При этом положительно заряженные остатки, локализованные в проксимальных участках ICL2 и ICL3, могут быть вовлечены в ионные взаимодействия с отрицательно заряженной “головкой” фосфолипида. Это согласуется с тем фактом, что фосфолипиды, не содержащие полианионных групп, такие как фосфатидилсерин, не были активны в случае всех трех изученных рецепторов [181]. Возможно, однако, что другие, чем PIP2, фосфолипиды могут влиять на текучесть и толщину мембраны и, тем самым, модулировать GPCR-опосредуемую сигнальную трансдукцию, как это показано для β₂-AR [180], но это требует дополнительных исследований для более широкого спектра рецепторов.

Значительный интерес в последние годы представляет опосредуемая фосфоинозитидами аллостерическая регуляция GPCR, обусловленная их способностью влиять на образование комплекса между GPCR и β-аррестинами, что играет критическую роль как в контроле β-аррестинового сигналинга, так и в процессе эндоцитоза и рециклизации рецепторов [385]. Для эффективного образования комплексов с GPCR необходима транслокация β-аррестинов в плазматическую мембрану и их накопление вблизи рецепторных комплексов в составе структур, покрытых клатрином (clathrin-coated endocytic structures, CCSs), еще до GRK-опосредуемого фосфорилирования GPCR, являющегося триггером для взаимодействия с β-аррестинами. Как β-аррестин, так и ассоциированные с ним компоненты эндоцитарного аппарата, включая адаптерный белок-2 (AP-2), способны взаимодействовать с PIP2 [446, 447]. В результате была выдвинута гипотеза, которая сейчас получила весомые доказательства, что “каталитически активированный” β-аррестин должен находиться в комплексе с мембранными PIP2 до его связывания с рецептором и в дальнейшем PIP2 обеспечивает надлежащее взаимодействие β-аррестинов с лиганд-рецепторным комплексом и реализацию сигнальных функций такого комплекса [385, 445, 448]. При изучении комплекса нейротензинового рецептора 1-го типа с β-аррестином с помощью криоэлектронной микроскопии было показано включение в него PIP2, который образовывал мостик между внутриклеточными окончаниями ТМ1 и ТМ4 рецептора и С-концевой частью молекулы β-аррестина. При этом отрицательно заряженная головка PIP2 образовывала солевые мостики с положительно заряженными аминогруппами остатков лизина и аргинина, которые были локализованы на поверхности β-складчатых структур β-аррестина, обращенных по направлению к внутриклеточному вестибюлю трансмембранного тоннеля рецептора [448]. Мутантный β-аррестин, имеющий замены положительно заряженных аминокислот Lys²³²Gln, Arg²³⁶Gln и Lys²⁵⁰Gln, не способен образовывать комплекс с β₂-AR, что препятствует как интернализации рецептора, так и осуществлению β-аррестин-специфичных сигнальных каскадов [385, 445, 446].

Детальное изучение структурных особенностей комплексов GPCR и β-аррестинов и возможного участия в их стабилизации PIP2 и других фосфолипидов показало, что фосфолипиды наиболее важны для образования таких комплексов в случае GPCR класса А, но не GPCR класса B [385]. Это обусловлено тем, что GRK-индуцированное фосфорилирование GPCR класса А не позволяет обеспечить эффективное взаимодействие с молекулой β-аррестина без ее дополнительной координации с помощью PIP2. Образование мостика между фосфорилированным рецептором и β-аррестином позволяет не только стабилизировать тройной комплекс лиганд–GPCR–β-аррестин, но и обеспечивает β-аррестин-специфичную трансдукцию, а также интернализацию и рециклизацию GPCR. Определенную роль здесь играет взаимодействие PIP2 с С-концевой частью β-аррестина, что позволяет обеспечить его конформацию, оптимальную для связывания с рецептором. GRK-опосредуемое фосфорилирование GPCR класса B в полной мере обеспечивает рекрутирование и тесное взаимодействие с β-аррестинами, вследствие чего участие PIP2 в этом случае не является необходимым, хотя нельзя исключить, что фосфоинозитиды могут влиять на другие этапы сигнальной трансдукции. Тем самым по способности фосфоинозитидов влиять на образование комплекса между рецептором и β-аррестином все GPCR можно условно разделить на PIP2-зависимые и PIP2-независимые [385, 386]. При переходе в активное состояние, в том числе в G-белок-связанном состоянии, GPCR способны накапливать PIP2 вблизи внутриклеточной части трансмембранного домена, тем самым, презентуя их для β-аррестинов [181, 449].

Аллостерические функции может выполнять фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PI(3,4,5)P3), продукт катализируемой фосфатидилинозитол-3-киназой реакции, как это продемонстрировано для рецептора паратиреоидного гормона 1-го типа (PTH1R) [450]. Этот рецептор, как в активном, так и в неактивном состоянии, образует комплексы с различными липидами, включая фосфолипиды, что указывает на присутствие в нем липид-специфичных аллостерических сайтов [451, 452]. При погружении в клетку в составе ранней эндосомы PTH1R осуществляет активацию АЦ и стимулирует цАМФ-зависимые сигнальные пути. Показано, что важную роль в эндосомальном сигналинге агонист-стимулированного PTH1R играет образование комплекса лиганд–PTH1R–Gβγ-димер–β-аррестин. В свою очередь, стабилизация этого комплекса осуществляется с помощью PI(3,4,5)P3, который, подобно PIP2, осуществляет координацию молекул рецептора и β-аррестина в этом комплексе [450, 453].

7.6. Аминокислоты, пептиды и белки

Аминокислоты и их производные

Среди 20 “канонических” природных аминокислот, являющихся структурными элементами пептидов и белков у эукариотических организмов, наибольшую роль в качестве аллостерических регуляторов GPCR играют ароматические аминокислоты (триптофан, тирозин и фенилаланин), а также гомоцистеин и агматин, метаболиты цистеина и аргинина соответственно [267]. Функционирование ароматических аминокислот в качестве аллостерических регуляторов представляется весьма логичным, по крайней мере, по двум причинам. Во-первых, некоторые их производные являются эндогенными ортостерическими агонистами GPCR, например, серотонин, триптамин, дофамин, адреналин, норадреналин, октопамин, что предопределяет наличие множественных сайтов связывания для них. Во-вторых, ароматические аминокислоты, обладающие липофильными свойствами, легко проникают в гидрофобные карманы рецепторов, а также в интерфейсы между липидным слоем мембраны и внешней поверхностью трансмембранного домена, где располагаются полости, являющиеся потенциальными аллостерическими сайтами.

Основными мишенями аллостерического влияния ароматических аминокислот являются GPCR класса С, имеющие значительный по размеру внеклеточный домен, в первую очередь CaSR [454–457]. Показано, что ароматические аминокислоты специфично связываются с аллостерическими сайтами, которые расположены вблизи входа в трансмембранный тоннель и сформированы сегментами CaSR, и потенцируют стимулирующее влияние ионов кальция на активность рецептора [456]. Имеются сведения о модулирующем влиянии фенилаланина и алифатических аминокислот, лейцина и изолейцина, на регуляторные эффекты баклофена на активность GABA_BR, что, как считают, вносит определенный вклад в функционирование сигнальных систем, контролируемых γ-аминомасляной кислотой [458]. Однако физиологическая роль такого влияния до конца не ясна, тем более что дальнейшие исследования не подтвердили возможности регуляции GABA_BR низкими, не превышающими физиологические, концентрациями фенилаланина [459].

Обнаружение того факта, что гомоцистеин может выступать в роли аллостерического регулятора D₂-дофаминового рецептора, указывает на возможные дополнительные механизмы патогенетического влияния этого производного цистеина, повышение концентрации которого в крови ассоциировано с нейродегенеративными и эндокринными заболеваниями. Гомоцистеин связывается с аллостерическим сайтом, включающим проксимальные сегменты ECL3 D₂-дофаминового рецептора, снижая его активацию дофамином и функционируя, тем самым, как NAM [460]. В этом отношении интересен тот факт, что одним из подходов для лечения болезни Паркинсона является применение агониста дофаминовых рецепторов – L-3,4-дигидроксифенилаланина (L-DOPA), который с помощью фермента катехол-O-метилтрансферазы легко превращается в гомоцистеин. У пациентов, леченных L-DOPA, в качестве одного из побочных эффектов наблюдают гипергомоцистеинемию и это сопровождается снижением эффективности используемой терапии [461]. В связи с этим имеются все основания считать, что образующийся при метилировании L-DOPA гомоцистеин аллостерически снижает агонист-индуцированную активацию D₂-дофаминового рецептора [462]. Более того, это объясняет и высокую эффективность ингибиторов катехол-O-метилтрансферазы, препятствующих гипергомоцистеинемии и усиливающих эффекты L-DOPA на дофаминовую систему мозга у пациентов с болезнью Паркинсона [461].

Агматин является PAM для α₂-AR, повышая связывание с ним норадреналина, причем в основе действия агматина лежит взаимодействие как с аллостерическим, так и с ортостерическим сайтами рецептора [463]. Активирующее влияние агматина на функции α₂-AR во многом объясняет защитные эффекты этого декарбоксилированного производного аргинина при лечении неврологических заболеваний и нарушений функций сердечно-сосудистой системы [464]. Показано, что агматин, также как и L-аргинин, способен позитивно модулировать активность CaSR [465, 466]. На изолированных кардиоцитах зимующих сусликов продемонстрировано, что посредством связывания с CaSR низкие дозы агматина (до 500 мкМ) вызывают Gβγ-опосредуемую активацию 3-фосфоинозитидного пути, что приводит к повышению продукции оксида азота эндотелиальной NO-синтазой. В дозах выше 2 мМ агматин вызывает CaSR-опосредуемую стимуляцию PLСβ и повышает уровень внутриклеточного кальция [465]. Тем самым в зависимости от концентрации агматина происходит перераспределение внутриклеточных сигнальных каскадов, реализуемых через CaSR.

Пептиды и белки

Одним из хорошо исследованных пептидных аллостерических регуляторов GPCR является 5-гидрокситриптамин-модулин, представляющий собой тетрапептид Leu-Ser-Ala-Leu, высвобождаемый в различных областях мозга. Он специфично взаимодействует с аллостерическими сайтами, локализованными в серотониновых рецепторах 5-HT_1B/1D-подтипа, и подавляет индуцированную агонистами синаптосомальную активность этих рецепторов, функционируя как NAM [467–469]. При остром иммобилизационном стресе в различных областях мозга определяли быстрое и значительное повышение уровня 5-гидрокситриптамин-модулина, что приводило к десенситизации 5-HT_1B/1D-серотониновых рецепторов и нарушало реализуемое через него ингибирующее влияние на активность АЦ [470].

Свойства аллостерических регуляторов для различных типов каннабиноидных рецепторов продемонстрированы у пептидов, являющихся производными α-гемоглобина, в первую очередь у RVD-гемопрессина (RVD-hemopressin) RVDPVNFKLLSH, обозначаемого как пепкан-12 (pepcan-12) [471–473]. RVD-гемопрессин демонстрировал активность NAM для CB₁-каннабиноидного рецептора, подавляя связывание с ним ортостерического агониста WIN55212-2 и ингибируя агонист-индуцированную активацию опосредуемых через CB₁-каннабиноидный рецептор сигнальных каскадов [472, 474]. Нонапептид гемопрессин PVNFKLLSH также обладал способностью влиять на активность CB₁-каннабиноидного рецептора, хотя и в меньшей степени в сравнении с пепканом-12 [475], но при физиологических условиях в процессе гидролиза α-гемоглобина, в отличие от пепкана-12, он не образуется и потому не имеет существенного значения для клиники [471, 472]. Важно, что пепкан-12 может быть применен для нормализации пищевого поведения и энергетического обмена при метаболических расстройствах, поскольку, в отличие антагонистов ортостерического сайта CB₁-каннабиноидного рецептора, действует более мягко и не вызывает депрессивных и других неврологических расстройств [476, 477]. Одним из путей введения пепкана-12 может быть применение его биологического прекурсора – пепкана-23, который более устойчив к гидролизу и надежно превращается в пепкан-12 в условиях in vivo [478].

Укорочение пепкана-12 с N-конца всего на одну аминокислоту наделяет полученный ундекапептид VD-гемопрессина свойствами селективного аллостерического агониста CB₁-каннабиноидного рецептора [479, 480]. В тесте отдергивания хвоста у мышей показано, что при спинальном и супраспинальном введении VD-гемопрессин дозо-зависимо вызывал антиноцицептивный эффект со значениями EC₅₀ менее 7 нМ, и этот эффект блокировался селективными CB₁-антагонистами [479]. При супраспинальном введении VD-гемопрессин также вызывал характерную для CB₁-агонистов гипотермию и влиял на мотивацию пищевого поведения, и эти эффекты снимались в присутствии CB₁-антагонистов [480].

В отношении CB₂-каннабиноидного рецептора пепкан-12, действуя в наномолярных концентрациях, проявляет свойства PAM, потенцируя стимулирующие эффекты CB₂-агонистов, в том числе 2‑арахидоноилглицерина [473]. В присутствии пепкана-12 усиливаются как стимулирующие эффекты этих агонистов на ГТФ-связывающую активность G_i-белков, так и реализуемое через них ингибирование АЦ. Поскольку содержание пепкана-12 и его прекурсора пепкана-23 повышается при ишемии и воспалительных процессах, а CB₂-каннабиноидные рецепторы выполняют при этих патологических состояниях защитные функции, то генерацию пепкана-12, как агониста этих рецепторов, можно рассматривать в качестве молекулярного механизма реализации этих функций [473]. Принимая во внимание локализацию аллостерических сайтов в молекуле CB₂-каннабиноидного рецептора, связывание пепкана-12 и его аналогов осуществляется предположительно с сайтами H и J, локализованными во внеклеточном преддверии трансмембранного тоннеля и прикрывающими сверху ортостерический сайт [481]. Необходимо отметить, что недавно был идентифицирован еще один пептидный регулятор с активностью ago-PAM для CB₂-каннабиноидного рецептора – пептид остеогенного роста (osteogenic growth peptide, OGP), который предотвращает потерю костной ткани при старении [482]. Тем самым, каннабиноидные рецепторы являются мишенями для целого ряда пептидов, образующихся как в норме, так и в условиях патологии, и способных аллостерически влиять на нервную и другие системы организма, дифференцированно регулируя различные типы каннабиноидных рецепторов [483].

Мишенями белков, обогащенных положительно заряженными аминокислотами, являются mACh₂R. Эти белки взаимодействуют с отрицательно заряженным аллостерическим сайтом, расположенным в области внеклеточного входа в трансмембранный тоннель рецептора [484]. Поликатионный белок протамин, основной белок миелина, положительно заряженный пептид динорфин-А(1-13) [485, 486], некоторые токсины яда змей [487], а также обогащенный остатками аргинина доминантный основный белок эозинофилов (eosinophil major basic protein) [488, 489], в больших количествах высвобождаемый у пациентов с бронхиальной астмой в области воспаления и активирующий тучные клетки и нейтрофилы, негативно регулируют mACh₂R-опосредуемый сигналинг, причем их действие, за исключением компонентов яда змей, высоко специфично по отношению к mACh₂R.

Достаточно интересен тот факт, что аллостерические свойства присущи глутатиону, представляющему собой трипептид γ-Glu-Cys-Gly, основной функцией которого является поддержание окислительно-восстановительного баланса в клетке. Глутатион, подобно ароматическим аминокислотам, позитивно воздействует на активность CaSR [490, 491]. При этом основным физиологическим результатом такого взаимодействия является изменение продукции паратиреоидного гормона фолликулярными клетками паращитовидной железы, в том числе при различных формах гиперпаратиреоза [491]. Тем самым изменение содержания глутатиона может приводить к патологии не только вследствие нарушений окислительно-восстановительного баланса в организме, но и путем изменения функциональной активности CaSR и его сигнальных каскадов [492].

7.7. Аутоантитела к GPCR

В результате деградации GPCR и их комплексов, нарушения процессинга рецепторов и их внутриклеточной локализации, как в норме, так и в условиях патологии (онкологические и эндокринные заболевания, травмы, воспалительные процессы, некроз, аутофагия), генерируется большое число различающихся по размеру и локализации фрагментов GPCR. В дальнейшем эти фрагменты выступают в роли антигенов, к которым вырабатываются специфичные ауто-GPCR-антитела. В последние годы проводятся интенсивные исследования по идентификации и изучению механизмов образования таких антител, а также выясняются молекулярные механизмы их действия и их роль в развитии аутоиммунных заболеваний [116, 493–495]. Наибольший интерес представляют антитела, вырабатываемые на внеклеточный N-концевой домен и ECLs GPCR, поскольку в физиологических условиях они способны с высокой специфичностью взаимодействовать с внеклеточными участками рецепторов и аллостерически влиять на их функциональную активность и сродство к агонистам.

Одни аутоантитела характеризуются агонист-подобной активностью, вызывая повышение базальной активности GPCR, или потенцируют стимулирующие эффекты агонистов, функционируя как PAM. Другие аутоантитела подавляют регуляторные эффекты агонистов, снижая их сродство к GPCR и предотвращая активацию внутриклеточных сигнальных каскадов, функционируя, тем самым, как NAM. Ряд аутоантител имеют более сложный спектр биологической активности, обеспечивая предвзятость внутриклеточного сигналинга и модулируя активность других аллостерических GPCR-регуляторов [494]. Основными мишенями ауто-GPCR-антител являются либо N-концевые внеклеточные домены и их спейсеры с трансмембранным доменом, как это имеет место в случае рецептора ТТГ [496, 497] и CaSR [498], либо ECLs рецепторов, как это продемонстрировано для большого числа GPCR класса А [494]. Определяющая роль в таких взаимодействиях принадлежит ECL2, которая в большинстве рецепторов не только самая значительная по размеру, но и локализована при входе в трансмембранный тоннель, влияя на доступность ортостерического сайта и на взаимное расположение ТМ, вовлеченных в передачу сигнала с ортостерического сайта к трансдукторным белкам. Установлено, что ауто-GPCR-антитела взаимодействуют с этой петлей в случае различных типов адренергических рецепторов (β₁-AR, β₂-AR, α₁-AR) [499–501], мускариновых ацетилхолиновых рецепторов (mACh₂R, mACh₃R) [502, 503], AT₁-ангиотензинового [504, 505] и 5-HT₄-серотонинового рецепторов [506]. В то же время в ряде случаев во взаимодействии с ауто-GPCR-антителами принимают участие ECL1 и ECL3, как правило, в координации друг с другом или другими внеклеточными сегментами, как это показано для β₁-AR [500], α₁‑AR [507], μ-опиоидного рецептора [508], mACh₃R [503, 509].

В настоящее время имеется большое число свидетельств о вовлеченности ауто-GPCR-антител в этиологию и патогенез различных заболеваний у человека и животных, хотя только в ограниченном числе случаев доказана их ведущая роль в развитии патологических процессов. Это обусловлено как тем, что не всегда ясно, являются ли ауто-GPCR-антитела первопричиной заболеваний или образуются в результате нарушенной иммунотолерантности, так и отсутствием во многих случаях информации о первичной структуре и пространственной организации ауто-GPCR-антител и эпитопах их специфического связывания с GPCR. Может считаться доказанной роль аутоантител к β₂-AR, AT₁‑ангиотензиновому рецептору и mACh₂R (как правило, к их ECL2) в развитии кардиомиопатий и других сердечно-сосудистых патологий, аутоантител к ET_A-эндотелиновому рецептору – в развитии легочной артериальной гипертензии, аутоантител к mACh₃R – в патогенезе синдрома Шегрена, аутоантител к AT₁-ангиотензиновому рецептору – в развитии преэклампсии, аутоантител к MC₄R – в патогенезе ожирения и метаболического синдрома, аутоантител к mGluR1 – в этиологии и патогенезе церебральной атаксии. Общепризнана роль аутоантител к рецептору ТТГ в этиопатогенезе заболеваний щитовидной железы, в том числе аутоиммунного гипертиреоза (болезни Грейвса), карциномы щитовидной железы, аутоиммунного тиреоидита (болезни Хашимото), причем по фармакологическому профилю эти аутоантитела могут относиться к различным группам аллостерических регуляторов.

Некоторые ауто-GPCR-антитела выявлены и у здоровых людей, что предполагает их участие в контроле физиологических и биохимических процессов [510, 511]. Если для значительного числа таких аутоантител их физиологические функции остаются не выясненными, то для аутоантител к β₁- и β₂-AR [512, 513], μ- и δ-опиоидным рецепторам [508, 514, 515], ET_A-эндотелиновому рецептору [510] и хемокиновому рецептору CCR5 [516, 517] показана их специфическая активность, которая в ряде случаев может быть полезной для организма. Так, например, аутоантитела к δ-опиоидному рецептору с агонистической активностью проявляют иммуномодуляторную активность и осуществляют cross-talk между иммунной и нейроэндокринной системами [515]. Стимулирующие аутоантитела к μ-опиоидному рецептору, связываясь с аллостерическим сайтом, включающим проксимальные участки ECL1 и ECL3, мимикрируют эффекты морфина и, наряду с этим, принимают участие в контроле гомеостаза лимфоцитов [508, 514]. Аутоантитела к ET_A-эндотелиновому рецептору проявляют хемотактическую активность, влияя на миграцию нейтрофилов, что свидетельствует об их вовлечении в функционирование иммунной системы [510]. Блокирующие аутоантитела к хемокиновому рецептору CCR5, который является корецептором для вируса иммунодефицита человека 1-го типа (HIV-1) и способствует его проникновению в клетку-мишень, обнаружены как у здоровых, HIV-1-отрицательных, субъектов, так и у пациентов, инфицированных HIV-1, но длительное время не имеющих признаков развития синдрома приобретенного иммунодефицита [516–518]. Защитные свойства этих аутоантител обусловлены их способностью препятствовать активации рецептора CCR5 агонистами, а также их способностью блокировать проникновение вируса в клетку, что препятствует размножению HIV-1 и генерализации вирусной инфекции [516–519]. Аутоантитела к β₁-АР, выявленные у значительной части субъектов без каких-либо признаков сердечно-сосудистой патологии, в отличие от таковых у больных с дилатационной кардиомиопатией не были способны стимулировать β₁-АР, а в ряде случаев имели слабую антагонистическую активность [512]. Эти антитела создают в своем роде регуляторный “буфер”, позволяющий смягчить активирующие воздействия β‑агонистов на адренергическую систему и предотвратить нарушения функций сердечно-сосудистой системы. Такие регуляторные “буферные” системы могут функционировать и для других GPCR-систем, тем самым являясь неотъемлемым компонентом сигнальной трансдукции.

Аутоантитела к GPCR характеризуются предвзятостью внутриклеточного сигналинга, будучи способны селективно активировать определенные типы G-белков и β-аррестинов. Так, при взаимодействии с β₂-AR, которые функционально могут сопрягаться как с G_s-, так и с G_i-белками, оказывающими противоположные влияния на цАМФ-зависимые сигнальные пути, ауто-β₂-AR-антитела способны как стимулировать АЦ, активируя G_s‑белки [501], так и снижать продукцию цАМФ через посредство активации G_i-белков [520]. В обоих случаях они взаимодействуют с эпитопами, локализованными в ECL2. Следует отметить, что ингибирующие АЦ аутоантитела получают от пациентов с тяжелой сердечно-сосудистой патологией. Обработка коклюшным токсином, инактивирующим α-субъединицу G_i-белка, блокирует ингибирующее влияние этих аутоантител на АЦ, что указывает на определяющую роль G_i-белков в этих эффектах [520]. Показано, что одни типы аутоантител к β₁-AR, полученные из крови пациентов с диалатационной кардиомиопатией, способны активировать G-белки, в то время как другие аутоантитела предвзято стимулируют β-аррестиновые каскады, включающие в качестве эффекторных звеньев киназы ERK1/2 [521].

Аутоантитела к 5-HT_2A-серотониновому рецептору, в зависимости от источника получения, были избирательны в отношении различных типов G-белков, функционально сопряженных с этим рецептором [522, 523]. Аутоантитела к этому рецептору, полученные от пожилых пациентов с сахарным диабетом и нефропатией, а также с осложнениями, вызванными ожирением и воспалительными процессами, вызывали активацию G_q/11-белков и PLCβ и приводили к усилению внутриклеточного кальциевого сигналинга [522], в то время как ауто-5-HT_2AR-антитела, полученные от пациентов с шизофренией, стимулировали сигнальные пути, опосредуемые через G_i/o-белки [523]. Аутоантитела к эктодомену CaSR, полученные из крови пациента с синдромом приобретенной гипокальциурической гиперкальциемии, селективно стимулировали сигнальные пути, реализуемые через G_q/11-белки, но не влияли на активность G_i/o-белков, которые также сопряжены с CaSR [524, 525]. Было показано, что аллостерический сайт для изолированных аутоантител с G_q/11-белок-специфичной активностью локализован во внеклеточном домене типа венериной мухоловки (Venus flytrap domain) вблизи Ca²⁺-связывающего сайта. Поскольку мишенью цинакальцета (cinacalcet), PAM для CaSR, является аллостерический сайт, локализованный в трансмембранном тоннеле рецептора, то он эффективно снимает ингибирующее воздействие аутоантител на CaSR и может быть использован для нормализации уровня кальция в крови при аутоиммунных формах гиперкальциемии [525].

Помимо влияния на связывающие характеристики рецепторов и их функциональную активность, ауто-GPCR-антитела могут влиять на перемещение рецепторов между внутриклеточными компартментами [493, 494]. В отличие от ортостерических агонистов и некоторых низкомолекулярных аллостерических модуляторов, ауто-GPCR-антитела, индуцируя интернализацию рецептора, препятствуют его дальнейшей рециклизации, что в конечном итоге приводит к снижению числа рецепторов на поверхности клетки и ослабляет сигнальную трансдукцию. Это показано для аутоантител к хемокиновому рецептору CCR5 и mGlu₅R [519, 526, 527], причем процесс интернализации происходит существенно медленнее, чем при активации рецепторов эндогенными агонистами.

Для изучения функциональной активности и механизмов действия циркулирующих в крови ауто-GPCR-антител и для создания новых аутоантител с целью разработки селективных GPCR-зондов и изучения потенциальной патогенетической роли ауто-GPCR-антител в развитии заболеваний широко применяют синтетические пептиды, соответствующие функционально важным внеклеточным сегментам рецепторов, а также выработанные к ним моноклональные антитела. Этот подход еще в 1990-е годы был успешно использован для получения и дальнейшего исследования аутоантител к β₁-и β₂-AR, играющих ведущую роль в развитии кардиомиопатии и других сердечно-сосудистых патологий. В результате изучения большого числа аутоантител было установлено, что у пациентов с кардиомиопатией и болезнью Чагаса эпитоп, на который вырабатывались ауто-β₁-AR-антитела, включает короткий фрагмент 201–205 ECL2, у пациентов с послеродовой кардиомиопатией – фрагмент 200–210 ECL2, у пациентов с дилатационной кардиомиопатией – взаимоперекрывающиеся фрагменты 183–208, 197–202, 206–212 и 213–218, соответствующие ECL2 и внеклеточному окончанию TM4 [500, 528, 529]. В дальнейшем с помощью циклических пептидов, по первичной структуре и пространственной организации соответствующих ECL2 рецептора, было показано, что ключевым эпитопом для выработки “патогенных” аутоантител к β₁-AR у пациентов с кардиомиопатией, является короткий сегмент 211–214, локализованный в С-концевой части обратно ориентированной α-спирали, образуемой ECL2. При взаимодействии ауто-β₁-AR-антител с этим сегментом происходит нейтрализация отрицательно заряженного остатка Asp²¹², что приводит к стабилизации активной конформации рецептора и опосредует свойства аутоантител, как аллостерических агонистов [530]. В экспериментах с грызунами включающие эти сегменты циклические пептиды, структурно подобные ECL2 β₁-AR, оказывали кардиопротекторный эффект, защищая животных от патогенного воздействия ауто-β₁-AR-антител [530–532].

Нами для изучения функциональной роли меланокортиновых рецепторов в развитии метаболических расстройств и выяснения потенциальных детерминант, мишеней аутоантител, были синтезированы конъюгаты пептидов, соответствующих различным внеклеточным участкам MC₃R и MC₄R. В результате было показано, что многократная, на протяжении года, иммунизация крыс с помощью БСА-конъюгата пептида 11–25, соответствующего внеклеточному N-концевому домену MC₄R, и БСА-конъюгата пептида 269–280, соответствующего ECL3 MC₃R, приводила к значимым метаболическим и гормональным изменениям, характерным для метаболического синдрома [533–535]. Выбор указанных участков основывался на результатах экспериментальных и клинических исследований аутоантител к MC₃R и MC₄R, которые были проведены ранее группой швейцарских ученых под руководством Karl Hofbauer [536–538]. Иммунизация пептидом 11–25 приводила к повышению массы тела и жировой ткани и уровней глюкозы и инсулина в крови, нарушению толерантности к глюкозе, инсулиновой резистентности, отчетливо выраженной дислипидемии [533], а также индуцировала гипотиреоидное состояние [535]. В свою очередь, иммунизация пептидом 269–280 вызывала значительное повышение массы жировой ткани при относительно небольшом изменении общей массы тела, что указывает на жировое перерождение мышечной ткани. У иммунизированных этим пептидом крыс отмечали повышение индекса атерогенности, гиперглицеридемию, инсулиновую резистентность, а также снижение продукции тиреоидных гормонов, что указывает на развитие метаболического синдрома с признаками гипотиреоидного состояния [534].

9.1. Структурно-функциональная организация рецептора ТТГ, механизмы его активации и сигнальные каскады

ТТГ, эндогенный агонист рецептора ТТГ, относится к семейству гликопротеиновых гипофизарных гормонов, к которому также принадлежат гонадотропины. ТТГ и гонадотропины состоят из одинаковой по первичной структуре α-субъединицы, кодируемой одним геном, и структурно различных β-субъединиц, которые, тем самым, определяют тип гормона. В мономерном состоянии β-субъединица (118 АКО) лишена активности и способна взаимодействовать с рецептором ТТГ, только находясь в комплексе с α-субъединицей, включающей 92 АКО, в том числе 10 остатков цистеина, образующих дисульфидные связи. В ходе посттрансляционного процессинга β-субъединица подвергается ограниченному протеолизу, укорачиваясь до 112 АКО, после чего в процессе N-гликозилирования модифицируется отрицательно заряженными N-гликанами по остатку Asn²³ в молекуле β-субъединицы и по остаткам Asn⁵² и Asn⁷⁸ в молекуле α-субъединицы [574].

Рецептор ТТГ, наряду с рецепторами гонадотропинов, релаксина и инсулиноподобного пептида-3, формирует подкласс А10 класса A GPCR или, по другой классификации, относится к группе δ GPCR. Отличительными особенностями рецептора ТТГ являются значительный по размеру эктодомен (около 400 АКО), в котором локализован ортостерический сайт. Эктодомен может быть разделен на субдомен, сформированный 11 повторяющимися участками, обогащенными остатками лейцина (leucine-rich repeats, LRR), и шарнирную область (hinge region), обогащенную цистеином, выполняющую функции спейсера, соединяющего LRR-субдомен с трансмембранным доменом [575]. По аминокислотной последовательности и некоторым структурным особенностям трансмембранный домен рецептора ТТГ близок таковому β₂-AR, хотя при сравнении пространственной структуры трансмембранных доменов этих рецепторов выявляются существенные различия. Наиболее значимое из них обусловлено тем, что в ТМ5 рецептора ТТГ в позиции 5.50 локализован остаток Ala⁵⁹³, в то время как в β₂-AR и в других GPCR класса А в этой позиции расположен остаток пролина, который изгибает ТМ5 и скручивает ее по направлению к ECL2. Замена спиралеразрушающего остатка пролина на аланин в рецепторе ТТГ приводит к стабилизации ТМ5 в α-спиральной конформации и предотвращает излом этого участка [576, 577]. Еще одной структурной особенностью рецептора ТТГ является локализация остатка метионина в положении 637 в ТМ6 (6.48), где в большинстве GPCR располагается остаток триптофана. Замена метионина на триптофан способствует стабилизации конституитивно активированного состояния рецептора ТТГ [578]. Анализ аминокислотных замен показывает, что наиболее важными для функциональной активности являются взаимодействия между ТМ5 и ТМ6 и между ТМ3 и ТМ5, поскольку их нарушение вызывает критические изменения базальной активности рецептора и способствуют его переходу в гиперактивированное состояние, что ассоциировано как с гиперстимуляцией синтеза тиреоидных гормонов, так и с повышением онкогенного потенциала, вызванного неконтролируемой стимуляцией ТТГ-зависимых внутриклеточных каскадов [579].

Эндогенными регуляторами рецептора ТТГ, наряду с самим гормоном, являются специфичные к рецептору ТТГ аутоантитела и тиростимулин, взаимодействующие с LRR-субдоменом и шарнирной областью эктодомена [580, 581]. Определяющую роль в связывании ТТГ и других эндогенных регуляторов играет сульфатированный остаток Tyr³⁸⁵ в С-концевом сегменте шарнирной области [582, 583]. Результатом связывания ТТГ с рецептором являются изменения взаимодействия между С-концевой спиралью LRR-субдомена и сближенными с ней N- и C-концевыми участками шарнирной области [584]. Некоторые аминокислотные остатки LRR-субдомена, например, Ser²⁸¹, локализованный в короткой α-спирали на стыке между LRR-субдоменом и шарнирной областью, могут непосредственно взаимодействовать с ECLs, передавая сигнал на G-белки или β-аррестины без участия шарнирной области [585, 586]. Изменение конформации эктодомена при связывании рецептора ТТГ с гормоном влечет за собой волну конформационных перестроек в трансмембранном домене, что выражается в изменении взаимодействий и углов наклона ТМ3, ТМ5 и ТМ6, причем в этом участвуют как локализованные в этих ТМ гидрофобные АКО (Val^509(3.40), Ala^593(5.50) и Met^637(6.48)), так и гидрофильные остатки, такие как Lys⁶⁶⁰ на границе ТМ6 и ECL3, Asp⁴⁷⁴ на границе ECL1 с ТМ2, Glu⁴⁰⁹ на границе между шарнирной областью и ТМ1, а также Asp⁶³³ (ТМ6) и Asn⁶⁷⁰ (ТМ7), расположенные в центральной части трансмембранного домена.

Результатом изменения конформации трансмембранного домена является активация различных типов G-белков, сопряженных с рецептором ТТГ, в первую очередь G_s- и G_q/11-белков, опосредующих стимуляцию АЦ и PLCβ, соответственно, а также запуск β-аррестин-опосредуемого сигналинга. Соотношение сигнальных каскадов (предвзятость сигналинга) определяется как изоформами ТТГ, что обусловлено степенью и паттерном N-гликозилирования α- и β-субъединиц гормона, микроокружением рецептора и эндогенными аллостерическими регуляторами (ионы, липиды). При этом расположенные в трансмембранном домене рецептора ТТГ сайты в процессе его активации недоступны для ортостерических лигандов и выполняют функции аллостерических сайтов, не перекрывающихся с внеклеточным ортостерическим сайтом. Соответственно, одной из актуальных задач является создание лигандов этих аллостерических сайтов с различной фармакологической активностью. Это рассматривается как крайне важный подход для регуляции ТТГ-зависимых сигнальных каскадов. В этой связи необходимо отметить, что ТТГ и другие эндогенные регуляторы рецептора ТТГ практически не используются в медицине, что связано с их онкогенным потенциалом и другими побочными эффектами, а также с низкой стабильностью, иммуногенностью и высокой стоимостью [587]. При этом отсутствуют фармакологически релевантные антагонисты и инверсионные агонисты рецептора ТТГ, а также ортостерические лиганды с предвзятой активностью в отношении внутриклеточного сигналинга. Создание таких регуляторов возможно только на основе лигандов аллостерических сайтов, локализованных внутри трансмембранного тоннеля рецептора ТТГ или в его ICLs, по аналогии с соответствующими лигандами других GPCR.

9.2. Регуляторы трансмембранного аллостерического сайта рецептора тиреотропного гормона

Аллостерические агонисты рецептора ТТГ

Первые аллостерические регуляторы рецептора ТТГ были открыты в 2006 г. в ходе изучения тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных Org41841, Org43553 и их аналогов, часть из которых проявили активность аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ [155]. Было показано, что трансмембранные аллостерические сайты в рецепторах ТТГ и ЛГ/ХГЧ, как и их трансмембранные домены, имеют струкутурное сходство. Это имело как позитивный аспект, поскольку облегчало конструирование аллостерических регуляторов рецепторов ТТГ и ЛГ/ХГЧ, но одновременно с этим создало проблему разработки лигандов, селективных по отношению к каждому из этих рецепторов. Решая эту проблему, Gershengorn и соавт. исследовали фармакологическую значимость каждой функциональной группы, присутствующих в соединениях Org41841 и Org43553 и их аналогах. В результате было показано, что метилирование аминогруппы, связанной с тиено[2,3-d]-пиримидиновым остовом, лишает такое производное способности активировать рецептор ТТГ, что было обусловлено нарушением взаимодействия с функционально важным для активности рецептора остатком Glu(3.37) [588]. При изучении трет-бутиламидной группы, присоединенной к тиенопиримидиновому остову, было установлено, что метилирование амидного азота не влияет на способность такого производного активировать рецептор ЛГ/ХГЧ, но лишает его способности стимулировать рецептор ТТГ, в то время как замена в этой группе азота на кислород слабо влияет на агонистическую активность в отношении рецептора ТТГ, хотя полностью лишает его способности активировать рецептор ЛГ/ХГЧ [155].

Значительный прогресс в разработке низкомолекулярных агонистов рецептора ТТГ был достигнут после построения модели его трансмембранного аллостерического сайта [588], которая впоследствии была усовершенствована [589–592]. Этот сайт образован АКО, локализованными в ТМ3, ТМ4, ТМ5, ТМ6 и ТМ7, а внешний вход в него формируют сегменты ECL2. Следует, однако, отметить, что в трансмембранном домене рецептора ТТГ может быть не один, а два или более аллостерических сайтов, что хорошо соответствует парадигме множественности трансмембранных аллостерических сайтов в GPCR класса А [116] и в целом согласуется с данными Rauf Latif и соавторов о существовании, по крайней мере, еще одного сайта, образуемого ТМ1, ТМ2, ТМ3 и ТМ7 и сегментами внеклеточных петель рецептора ТТГ [592, 593].

В отличие от рецептора ЛГ/ХГЧ, вход в трансмембранный аллостерический сайт в рецепторе ТТГ более узкий и включает гидрофобные АКО, расположенные в интерфейсах TM4/ECL2, ECL2/TM5 и TM6/ECL3. С помощью молекулярного докинга было показано, что определяющую роль в агонистической активности низкомолекулярных соединений играет остаток Met^637(6.48), который в большинстве других рецепторов, родственных рецептору ТТГ, заменен на остаток триптофана. Так полный агонист Org41841 меньше по размеру, чем наделенное антагонистической активностью соединение c52, и потому после проникновения в трансмембранный аллостерический сайт рецептора ТТГ соединение Org41841 способно более эффективно взаимодействовать с Met⁶³⁷. В свою очередь, соединение c52 с помощью своего длинного бокового заместителя в ароматическом кольце цепляется за остаток Tyr⁶⁶⁷, локализованный в ТМ7, и тем самым не может достичь остатка Met⁶³⁷, результатом чего является стабилизация неактивной конформации рецептора ТТГ [589].

Основываясь на результатах исследования пространственной организации трансмембранного аллостерического сайта, в 2009–2011-х гг. была разработана серия низкомолекулярных полных агонистов рецептора ТТГ, наибольшей активностью среди которых характеризовались соединения NCGC00168126–01 и NCGC00165237–01, производные 5-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиназолина [594–596] (табл. 3). В культурах клеток с экспрессированным в них рецептором ТТГ эти соединения повышали уровень цАМФ со значениями EC₅₀ 660 и 40 нМ, соответственно, по эффективности были сопоставимы с ТТГ и практически не влияли на активацию АЦ гонадотропинами в клетках с экспрессированным в них рецептором ЛГ/ХГЧ [594, 595]. Оба соединения взаимодействовали с трансмембранным аллостерическим сайтом и не связывались с эктодоменом рецептора ТТГ, поскольку в клетках с экспрессированным мутантным рецептором, лишенным эктодомена, их максимальный стимулирующий АЦ эффект сохранялся, хотя значения EC₅₀ заметно повышались. В то же время, замена локализованного в ТМ5 остатка Asn^(5.47), образующего водородную связь с гидроксилами 5-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиназолинов, на аланин полностью блокировала стимулирующий эффект NCGC00165237–01 на активность АЦ. Интересно отметить, что стимулирующий эффект ТТГ на уровень цАМФ внутри клетки при этом сохранялся. Тем самым АКО, формирующие трансмембранный аллостерический сайт рецептора ТТГ, критичны для его активации низкомолекулярными агонистами, но слабо или вовсе не влияют на его активацию ТТГ, который связывается с внеклеточным ортостерическим сайтом [594].

Соединение NCGC00165237–01 (30 мкМ) при 24-часовой инкубации с тироцитами человека повышало экспрессию тиреоглобулина сходно с тем, как это происходило при обработке клеток с помощью ТТГ. Оно также повышало экспрессию генов, кодирующих тиреопероксидазу, Na⁺/I^--симпортер и D2-дейодиназу, вовлеченные в синтез и конверсию тиреоидных гормонов – тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3), причем в случае D2-дейодиназы повышалась не только экспрессия гена, но и активность фермента, что ускоряло превращение Т4 в Т3 [594]. При внутрибрюшинном и пероральном введении мышам соединение NCGC00165237–01 значительно повышало уровень T4 в крови, а также увеличивало поглощение радиоактивного йода тироцитами щитовидной железы у крыс, что обусловлено стимуляцией экспрессии генов тиреоидогенеза [594]. В этой связи необходимо отметить, что в настоящее время для диагностики метастаз и рецидивов рака щитовидной железы у пациентов используют стимуляцию поглощения ¹³¹I с помощью рекомбинантного ТТГ человека [611]. Однако из-за сравнительно низкой аффинности связывания рекомбинантного ТТГ с рецептором требуются высокие дозы этого дорогостоящего препарата, его введение возможно только парентерально и ограничено значимыми побочными эффектами. В связи с этим низкомолекулярные аллостерические агонисты, в том числе с учетом возможности их перорального введения, могут стать хорошей альтернативой рекомбинантному ТТГ, как стимуляторы поглощения радиоактивного йода [612].

Аллостерические агонисты способны активировать мутантные формы рецептора ТТГ, которые имеют замены функционально важных аминокислот во внеклеточном ортостерическом сайте и потому нечувствительны к ТТГ [597]. Так, низкомолекулярный агонист C2 стимулировал АЦ и повышал уровень цАМФ в клетках с экспрессированными в них мутантными формами рецептора ТТГ, имеющих замены локализованных в эктодомене остатков Cys⁴¹ или Leu²⁵² на серин и пролин, соответственно, в то время как ТТГ в этом случае был неактивен. Напротив, замена остатка Leu⁴⁶⁷ на пролин в трансмембранном аллостерическом сайте блокировала стимулирующее влияние соединения C2 на активность АЦ, хотя при этом слабо влияла на соответствующий эффект ТТГ [597]. Эти данные указывают на то, что аллостерические агонисты могут быть эффективны при субклиническом гипотиреозе, причиной которого часто является резистентность тироцитов к ТТГ вследствие инактивирующих мутаций в эктодомене рецептора ТТГ.

Исследование избирательности аллостерических агонистов рецептора ТТГ позволило выявить соединения, которые либо активировали G_s-белки, стимулируя АЦ, повышая уровень цАМФ в клетке-мишени и активируя протеинкиназу А, как это показано для соединения MS438, либо активировали G_q/11-белки, повышая активность PLСβ и ее нижележащего эффектора – протеинкиназы С, как это продемонстрировано для соединения MSq1 [592, 593]. Для соединения MSq1 показано, что в отличие от активаторов G_s-белков оно не влияет на цАМФ-зависимые сигнальные пути и на опосредуемую через них экспрессию генов тиреоидогенеза, но при этом повышает фосфорилирование протеинкиназы С и модулирует пролиферативную активность тироцитов [593]. При этом выявлены аналоги указанных соединений, способные в одинаковой степени стимулировать различные типы сопряженных с рецептором ТТГ G-белков (G_s, G_q/11, G_12/13) и зависимых от них внутриклеточных путей [592]. В случае предвзятого сигналинга показано различие в паттерне АКО, локализованных в трансмембранном домене и критически важных для взаимодействия с низкомолекулярными агонистами, что косвенно указывает на наличие в трансмембранном тоннеле более чем одного аллостерического сайта.

Нами разработан и исследован in vitro и in vivo аллостерический агонист рецептора ТТГ – 5-амино-4-(4-(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)фенил)-N-(трет-бутил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]-пиримидин-6-карбоксамид (TPY3m) [598] (табл. 3). При инкубации с культивируемыми FRTL-5-тироцитами соединение TPY3m стимулировало экспрессию гена Na⁺/I^--симпортера. При внутрибрюшинном введении крысам оно повышало уровень Т4 в крови, а в ткани щитовидной железы усиливало экспрессию генов тиреопероксидазы и D2-дейодиназы, ключевых ферментов синтеза Т4 и его конверсии в Т3. При совместном введении с ТТГ (in vitro, клетки FRTL-5) или тиролиберином (in vivo, щитовидная железа крыс) соединение TPY3m предотвращало вызываемое ими снижение экспрессии рецептора ТТГ, что может быть одним из механизмов TPY3m-опосредуемого потенцирования эффектов ТТГ (in vitro) и тиролиберина (in vivo) на продукцию Т4 и Т3. Соединение TPY3m не оказывало влияния на уровень тестостерона и экспрессию генов тестикулярного стероидогенеза при введении самцам крыс, что свидетельствует в пользу его специфичности в отношении рецептора ТТГ. Тем самым TPY3m является прототипом препарата для коррекции функций щитовидной железы при субклиническом гипотиреозе, в том числе, обусловленном резистентностью к ТТГ [598].

Позитивные аллостерические модуляторы рецептора тиреотропного гормона

Помимо функционирования в качестве тиреоидогенного гормона, действующего на фолликулярные клетки щитовидной железы, ТТГ также влияет на ряд других тканей, в первую очередь, на формирование костной ткани и ремоделирование скелета, вследствие чего ослабление сигнальных путей ТТГ самым непосредственным образом сказывается на физиологическом состоянии опорно-двигательного аппарата. В условиях дефицита ТТГ или снижения функциональной активности его рецептора нарушается остеобластогенез, индуцируются дефекты формирования костной ткани, происходит ее потеря, что, в конечном итоге, ведет к остеопорозу [613]. Терапия рекомбинантным ТТГ препятствует этим процессам, но длительное введение препарата, даже в сравнительно низких дозах, может вызвать нарушения тиреоидной функции и повышает риск развития ТТГ-зависимых опухолей, как тиреоидной, так и нетиреоидной локализации [614]. Применение аллостерических полных агонистов рецептора ТТГ в этом случае предпочтительнее, поскольку они действуют на ТТГ-регулируемые внутриклеточные каскады не столь интенсивно, как ТТГ, но риски и в этом случае сохраняются. Одним из путей решения проблемы является разработка низкомолекулярных PAM для рецептора ТТГ, которые сами не способны активировать рецептор ТТГ, но в небольшой степени повышают эффекты гормона, что позволяет функционально компенсировать физиологическое снижение уровня ТТГ в крови.

Стимулирующее влияние ТТГ на остеобласты реализуется через путь, включающий рецептор ТТГ и β1-аррестин, активация которого приводит к стимуляции экспрессии специфичных для остео-бластов генов, в том числе кодирующих остеопонтин и щелочную фосфатазу [615, 616]. Тем самым PAM рецептора ТТГ, предназначенные для предотвращения остеопороза, должны иметь предвзятую активность в отношении β-аррестиновых каскадов. В результате скрининга большого числа потенциальных кандидатов было идентифицировано соединение NCGC00379308, производное 2-(1-пиперазинил)-4-хиназолинамина, которое повышало взаимодействие рецептора ТТГ с β1-аррестином, слабо влияя на активность G_s- и G_q/11-белков, причем по эффективности усиления транслокации β1-аррестина к рецептору оно в 5 раз превосходило ТТГ [601] (табл. 3). Соединение NCGC00379308 практически не влияло на экспрессию генов остеопонтина и щелочной фосфатазы, но в значительной степени усиливало ее ТТГ-индуцированную стимуляцию. При сочетанном воздействии ТТГ с NCGC00379308 экспрессия генов остеопонтина и щелочной фосфатазы повышалась в 5.5 и 1.6 раза соответственно. Наряду с этим при инкубации проостеобласт-подобных клеток с соединением NCGC00379308 отмечали потенцирование стимулирующего эффекта ТТГ на секрецию белка остеопонтина, контролирующего процесс остеобластогенеза. Тем самым соединение NCGC00379308 по своему фармакологическому профилю может быть отнесено к PAM для рецептора ТТГ с предвзятым действием в отношении активации β-аррестиновых каскадов [601].

Аллостерические низкомолекулярные антагонисты и инверсионные агонисты рецептора тиреотропного гормона

Необходимость создания лигандов рецептора ТТГ с антагонистической активностью обусловлена широким распространением аутоиммунного гипертиреоза (болезни Грейвса), первопричиной которой являются стимулирующие рецептор ТТГ аутоантитела, вызывающие гиперпродукцию тиреоидных гормонов. Это приводит к тяжелым осложнениям, наиболее грозным из которых является офтальмопатия, а также к нарушению функционирования всех звеньев гипоталамо-гипофизарной оси. Следует отметить, что все используемые для лечения гипертиреоза фармакологические подходы, в том числе применение блокирующих антител к рецептору ТТГ, имеют серьезные ограничения, поскольку направлены на коррекцию последствий гиперактивации рецептора ТТГ, а не на нормализацию его функциональной активности [617–619].

Первый нейтральный антагонист рецептора ТТГ, NIDDK/CEB-52, был разработан в 2008 г. [602] (табл. 3). Наличие в пара-положении фенильного кольца метоксипропиленовой группы приводило к повышению его гидрофобности и, тем самым, облегчало проникновение в аллостерический сайт рецептора. При инкубации с клетками, экспрессирующими рецептор ТТГ, соединение NIDDK/CEB-52 (30 мкМ) ингибировало стимулирующие эффекты ТТГ и активирующих аутоантител на активность АЦ, а также в значительной степени снижало ТТГ-стимулированную экспрессию гена тиреопероксидазы [602]. Однако соединение NIDDK/CEB-52, хотя и в незначительной степени, но влияло на активность рецептора ЛГ/ХГЧ, действуя, как его инверсионный агонист, что препятствовало его внедрению в клинику [602].

В ходе дальнейшего поиска нейтральных антагонистов рецептора ТТГ, не обладающих биологической активностью по отношению к рецептору ЛГ/ХГЧ, были разработаны производные 4‑оксо‑1,2-дигидрохиназолина, NCGC00242595 и NCGC00242364 [603, 604] (табл. 3). В культуре орбитальных фибробластов они ингибировали активацию АЦ как ТТГ, так и стимулирующими рецептор ТТГ антителами и подавляли индуцированную антителами продукцию гиалуроновой кислоты. Оба соединения не оказывали влияния на базальную активность рецептора и базальный уровень продукции гиалуроновой кислоты, а также на активность рецептора ЛГ/ХГЧ [603, 604]. При обработке с помощью NCGC00242364 мышей, которые в течение трех дней получали низкие дозы тиролиберина, рилизинг-фактора ТТГ, уровень T4 в крови животных снижался на 44%, а экспрессия генов, кодирующих Na⁺/I^--симпортер и тиреопероксидазу, снижалась на 75 и 83% соответственно. Обработка соединением NCGC00242364 была эффективной и в отношении ингибирования стимулирующего эффекта антител на уровень T4 и экспрессию генов Na⁺/I^--симпортера и тиреопероксидазы. Тем самым соединения NCGC00242595 и NCGC00242364 могут быть эффективны при лечении болезни Грейвса и офтальмопатии Грейвса, не вызывая гипотиреоидных состояний [595, 604, 620, 621].

Нами на основе структуры тиено[2,3-d]-пиримидина разработано соединение 5-амино-N‑(трет-бутил)-4-(4-(3-метоксипроп-1-ин-1-ил)фенил)-2-(метиотио)тиено-[2,3-d]-пиримидин-6-карбоксамид (TPY1), которое предотвращало ТТГ-индуцированную стимуляцию экспрессии генов тиреопероксидазы и тиреоглобулина в FRTL-5-клетках, а при внутрибрюшинном введении крысам подавляло стимуляцию тиролиберином как продукции Т4 и Т3 в крови, так и экспрессии генов, кодирующих белки, вовлеченные в синтез и конверсию тиреоидных гормонов в тироцитах щитовидной железы [605] (табл. 3). При однократном воздействии соединение TPY1 не влияло на базовый уровень тиреоидных гормонов, но в небольшой степени снижало его при длительном введении. Тем самым TPY1 может рассматриваться как перспективный препарат для коррекции аутоиммунного гипертиреоза.

Не в меньшей степени, чем нейтральные антагонисты, в медицине востребованы и низкомолекулярные соединения с активностью инверсионных агонистов рецептора ТТГ. При лечении болезни Грейвса их применение может привести к гипотиреозу вследствие подавления базальной активности рецептора ТТГ, хотя риски этого весьма невелики. В то же время инверсионные агонисты могут иметь широкое применение для лечения неаутоиммунных гипертиреоидных состояний, вызванных активирующими мутациями в рецепторе ТТГ, индуцирующими развитие опухолей щитовидной железы и нетиреоидных тканей. Для лечения таких заболеваний в настоящее время используют в основном хирургические подходы и радиотерапию, что приводит к множеству побочных эффектов [622].

Первый инверсионный агонист рецептора ТТГ, производное 2,3-дигидрохиназолин-4-она NCGC00161856, был разработан в 2010 г. [607] (табл. 3). Это соединение подавляло не только стимулированную ТТГ, но и базальную активность рецептора. В дальнейшем, на основе структуры NCGC00161856 был разработан более эффективный аналог NCGC00229600, который снижал стимулирующий АЦ эффект антител в культуре тироцитов человека и соответствующий эффект ТТГ и антител в первичной культуре фибробластов, полученных из ретроорбитальной области пациентов с болезнью Грейвса [608, 609]. Способность соединений NCGC00161856 и NCGC00229600 подавлять активацию рецептора ТТГ стимулирующими антителами в ретроорбитальных фибробластах позволяет устранить первопричину офтальмопатии Грейвса, обусловленную гиперстимуляцией цАМФ-сигнальных путей в этих клетках [619, 623].

Нами разработано галоген-содержащее производное тиено[2,3-d]-пиримидина, соединение TP48 (5-амино-N-(трет-бутил)-4-(4-иодфенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]-пиримидин-6-карбоксамид), с активностью инверсионного агониста (табл. 3). Оно не только ингибировало стимулированную тиролиберином продукцию Т4 и Т3 при внутрибрюшинном введении крысам, но в небольшой степени снижало базовые уровни тиреоидных гормонов [605, 610]. Важно, что соединение TP48 сохраняло свой фармакологический профиль при пероральном введении, что свидетельствует в пользу его стабильности и хорошей всасываемости в желудочно-кишечном тракте.

В 2019 г. Marcinkowski и соавт. создали аллостерический регулятор рецептора ТТГ на основе гетероциклического соединения S37a, которое содержало семь центров хиральности, причем функционально активным был только один из изомеров, который проявлял свойства антагониста и NAM [591, 606] (табл. 3). В микромолярных концентрациях соединение S37a ингибировало АЦ, стимулированную как ТТГ и антителами к рецептору ТТГ (стимулирующие моноклональные антитела TSAb M22 человека, олигоклональные антитела TSAb, полученные от пациентов с болезнью Грейвса), так и низкомолекулярным аллостерическим агонистом C2. При пероральном введении мышам соединение S37a имело высокую биодоступность и не оказывало на организм животных токсических эффектов [606].

Таким образом, в настоящее время создана обширная линейка аллостерических регуляторов рецептора ТТГ с различным профилем фармакологической активности (полные и инверсионные агонисты, нейтральные антагонисты, PAM), которые могут быть применены для коррекции тиреоидной патологии, обусловленной изменением сигнальной трансдукции через рецептор ТТГ [612, 621, 624]. Следующим этапом является выбор наиболее перспективных кандидатов для проведения клинических испытаний и внедрения препаратов в клинику.

9.3. Регуляторы внутриклеточного аллостерического сайта рецептора тиреотропного гормона

Помимо трансмембранной локализации аллостерических сайтов, в молекуле рецептора ТТГ они могут быть локализованы во внутриклеточном вестибюле и в проксимальных к мембране участках ICLs, которые ответственны за взаимодействие с G-белками и β-аррестинами. Как отмечалось выше, одними из регуляторов таких сайтов могут быть пептиды, по первичной структуре соответствующие внутриклеточным участкам, либо образующим такие внутриклеточные аллостерические сайты, либо контактирующим с ними. Поскольку таким GPCR-пептидам для взаимодействия необходимо преодолеть плазматическую мембрану, они должны быть модифицированы гидрофобными группами, обеспечивающими их транспорт через мембрану, или образовывать амфипатические поликатионные спирали. Наибольшая эффективность показана для производных пептидов, модифицированных остатками длинноцепочечных жирных кислот – пальмитатом или миристатом. Подобные липидированные GPCR-пептиды называют пепдуцинами, и в настоящее время имеется много исследований, демонстрирующих их высокую активность в отношении различных классов GPCR [153, 625–628]. Нами разработаны пепдуцины, которые продемонстрировали высокую активность для релаксинового рецептора 1-го типа и 5‑HT_1B-серотонинового рецептора [629–631].

Эта стратегия была успешно применена и для разработки аллостерического агониста рецептора ТТГ на основе пептидов, соответствующих его ICL3, в которой локализованы основные молекулярные детерминанты для активации G_s-белка [599, 600]. Наиболее эффективным оказался модифицированный с C-конца пальмитатом пепдуцин 612–627(Palm), структурно соответствующий С‑концевому участку 612–627 ICL3 рецептора ТТГ (табл. 3). В мембранах, выделенных из тироцитов щитовидной железы крыс, пепдуцин 612–627(Palm) дозозависимо стимулировал активность чувствительной к ТТГ аденилатциклазной сигнальной системы. Его действие было специфичным по отношению к рецептору ТТГ и не выявлялось в мембранах, где этот рецептор отсутствовал. Пальмитоилированный аналог в значительной степени превосходил по эффективности и селективности пептид 612–627, не содержащий пальмитата, а также более короткие аналоги, в том числе липидированные [599]. В экспериментах in vivo было показано, что при интраназальном введении крысам пепдуцин 612–627(Palm) стимулировал продукцию тиреоидных гормонов, причем в дозе 450 мкг/кг его максимальный стимулирующий эффект на уровень свободного T4 достигался через 2 ч [600]. Значения ED₅₀ для стимуляции пепдуцином 612–627(Palm) продукции свободного T4 и общего T3 составили 87 и 78 мкг/кг соответственно. Необходимо отметить, что внутримышечное введение было менее эффективным, чем интраназальное [600]. Тем самым пепдуцин 612–627(Palm) наделен активностью внутриклеточного аллостерического агониста рецептора ТТГ и может быть использован для разработки стимуляторов тиреоидогенеза, но с условием повышения его устойчивости к протеолизу в кровотоке.

На рис. 2 суммированы полученные в настоящее время данные по аллостерической регуляции рецептора ТТГ, осуществляемой различными по химической природе и механизмам действия соединениями, включая аутоантитела к рецептору ТТГ. Множественность аллостерических сайтов в молекуле рецептора ТТГ обусловливает многоуровневую и многофакторную регуляцию его активности, как в базальном состоянии, так и в условиях активации ТТГ или стимулирующими аутоантителами.

Представлены блокирующие (ингибирующие) и стимулирующие аутоантитела к рецептору ТТГ, действующие на различные участки эктодомена, спейсерный субдомен, связывающий эктодомен с трансмембранным доменом, а также на ECLs рецептора. Приведены разработанные в настоящее время синтетические аллостерические регуляторы рецептора ТТГ с активностью полных или частичных агонистов, в том числе пептидной природы (пепдуцин 612–627), PAM, нейтральных антагонистов, инверсионных агонистов, а также соединений со смешанным профилем фармакологической активности (антагонист/NAM). В трансмембранном домене рецептора ТТГ показаны основные локусы, AS-1, AS-2 и AS-3, являющиеся мишенями для аллостерических регуляторов, причем в каждом локусе может быть локализовано несколько топологически различающихся аллостерических сайтов, а в случае локуса AS-2 такие сайты могут быть расположены как внутри трансмембранного канала (предпочтительная локализация), так и снаружи его, на границе трансмембранного домена с липидной фазой мембраны. Подробности см. в табл. 3 и в соответствующих подразделах раздела IX.

10.1. Структурно-функциональная организация рецептора ЛГ/ХГЧ, механизмы его активации и сигнальные каскады

Как отмечалось выше, рецептор ЛГ/ХГЧ, как и рецептор ТТГ, включен в подкласс А10 класса A GPCR и имеет значительное структурное сходство с рецептором ТТГ, особенно в области трансмембранного домена и проксимальных к мембране участков ICL3, где локализованы трансмембранные и внутриклеточные аллостерические сайты. Все это свидетельствует в пользу сходства механизмов аллостерической регуляции рецепторов ЛГ/ХГЧ и ТТГ, в том числе внутриклеточными аллостерическими регуляторами. Эктодомен рецептора ЛГ/ХГЧ включает обогащенный остатками цистеина N-концевой участок, значительный по размеру субдомен, включающий обогащенные остатками лейцина повторы (leucine-rich repeats, LRR), и спейсерный участок, соединяющий LRR-субдомен с ТМ1 [632–634]. В эктодомене локализован высокоаффинный ортостерический сайт, с которым специфично связываются αβ-гетеродимеры ЛГ и ХГЧ. Результатом такого связывания является активация сразу нескольких сигнальных каскадов, что обусловлено способностью лиганд-связанного рецептора взаимодействовать с различными типами G-белков, в первую очередь с G_s- и G_q/11-белками, а также с β-аррестинами и адаптерными белками APPL-семейства [632, 635]. Сигнальные пути, направленные на повышение уровня цАМФ (через G_s-белки) и ионов кальция (через G_q/11-белки) внутри клетки-мишени и на активацию MAPKs (через β-аррестины), вовлечены в регуляцию синтеза и секреции стероидных гормонов, в контроль роста и дифференцировки тестикулярных и овариальных клеток. При этом β-аррестиновые пути также играют определяющую роль в интернализации, эндоцитозе и рециклизации лиганд-рецепторных комплексов и определяют, тем самым, чувствительность тканей-мишеней к ЛГ и ХГЧ [635].

При активации рецептора ЛГ/ХГЧ гонадотропином запускается волна конформационных перестроек, в которую вовлечены следующие молекулярные детерминанты: высококонсервативный в GPCR класса А ERW-мотив, который локализован на границе ТМ3 и ICL2, заряженные остатки Arg⁴⁶⁴ и Asp⁵⁶⁴, расположенные во внутриклеточных окончаниях TM3 и ТМ6, остатки Asp⁵⁷⁸ (ТМ6) и Asn⁶¹⁵ (ТМ7), локализованные внутри трансмембранного домена. Идентифицированы формы рецептора с активирующими мутациями, которые локализованы преимущественно в трансмембранном домене (ТМ1, ТМ2, ТМ3, ТМ5 и ТМ6), а также формы рецептора с инактивирующими мутациями, локализованными в эктодомене, трансмембранном домене (ТМ1, ТМ4, ТМ5, ТМ6 и ТМ7) и во внеклеточных участках (ICL1, ICL3) [636–638]. Многие репродуктивные дисфункции обусловлены как мутациями в рецепторе ЛГ/ХГЧ, так и нарушением его посттрансляционного процессинга, внутриклеточного транспорта и транслокации в плазматическую мембрану [639].

Большое значение для обеспечения избирательности передачи сигнала к внутриклеточным рецепторам имеет микрооокружение рецептора, в том числе доступность определенных типов G-белков и β-аррестинов, статус N-гликозилирования гонадотропинов, образование и структура рецепторных комплексов, а также паттерн N-гликозилирования рецептора ЛГ/ХГЧ. Известно, что димерные молекулы ЛГ и ХГЧ имеют по три сайта для N-гликозилирования – по два в α-субъединице и по одному в β-субъединице. α-Субъединица, как правило, гликозилирована полностью, в то время как β-субъединица может быть негликозилирована, что в сумме дает две формы ЛГ и ХГЧ – с двумя или тремя N-гликанами. Наряду с этим в зависимости от места синтеза и ряда других факторов существенно отличаются разветвленность и заряд N-гликанов, определяемые паттерном и активностью ферментов N-гликозилирования [640–642]. Так, синтезируемые в аденогипофизе ЛГ и гипофизарная форма ХГЧ имеют более кислые N-гликаны, что обусловлено высоким содержанием в них сульфатированного N-ацетилгалактозамина, в то время как плацентарная форма ХГЧ вместо сульфатированного N-ацетилгалактозамина содержит сиаловые кислоты, что делает ее менее кислой. Важно отметить, что слабогликозилированные формы ЛГ с меньшими по размеру N-гликанами более активны, поскольку с большей аффинностью и эффективностью связываются с рецепторами ЛГ/ХГЧ. Показано, например, что доля таких форм ЛГ резко возрастает в короткую фазу индукции овуляции, в то время как в фолликулярную и лютеиновую фазы превалируют более гликозилированные формы гонадотропинов [642].

Среди рецепторов ЛГ/ХГЧ выделяют негликозилированные и гликозилированные мономерные формы с молекулярным весом соответственно 67 и 84 кДа, а также ди- и олигомерные формы с молекулярным весом 166 и 240 кДа [643]. Показано, что связывание гонадотропина с рецептором ЛГ/ХГЧ приводит к увеличению доли ди- и олигомерных форм, что указывает на повышение стабильности рецепторных комплексов в присутствии ортостерического агониста [644, 645]. Формирование рецепторных комплексов важно для полноценной активации рецептора гонадотропином, поскольку показано, что связывание молекулы ЛГ или ХГЧ с одним протомером рецепторного комплекса приводит к активации другого протомера, и это явление описывается как трансактивация рецептора ЛГ/ХГЧ [646, 647]. Одним из прямых доказательств механизма трансактивации рецептора ЛГ/ХГЧ является то, что коэкспрессия изоформ рецептора, одна из которых не может связывать гормон, а другая не способна передавать гормональный сигнал, приводит к олигомерному рецепторному комплексу, который способен как опознавать ЛГ-сигнал, так и осуществлять его трансдукцию к внутриклеточным мишеням [648].

Крайне интересным является обнаружение гетеродимерных и гетероолигомерных комплексов между рецептором ЛГ/ХГЧ и рецептором ФСГ с последующей их трансактивацией любым из гонадотропинов [649–653]. При активации таких гетеродимерных комплексов с помощью ЛГ или ФСГ отмечают резкое снижение эффективности сигналов, передаваемых через G_s-белки на АЦ, что указывает на взаимные аллостерические влияния протомеров рецепторов ЛГ/ХГЧ и ФСГ в таком комплексе [649]. Кроме того, даже небольшая доля таких гетерокомплексов в общем пуле рецепторов ЛГ/ХГЧ и ФСГ существенно влияет на процессы атрезии фолликулов, развитие доминантного фолликула, а также обеспечивает продукцию андрогенов в отсутствие достаточного количества ЛГ [653].

Образование рецепторных комплексов, в том числе гетеродимерных, гликозилирование и другие посттрансляционные модификации рецептора ЛГ/ХГЧ являются аллостерическими механизмами, которые вносят значимый вклад в модуляцию сигналов, индуцируемых гонадотропинами, а также опосредуют избирательную активацию определенных внутриклеточных каскадов, тем самым программируя адекватный для определенных физиологических условий клеточный ответ. Однако существуют и другие аллостерические механизмы, влияющие на эффективность и предвзятость ЛГ/ХГЧ-сигналинга. Это обусловлено присутствием в молекуле рецептора различных по локализации аллостерических сайтов, в том числе в трансмембранном домене и в области интерфейсов, включающих сегменты внутриклеточного вестибюля трансмембранного тоннеля и проксимальные участки ICLs рецептора. Синтетические аллостерические регуляторы этих сайтов будут рассмотрены ниже.

Аллостерические влияния на рецептор ЛГ/ХГЧ могут оказывать аутоантитела, вырабатываемые на его внеклеточные участки. Недавно в крови женщин с поликистозными яичниками и гиперандрогенемией были обнаружены стимулирующие аутоантитела к рецептору ЛГ/ХГЧ [654]. В связи с этим необходимо отметить, что у женщин с яичниковой недостаточностью обнаружены ингибирующие аутоантитела к рецептору ФСГ [655, 656]. Поскольку рецепторы ЛГ/ХГЧ и ФСГ могут гетеродимеризоваться, то аутоантитела к рецептору ФСГ, как и аутоантитела к рецептору ЛГ/ХГЧ, являются потенциальными аллостерическими модуляторами ЛГ/ХГЧ-сигналинга. Нельзя исключить того, что, как и в случае аутоантител к β-AR, антитела к рецептору ЛГ/ХГЧ могут создавать “регуляторный буфер”, позволяющий модулировать мощные активационные сигналы, вызываемые значительными перепадами уровня гонадотропинов в ходе репродуктивных циклов. Этот вопрос крайне интересен и требует дополнительного изучения.

10.2. Регуляторы трансмембранного аллостерического сайта рецептора ЛГ/ХГЧ

Необходимость разработки аллостерических регуляторов рецептора ЛГ/ХГЧ обусловлена следующими обстоятельствами, важными с точки зрения лечения репродуктивных расстройств и при использовании гонадотропинов во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). Применяемые в настоящее время гонадотропины с ЛГ-активностью либо выделяют из природных источников (мочевые формы ХГЧ), либо синтезируют с помощью генно-инженерных технологий (рекомбинантные формы ЛГ и ХГЧ). У обеих форм гонадотропинов, природных и рекомбинантных, имеются существенные недостатки. Мочевой ХГЧ содержит ряд биологически активных примесей, а его препараты от партии к партии сильно варьируют по специфической активности, что затрудняет их стандартизацию. Кроме того, мочевой ХГЧ, представляющий собой плацентарную форму гормона, имеет отличный от ЛГ и гипофизарного ХГЧ спектр биологической активности, включая предвзятость активации внутриклеточных сигнальных путей. Рекомбинантные формы, в свою очередь, также не лишены примесей, но при этом, что еще более существенно, значимо отличаются от природных форм по паттерну N-гликозилирования, что, как отмечалось выше, влияет на активацию ими рецептора ЛГ/ХГЧ и на предвзятость сигнальной трансдукции. В связи с этим в настоящее время применение рекомбинантного ЛГ в ВРТ существенно ограничено. Гонадотропины могут быть использованы только в форме инъекций, требуют надлежащего хранения и способны вызывать иммуногенные реакции. Поскольку аллостерические регуляторы трансмембранного сайта рецептора ЛГ/ХГЧ представляют собой низкомолекулярные соединения, устойчивые в желудочно-кишечном тракте и хорошо всасывающиеся стенками кишечника, то они эффективны при пероральном способе введения. Наряду с этим они хорошо хранятся и не вызывают иммунных реакций. Одним из существенных недостатков ряда их активных аналогов является низкая растворимость в водных растворах, что, однако, не препятствует их высокой биодоступности при различных способах доставки, хотя и требует дополнительных усилий по разработке базирующихся на структуре таких соединений лекарственных форм.

Несмотря на востребованность в основном агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ, в ряде случаев, например, при гонадотропин-зависимых опухолях или для предотвращения преждевременного полового созревания у мальчиков, необходимы антагонисты или инверсионные агонисты этого рецептора. Подобных препаратов, лигандов ортостерического сайта рецептора ЛГ/ХГЧ, в настоящее не разработано, что делает необходимым создание аллостерических регуляторов с активностью антагонистов и инверсионных агонистов на основе низкомолекулярных лигандов.

Аллостерические агонисты и позитивные аллостерические модуляторы рецептора ЛГ/ХГЧ

Первые низкомолекулярные агонисты рецептора ЛГ/ХГЧ были разработаны голландскими учеными в 2002 г. на основе производных тиено[2,3-d]-пиримидина, наиболее активными среди которых были соединение Org41841, N-трет-бутил-5-амино-4-(3-метоксифенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]-пиримидин-6-карбоксамид, и его аналог – Org43553 [154] (табл. 4).

В дальнейшем соединения Org41841 и Org43553 стали прототипами для большого числа других низкомолекулярных соединений с агонистической активностью, включая новые производные тиено[2,3-d]-пиримидина [116, 620, 658, 659, 661–663, 665, 666, 680–682]. Показано, что соединение Org43553 специфично связывается с рецептором ЛГ/ХГЧ (K_d, 2.4 нМ), причем в его присутствии связывание [¹²⁵I]-ХГЧ с рецептором сохраняется, что указывает на несовпадение ортостерического и Org43553-специфичного аллостерического сайтов [657]. В пользу несовпадения этих сайтов свидетельствует отсутствие снижения стимулирующего эффекта ЛГ на активность АЦ и цАМФ-зависимых транскрипционных факторов в клетках, экспрессирующих рецептор ЛГ/ХГЧ, в присутствии Org43553 [158].

Гонадотропины, ЛГ и ХГЧ, через посредство различных G-белков активируют как АЦ, так и PLСβ, повышая внутриклеточную концентрацию ионов кальция, причем для активации PLСβ требуются более высокие концентрации гонадотропинов, чем для активации АЦ [683]. Соединение Org43553 является более селективным по отношению к аденилатциклазному пути, играющему ключевую роль в синтезе и секреции половых стероидных гормонов, практически не влияя на G_q/11-белки, PLСβ и фосфоинозитидный обмен [158]. Только в высоких концентрациях (1–10 мкМ) Org 43553 стимулировал PLСβ на 33–37%, что составляет менее 5% от соответствующего эффекта ЛГ. Соединение Org43553 сравнительно слабо влияло на активность β-аррестинов, на что указывает отсутствие его стимулирующего эффекта на активность MAPKs и эндоцитоз рецепторов ЛГ/ХГЧ. Тем самым Org43553 характеризуется предвзятой активностью по отношению к G_s-белкам и АЦ, что обеспечивает его выраженный стероидогенный эффект как in vitro [158, 658]), так и in vivo при различных путях введения экспериментальным животным и женщинам-добровольцам [658–660]. Необходимо отметить, что разработанные нами тиено[2,3-d]-пиримидиновые производные также избирательно стимулировали аденилатциклазный сигнальный путь [663, 665], что может указывать на присутствие в молекулах тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных фармакофоров, ответственных за стабилизацию активной конформации рецептора, взаимодействующей с G_s-белком. Исследование структуры и локализации аллостерического сайта, с которым связывались Org43553 и его аналоги, показало, что в его формировании принимают участие ориентированные во внутреннюю полость трансмембранного тоннеля АКО, принадлежащие ТМ3, ТМ5 и ТМ6, а также ориентированные во внеклеточный вестибюль этого тоннеля остатки ECL2 и ECL3, формирующие внешний вход в этот сайт [588, 634]. Эти результаты были подтверждены при исследовании взаимоотношений структура–активность и при молекулярном докинге разработанных нами производных тиено[2,3-d]-пиримидина [665, 666].

Пероральное введение Org43553 (50 мг/кг) вызывало овуляцию у неполовозрелых мышей и половозрелых крыс. Полученные яйцеклетки были хорошего качества, характеризовались высокой фертильностью, при имплантации давали жизнеспособные эмбрионы. При введении самцам крыс Org43553 стимулировал у них тестикулярный стероидогенез, повышая уровень тестостерона в крови [658]. Соединение Org43553 при пероральном введении женщинам-добровольцам репродуктивного возраста (в дозе 300 мг) вызывало овуляцию у 83% из них без каких-либо значимых побочных эффектов [660]. Важно, что в этом случае, как и при индукции овуляции у грызунов, не было выявлено признаков развития синдрома гиперстимуляции яичников, что свидетельствует о перспективности этого агониста для индукции овуляции и лечения репродуктивных расстройств у женщин. Это во многом обусловлено более мягкой активацией цАМФ-зависимых сигнальных путей, а также меньшим периодом полувыведения Org43553 в сравнении с ХГЧ, что предотвращает длительную активацию рецептора ЛГ/ХГЧ в клетках-мишенях [658, 660].

Основываясь на фармакологических характеристиках Org43553 и его аналогов, нами была разработана серия тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных, первым из которых было созданное и изученное в 2014 г. соединение 5-амино-N-(трет-бутил)-4-(3-(изоникотинамидо)фенил)-2-(метилтио)тиено [2,3-d]пиримидин-6-карбоксамида (TP01) [661–663] (табл. 4). Среди синтезированных нами соединений наибольшей активностью характеризовались TP03 и TP04, которые были детально изучены в условиях in vitro и in vivo [665, 666] (табл. 4). Они стимулировали активность АЦ в тестикулярных и овариальных мембранах крыс, а также повышали продукцию тестостерона при инкубации с клетками Лейдига, причем их стимулирующие эффекты были частично аддитивны с таковыми ХГЧ. При внутрибрюшинном и пероральном введении самцам крыс они стимулировали тестикулярный стероидогенез, повышая продукцию тестостерона в крови. Это сопровождалось повышением экспрессии ряда стероидогенных генов, в первую очередь холестерин-транспортирующего белка StAR, катализирующего первую, скорость-лимитирующую стадию стероидогенеза. Эффект TP03 и TP04 сохранялся при длительном (5 дней и более) введении, в то время как соответствующие эффекты ХГЧ при этом существенно ослабевали [664–666]. Стабильность стимулирующего эффекта соединений TP03 и TP04 на тестикулярный стероидогенез была во многом обусловлена сохранением экспрессии рецептора ЛГ/ХГЧ в семенниках, которая в значительной степени снижалась при длительной обработке гонадотропинами.

Стероидогенный эффект тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных был отчетливо выражен при введении стареющим животным и самцам крыс с различными моделями сахарного диабета, в то время как стимулирующий эффект ХГЧ на тестикулярный стероидогенез у этих животных снижался [684]. Показано также, что у диабетических животных введение соединений TP03 и TP04 приводило к повышению подвижности эпидидимальных сперматозоидов, нормализовало их число, а также число сперматоцитов в семенных канальцах, восстанавливало толщину герминативного эпителия, что указывает на нормализацию процесса сперматогенеза [665, 666].

Многие побочные эффекты гонадотропинов обусловлены сравнительно высокими их дозами, используемыми в репродуктивной медицине, что сопровождается сначала гиперстимуляцией ЛГ-зависимых сигнальных путей, а впоследствии формированием резистентности клеток-мишеней к эндогенным гонадотропинам. Обнаруженная нами в экспериментах in vitro аддитивность стимулирующих эффектов ХГЧ и тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных, являющаяся следствием различной локализации сайтов их связывания с молекулой рецептора, позволила высказать гипотезу, что низкомолекулярные агонисты способны повышать эффективность низких доз гонадотропинов при их комбинированном использовании. Действительно, при совместном воздействии сравнительно низких доз TP03 (15 мг/кг) и ХГЧ (10 МЕ/крысу) отмечали потенцирование стимулирующего эффекта гонадотропина на продукцию тестостерона и экспрессию ключевых стероидогенных генов (StAR, Cyp11a1) [685]. Потенцирующее действие TP03 было продемонстрировано у самцов крыс с различными моделями сахарного диабета 1-го и 2-го типов и было выражено сильнее, чем у недиабетических животных. Тем самым показана перспективность комбинированной терапии тиено[2,3-d]-пиримидинами и гонадотропинами при компенсации андрогенного дефицита, вызванного метаболическими расстройствами [685, 686].

Нами показано, что длительная, на протяжении 5 нед, терапия самцов крыс с сахарным диабетом 2‑го типа метформином не только частично восстанавливала у них стероидогенез и сперматогенез, но и усиливала стероидогенные ответы при введении животным TP03 [666, 667], что указывает на улучшение чувствительности семенников к аллостерическим агонистам. Это было обусловлено нормализацией экспрессии рецепторов ЛГ/ХГЧ и ферментов стероидогенеза в семенниках диабетических животных. В то же время при длительном введении TP03 крысам, леченным метформином, стимулирующий эффект низкомолекулярного агониста на продукцию тестостерона немного ослабевал, что может быть компенсаторной реакцией на длительную гиперактивацию системы тестикулярного стероидогенеза. Тем самым метформиновая терапия, которая эффективна для восстановления репродуктивной системы при метаболических расстройствах, сопровождающихся ожирением [687, 688], способна усиливать острые ответы семенников на стимуляцию аллостерическими агонистами рецептора ЛГ/ХГЧ, но мало эффективна для поддержания стероидогенных эффектов этих агонистов при их длительном применении.

Опираясь на данные, полученные при стимуляции тестикулярного стероидогенеза, было изучено влияние соединения TP03 на овариальный стероидогенез и овуляцию у самок крыс. Введение этого соединения половозрелым и неполовозрелым самкам крыс усиливало овариальный стероидогенез, повышая продукцию прогестерона, а у обработанных препаратом ФСГ фоллимагом неполовозрелых самок вызывало овуляцию, причем TP03 не уступал по эффективности ХГЧ [668, 669]. TP03 не вызывал повышения экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в яичниках, одного из триггеров синдрома гиперстимуляции яичников [668]. Тем самым TP03 и его аналоги могут быть использованы для стимуляции овариального стероидогенеза и контролируемой индукции овуляции у женщин, что открывает широкие перспективы для их применения в ВРТ.

Наряду с тиено[2,3-d]-пиримидиновыми производными, ведутся поиски аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ и среди других классов низкомолекулярных соединений. Наибольший интерес в этом отношении представляют производные пиразола, одно из которых (Compound 1) стимулировало активность АЦ (EC₅₀, 20 нМ) и продукцию тестостерона клетками Лейдига со значением EС₅₀, равным 1.31 мкМ [670] (табл. 4). Его эффективность была сопоставимой с таковой ХГЧ. При внутрибрюшинном введении самцам крыс Соединение 1 (32 мг/кг) повышало уровень тестостерона в крови животных. Как и тиено[2,3-d]-пиримидиновые производные, Соединение 1 не конкурировало с ХГЧ за места связывания с рецептором, что указывает на отсутствие перекрывания сайтов, связывающих производное пиразола и гонадотропин. Основываясь на результатах молекулярного докинга, был сделан вывод, что Соединение 1 взаимодействует с аллостерическим сайтом, локализованным в трансмембранном домене рецептора [670].

Аллостерические антагонисты и негативные аллостерические модуляторы рецептора ЛГ/ХГЧ

Первым среди низкомолекулярных антагонистов рецептора ЛГ/ХГЧ стало производное терфенила LUF5771, которое подавляло стимуляцию рецептора гонадотропинами и аллостерическими агонистами, в том числе эндогенным ЛГ [673, 674] (табл. 4). В концентрации 10 мкМ оно более чем в три раза ускоряло диссоциацию Org43553 от рецептора ЛГ/ХГЧ и в 2–3 раза снижало регуляторные эффекты ХГЧ и Org43553 на ЛГ-зависимый внутриклеточный сигналинг [673, 674]. Исследование сайта связывания соединения LUF5771 показало, что он, как и сайт связывания Org43553 и других тиено[2,3-d]-пиримидинов, локализован в трансмембранном тоннеле, частично с ним перекрывается, но включает иной набор АКО, локализованных в ТМ1, ТМ2, ТМ3, ТМ6 и ТМ7, а также в ECL2 [674]. Другое производное терфенила, соединение LUF5419, в присутствии которого ингибирующие эффекты LUF5771 снижаются в 2–10 раз, связывалось с тем же сайтом, что и LUF5771, но при этом не образовывало контакты с АКО, локализованными в ТМ1 и ТМ2 [673]. Предположительно именно эти остатки и могут быть ответственны за ингибирующий эффект LUF5771.

Основываясь на этих результатах, в дальнейшем на основе тетрагидро-1,6-нафтиридина были разработаны соединения BAY-298 и BAY-899, наделенные активностью NAM для рецептора ЛГ/ХГЧ [676] (табл. 4). Соединение BAY-298 снижало стимулированную ЛГ и аллостерическим агонистом Org43553 продукцию стероидных гормонов, подавляя тестикулярный и овариальный стероидогенез, а также блокировало фолликулогенез при введении самкам крыс. При этом оно связывалось с сайтом, отличным не только от ортостерического сайта, но и от аллостерического сайта связывания Org43553, который в значительной степени перекрывался с сайтом связывания LUF5771. Соединение BAY-899 дозозависимо подавляло стероидогенез при введении самкам крыс и, подобно BAY-298, останавливало цикл в фазе диэструса и метэструса [676].

Параллельно нами были разработаны производные тиено[2,3-d]-пиримидина (TP31) и пиридо[3,4-d]пиримидина (PP17), которые подавляли стимулированную ХГЧ и TP03 активность G_s-белков и фермента АЦ во фракции плазматических мембран, выделенных из семенников самцов крыс, причем TP31 (5-амино-N-(трет-бутил)-2-(метилтио)-4-[3-(2-(этиламино)никотинамидо)-фенил]тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид) был эффективнее в отношении стимулирующего эффекта TP03, а PP17 (этиловый эфир 7-амино-4‑(3-(этоксикарбонил)пиперидин-1-ил)-2-(метил- сульфанил)пиридо[4,3-d]пиримидин-8-карбоновой кислоты) – в отношении соответствующего эффекта ХГЧ [678, 679] (табл. 4). Обнаруженные эффекты, как мы полагаем, обусловлены различной локализацией TP31- и PP17-связывающих аллостерических сайтов, а также сходной локализацией сайта, связывающего структурно близкие, но отличающиеся по фармакологическому профилю тиено[2,3-d]-пиримидиновые производные TP03 и TP31. В экспериментах in vivo соединения TP31 и PP17 снижали стимулированную ХГЧ продукцию тестостерона, в существенно меньшей степени влияя на базовый уровень гормона, контролируемый эндогенным ЛГ, причем TP31 был эффективнее PP17. Тем самым, TP31 и PP17 проявляют активность NAM для гонадотропин-стимулированного рецептора ЛГ/ХГЧ, а также оказывают антагонистический эффект в отношении стимуляции агонистами трансмембранных аллостерических сайтов. С учетом слабо выраженного влияния на базовый уровень тестостерона, оба эти соединения могут быть классифицированы, как NAM/инверсионные агонисты.

Недавно было обнаружено, что дихлородифенилтрихлорэтан (p,p′DDT), который потенцирует ответ рецепторов ФСГ на введение препаратов ФСГ, также влияет на активность рецептора ЛГ/ХГЧ, предотвращая его активацию ЛГ и ХГЧ [677] (табл. 4). В культуре CHO-клеток p,p′DDT снижал стимулирующее влияние ХГЧ на уровень внутриклеточного цАМФ, и наряду с этим подавлял рекрутирование β-аррестинов, индуцированное ЛГ и ХГЧ. При этом, однако, он существенно не влиял на стимулированную гонадотропинами продукцию тестостерона. Это указывает на его активность как NAM для рецептора ЛГ/ХГЧ, наделенного предвзятой активностью в отношении определенных внутриклеточных каскадов [677]. Другим классом соединений, которые были активны как в отношении рецептора ФСГ, так и рецептора ЛГ/ХГЧ, являются производные бензамидов ADX68692 и ADX68693, которые в различной степени ингибировали стимулированную гонадотропинами активность этих рецепторов [675]. Парадоксально, но их действие является специфичным по отношению к определенным типам клеток с экспрессированными в них рецепторами ФСГ и ЛГ/ХГЧ и во многом зависит от паттерна их экспрессии. Не исключено, что мишенью производных бензамида являются гетероолигомерные комплексы рецепторов ФСГ и ЛГ/ХГЧ, что и определяет сложный профиль их фармакологической активности. Резюмируя, можно отметить, что в отличие от аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ, антагонисты и NAM менее специфичны по отношению к этому рецептору, что может быть обусловлено как сходством конфигурации “ингибирующего” аллостерического сайта рецепторов ФСГ и ЛГ/ХГЧ, так и гетероолигомеризацией этих рецепторов.

10.3. Аллостерические пептидные регуляторы внутриклеточного аллостерического сайта

Как и в случае рецептора ТТГ, проксимальные к мембране участки ICL3 рецептора ЛГ/ХГЧ играют определяющую роль во взаимодействии с G_s-белком, опосредующим стимуляцию цАМФ-зависимого сигналинга. Важное значение в таком взаимодействии имеют целостность кластеров положительно заряженных аминокислот и способность участков ICL3 образовывать амфипатическую спираль, оптимальную для формирования внутриклеточного аллостерического сайта. В полном соответствии с этими критериями нами был разработан пальмитоилированный с С-конца пепдуцин NK‑DTKIAKK-Nle-A^562–572-K(Palm)-A (562–572-K(Palm)A), соответствующий С-концевому участку ICL3 рецептора ЛГ/ХГЧ [671, 672] (табл. 4). Для изучения взаимоотношений структура–активность были изучены его аналоги – немодифицированные пептиды 558–572 и 562–572, и липофильные производные пептида 562–572, модифицированные пальмитатом или деканоатом с N- и C-концов, а также разветвленные аналоги пептида 562–572 с дендримерной структурой [689].

Пепдуцин 562–572-K(Palm)A и его димерный аналог, включающий сшитые через лизиновый мостик последовательности 562–572, стимулировали АЦ и ГТФ-связывающую активность G_s-белков в тестикулярных и овариальных мембранах крыс [671, 672]. Пепдуцин 562–572-K(Palm)A превосходил как немодифицированный аналог, так и более протяженный пептид 558–572, что подтверждает концепцию о том, что гидрофобный радикал, имитирующий ТМ (в нашем случае ТМ6), важен для активности пепдуцинов. Было установлено, что пепдуцин 562–572-K(Palm)A специфично активирует чувствительные к холерному токсину G_s-белки, существенно не влияя на G_i/o- и G_q/11-белки, также сопряженные с рецептором ЛГ/ХГЧ [672]. При изучении различных вариантов липофильных производных пептида 562–572, модифицированных деканоильными и пальмитоильными радикалами, было показано, что модификация ацильным радикалом с N-конца, который в молекуле рецептора соответствует середине гидрофильной ICL3, нарушает структуру пептида, в то время как деканоат в любой локализации недостаточен по длине и гидрофобности для транслокации пептида через мембрану и(или) для стабилизации его конформации, необходимой для эффективного взаимодействия с рецептором [689].

Для изучения активности пепдуцина 562–572-K(Palm)A in vivo осуществляли его введение самцам крыс линии Wistar. При интратестикулярном введении этот пепдуцин дозозависимо повышал продукцию тестостерона, что подтверждает наличие у него стероидогенной активности. Однако отсутствие значимого влияния пепдуцина на уровень тестостерона при его внутрибрюшинном введении свидетельствует о его деградации в кровотоке, что требует дальнейших исследований по созданию устойчивых к протеолизу аналогов этого пепдуцина [690]. Полученные результаты доказывают наличие внутриклеточного аллостерического сайта в молекуле рецептора ЛГ/ХГЧ, который может стать мишенью для позитивной и негативной регуляции ЛГ-сигналинга.

На рис. 3 суммированы данные по локализации аллостерических сайтов в молекуле рецептора ЛГ/ХГЧ, а также по основным, известным в настоящее время их аллостерическим регуляторам. Как и в случае рецептора ТТГ, множественность аллостерических сайтов в рецепторе ЛГ/ХГЧ является основой для тонкой регуляции ЛГ-зависимых сигнальных каскадов в клетках-мишенях. К этому необходимо добавить возможность трансактивации рецептора ЛГ/ХГЧ в комплексе с рецептором ФСГ, что также является одним из важнейших механизмов регуляции, сочетающей в себе как ортостерические, так и аллостерические влияния.

На рис. 4 представлены разработанные в настоящее время синтетические аллостерические регуляторы рецептора ЛГ/ХГЧ с активностью полных или частичных агонистов, в том числе пептидной природы (пепдуцин 562–572 и его димерный конструкт), нейтральных антагонистов, инверсионных агонистов, NAM, а также соединений со смешанным профилем фармакологической активности (инверсионный агонист/NAM). В трансмембранном домене рецептора ЛГ/ХГЧ показаны основные локусы, AS-1, AS-2 и AS-3, являющиеся мишенями для аллостерических регуляторов, причем в каждом локусе может быть локализовано несколько топологически различающихся аллостерических сайтов. В локусе AS-2 аллостерические сайты могут быть расположены внутри трансмембранного канала (предпочтительная локализация) или снаружи его, на границе трансмембранного домена с липидной фазой мембраны. Показаны возможные мишени действия аутоантител к рецептору ЛГ/ХГЧ, наделенных активностью стимуляторов ЛГ-зависимого сигналинга. Подробности см. в табл. 4 и в соответствующих подразделах раздела X.