Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 6, стр. 495-502

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Регистрация и анализ параметров сокращения. Для изучения сокращений использовали препараты сердца лягушки Rana ridibunda, как описано ранее [8, 9]. В наших экспериментах мы используем чувствительную модель спонтанных сердечных сокращений изолированных предсердий Rana ridibunda, поскольку спонтанные сокращения изолированных предсердий теплокровных отличаются нестабильностью. Общность физиологических процессов, лежащих в основе сердечной деятельности, позволяет нам проводить аналогии и обсуждать результаты, полученные на объектах разного вида животных.

Препараты растягивали до оптимальной длины, и сокращения регистрировали в изометрическом режиме. Препараты помещали в стеклянную термостатированную ячейку при 10°С, ориентировали вертикально и растягивали с помощью стальных крючков, сделанных из мандрена. Один стальной крючок присоединяли к фиксированному платиновому крючку, второй – к тензодатчику. Сигналы обрабатывали с помощью компьютерной программы WinPulse, силу сокращения определяли в ньютонах (Н). Оценивали следующие параметры сокращения: максимальное усилие, развиваемое мышечным препаратом (F_max, мН), и период полурасслабления (t_1/2, с). В экспериментах использовали нормальный раствор Рингера, содержащий 110 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂, 2.5 мМ CaCl₂, 0.75 мМ NaH₂PO₄, 0.5 мМ NaHCO₃, 5 мМ глюкозы (pH 7.4). Хлорид гадолиния готовили в виде 100 мМ сток-раствора и вносили в экспериментальный раствор до конечных концентраций 1 мМ непосредственно перед экспериментом. Действие Gd³⁺ прекращали путем отмывания препарата нормальным раствором Рингера. Исследование действия гадолиния на сократительные характеристики сердечной мышцы лягушки Rana ridibunda проводили с использованием независимых препаратов, полученных от четырех (n = 4) отдельных животных. Использовали оптимальную 1 мМ концентрацию Gd³⁺, как в наших аналогичных опытах с другими лантаноидами (Y³⁺, La³⁺, Nd³⁺, Pr³⁺) [8–10]. Применяли стандартные способы статистической обработки результатов с использованием критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0.05.

Выделение митохондрий. Для выделения одного препарата митохондрий сердца крысы (МСК) использовали 8 самцов линии Вистар массой 200–250 г. Суммарная масса сердечной ткани была около 10 г. Все процедуры проводили на льду согласно разработанной нами методике [10]. На итоговом этапе МСК суспендировали в 3 мл среды, содержащей 300 мМ сахарозу и 10 мМ трис-HCl (pH 7.3). Определенная по методу Бредфорда концентрация белка в митохондриальных препаратах была в пределах 20–30 мг/мл. В работе использовали: сахарозу, очищенную от примесей катионов на ионообменной колонке со смолой КУ-2-8, 2,4-динитрофенол (ДНФ) марки “ч. д. а.”; маннитол, CaCl₂, Gd(NO₃)₃, NH₄NO₃, K-ацетат и H₃PO₄ марки “х. ч.”; сафранин, трис-ОН, KCl, олигомицин, глутамат, малат, АДФ, MgCl₂, MOPS и EGTA − фирмы Sigma.

Спектрофотометрическая оценка изменения объема митохондрий. Увеличение объема (набухание) митохондрий в солевых средах становится возможным при одновременном поступлении в матрикс катионов с анионами и идущей вслед за ними воды [11]. При этом снижается оптическая плотность проходящего через митохондриальную суспензию света длиной волны 520–540 нм из-за уменьшения ее светорассеивания [12, 13]. В частности, изучение набухания МСК в солевых средах позволяет оценить транспорт катионов (K⁺ и H⁺) через внутреннюю мембрану [10, 11]. Набухание МСК регистрировали при температуре 20°C на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. Митохондрии (1 мг белка на 1 мл) вносили в среду, содержащую 5 мМ трис-HCl (pH 7.3) и 125 мМ NH₄NO₃ (рис. 2) или 100 мМ сахарозу, 10 мм трис-HCl (pH 7.3) и 25 мМ K-ацетат (рис. 3), а также 1 мкг/мл олигомицина. До внесения митохондрий вводили вещества до следующих концентраций: 60 мкМ Gd³⁺ и 250 мкМ Ca²⁺ (рис. 3) или 50 мкМ Gd³⁺ и 200 мкМ Ca²⁺ (рис. 4). После митохондрий в среду вносили субстраты до концентрации – 10 мМ глутамат и 2 мМ малат.

Рис. 2.

Действие Gd³⁺ и Ca²⁺ на набухание (ΔD₅₄₀) митохондрий сердца крысы в среде с NH₄NO₃. Митохондрии (1 мг/мл) вносили в среду, содержащую 125 мМ NH₄NO₃, 5 мМ трис-HCl и 1 мкг/мл олигомицина, а также (где указано) 60 мкМ Gd³⁺ (Gd³⁺) и 250 мкМ Ca²⁺ (Ca²⁺). Цифрами справа от кривых показана добавка до митохондрий: 1 – без добавок (контроль), 2 – Gd³⁺, 3 – Ca²⁺, 4 – Ca²⁺ + Gd³⁺. Стрелками показана добавка в среду митохондрий сердца крысы (МСК), а также глутамата и малата соответственно до концентраций 10 мМ и 2 мМ (G+M).

Fig. 2. Effect of Gd³⁺ and Ca²⁺ on swelling (ΔA₅₄₀) of rat heart mitochondria |(RHM) in the medium with NH₄NO₃. Mitochondria (1 mg/mL) were added into a medium containing 125 mM NH₄NO₃, 5 mM Tris-HCl, 1 µg/mL oligomycine, and (whenever indicated) 60 µM Gd³⁺ (Gd³⁺) and 250 µM Ca²⁺ (Ca²⁺). Numerals to the right of the traces show pre-mitochondrial addition agents: 1 – no additions (control), 2 – Gd³⁺, 3 – Ca²⁺, 4 – Ca²⁺ + Gd³⁺. Arrows indicate the addition of mitochondria into the medium and that of glutamate and malate up to concentrations of 10 mM and 2 mM, respectively (G+M).

Рис. 3.

Действие Gd³⁺ и Ca²⁺ на набухание (ΔD₅₄₀) митохондрий сердца крысы в среде с K-ацетатом и сахарозой. Митохондрии (1 мг/мл) добавляли в среду, содержащую 25 мМ K-ацетат, 100 мМ сахарозу и 1 мкг/мл олигомицина, а также (где указано) 60 мкМ Gd³⁺ (Gd³⁺) и 250 мкМ Ca²⁺ (Ca²⁺). Добавки и обозначения как на рис. 2.

Fig. 3. Effect of Gd³⁺ and Ca²⁺ on swelling (ΔA₅₄₀) of rat heart mitochondria in the medium with potassium acetate and sucrose. Mitochondria (1 mg/mL) were injected into a medium containing 25 mM K-acetate, 100 mM sucrose, 1 µg/mL oligomycine, and (whenever indicated) 60 µM Gd³⁺ (Gd³⁺) and 250 µM Ca²⁺ (Ca²⁺). Additions and designations as in Fig. 2.

Рис. 4.

Влияние Gd³⁺ и Ca²⁺ на скорость поглощения кислорода энергизованными глутаматом и малатом митохондриями сердца крысы. Митохондрии (1 мг/мл) были суспендированы в среде, содержащей 125 мМ KCl, 20 мМ трис-MOPS (pH 7.3), 3 мМ трис-PO₄, 10 мМ глутамат и 2 мМ малат. Цифрами над кривыми показаны скорости поглощения кислорода (нг-атом O/мин на 1 мг белка). Стрелками показаны добавки митохондрий (МCК), а также реагентов до концентраций – 50 мкМ Gd³⁺ (Gd³⁺), 200 мкМ Ca²⁺ (Ca²⁺), 130 мкМ АДФ (АДФ) и две добавки 2,4-динитрофенола (ДНФ) до коцентрации 10 мкМ. Цифрами справа от кривых показано: 1 – без добавок (контроль), 2 – Gd³⁺, 3 – Ca²⁺, 4 – Ca²⁺ + Gd³⁺.

Fig. 4. Effect of Gd³⁺ and Ca²⁺ on oxygen consumption rate in glutamate and malate energized rat heart mitochondria. Mitochondria (1 mg/mL) were suspended in the medium containing 125 mM KCl, 20 mM Tris-MOPS (pH 7.3), 3 mM Tris-PO₄, 10 mM glutamate, and 2 mM malate. Numerals above the traces show oxygen consumption rates (ng-atom O/min per 1 mg of protein). Arrows indicate the additions of rat heart mitochondria (RHM) and reagents up to concentrations of 50 µM Gd³⁺ (Gd³⁺), 200 µM Ca²⁺ (Ca²⁺), 130 µM ADP (ADP), and two additions of 2,4-dinitrophenol (DNP) up to 10 µM concentration. Numerals to the right of the traces show: 1 – no additions (control), 2 – Gd³⁺, 3 – Ca²⁺, 4 – Ca²⁺ + Gd³⁺.

Измерение поглощения кислорода. Скорости поглощения кислорода (дыхание) митохондрий (нг-атом О/мин на мг белка) оценивали методом полярографии с применением закрытого платинового электрода Кларка на анализаторе Эксперт-001 (НПО Эконикс эксперт, Россия) при 26°С в ячейке объемом 1.4 мл [14]. Функциональные состояния изолированных митохондрий оценивали по Чансу [15]: состояние 4₀ (базальное, только субстрат в среде), состояние 3 (после внесения АДФ в среду с субстратом) и состояние 3Р_ДНФ (дыхание разобщенное 2,4-динитрофенолом). Митохондрии (1 мг белка в 1 мл) добавляли в среду, содержащую 125 мМ KCl, 20 мМ трис-MOPS (pH 7.3), 3 мМ трис-PO₄, 5 мкМ EGTA, а также 10 мМ глутамат и 2 мМ малат (рис. 4). После добавления митохондрий в среду вносили вещества (показано стрелками) до следующих конечных концентраций: Ca²⁺ (Ca²⁺) – 200 мкМ; Gd³⁺ (Gd³⁺) – 25 мкМ; ADP (ADP) – 300 мкМ; ДНФ (ДНФ) – 15 мкМ.

Определение митохондриального потенциала. Для оценки ∆Ψ_мито использовали стандартную методику Вальдмайера и др. [16]. Оценивали интенсивность флуоресценции сафранина в суспензии митохондрий при 20°С при длине волны возбуждающего света и эмиссии соответственно при 485 и 590 нм на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 (Shimadzu, Япония) (рис. 5). Митохондрии (0.5 мг белка в 1 мл) вносили в кварцевую кювету с 3 мл среды, содержащей 125 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl (pH 7.3), 50 мМ сахарозу, 3 мМ трис-PO₄, 3 мМ MgCl₂, 3 мкМ сафранин и 1 мкг/мл олигомицина. После митохондрий (показано стрелками) в среду инкубации добавляли вещества до следующих конечных концентраций: 10 мМ глутамат и 2 мМ малат (G+M); Ca²⁺ (Ca²⁺) – 600 мкМ; Gd³⁺ (Gd³⁺) – 150 мкМ; ДНФ (ДНФ) – 30 мкМ. На рисунках показаны типичные результаты, полученные для трех независимых экспериментов. Выбор используемых в настоящей работе концентраций Gd³⁺ и Ca²⁺ основывался на результатах наших опытов по оценке биологической активности ряда металлов, в том числе Y³⁺, La³⁺, Pr³⁺ и Nd³⁺ с использованием препаратов желудочков сердца лягушки и изолированных МСК в качестве биологических моделей [8–10]. Применяли стандартные способы статистической обработки результатов с использованием статистической программы Microsoft Origin 6.0. Различия считали достоверными при р < 0.05.

Рис. 5.

Влияние Gd³⁺ и Ca²⁺ на изменение потенциала (ΔΨ_мито) на внутренней мембране энергизованных глутаматом и малатом митохондрий сердца крысы. Митохондрии (0.5 мг/мл) вносили в среду, содержащую 125 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl, 3 мМ MgCl₂, 3 мМ трис-PO₄, 3 мкМ сафранин и 1 мкг/мл олигомицина. Стрелками показано внесение в среду митохондрий сердца крысы (МСК), 10 мМ глутамат и 2 мМ малат (G+M), 350 мкМ Ca²⁺ (Ca²⁺), 67.5 мкМ Gd³⁺ (Gd³⁺) и 30 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ). Цифрами справа от кривых показано: 1 – без добавок (контроль), 2 – Ca²⁺, 3 – Ca²⁺ + Gd³⁺. Над кривыми отмечена скорость изменения флуоресценции сафранина О в суспензии митохондрий (усл. ед./мин), которая рассчитывалась посредством программного продукта Excel 2003 за 1 мин до внесения в среду ДНФ.

Fig. 5. Effect of Gd³⁺ and Ca²⁺ on changes in the inner membrane potential (ΔΨ_mito) of glutamate and malate energized rat heart mitochondria. Mitochondria (0.5 mg/mL) were added into the medium containing 125 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl₂, 3 mM Tris-PO₄, 3 µM safranin, and 1 µg/mL oligomycine. Arrows indicate the additions of rat heart mitochondria (RHM), 10 mM glutamate and 2 mM malate (G+M), 350 µM Ca²⁺ (Ca²⁺), 67.5 µM Gd³⁺ (Gd³⁺) and 30 µM 2,4-dinitrophenol (DNP). Numerals to the right of the traces show: 1 – no additions (control), 2 – Ca²⁺, 3 – Ca²⁺ + Gd³⁺. Rates of safranine O fluorescence change (arbitrary units per min) in the mitochondrial suspension are shown above experimental traces as calculated in Excel 2003 for 1 min before DNP injection into the medium.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие Gd³⁺ на силу сердечных сокращений. Инотропное действие хлорида гадолиния определяли на изолированных препаратах предсердия сердца лягушки в условиях cпонтанного возбуждения/сокращения. Установлено, что ионы Gd³⁺ в концентрации 1 мМ через 10 мин после начала инкубации предсердий в растворе Рингера достоверно снижали амплитуду спонтанных сердечных сокращений (F_max) на 36 ± 5% (n = 4, p < 0.01, рис. 1). При этом период полурасслабления незначительно уменьшался, на 4 ± 1% (n = 4). Частота сокращения также незначительно снижалась, на 13 ± 3% (n = 4). Незначительный отрицательный хронотропный эффект Gd³⁺ может быть обусловлен его ингибирующим действием на потенциал-управляемые Са²⁺-каналы (Са_V) пейсмекерных клеток синоатриального узла (СА-узла). Таким образом, полученные данные (рис. 1) свидетельствуют о том, что Gd³⁺ оказывает значительное отрицательное инотропное действие на миокард.

Известно, что концентрация свободных ионов кальция в цитозоле [Ca²⁺]_i, а также динамика его изменения внутри сердечной клетки определяют величину развиваемого напряжения и скорость сокращения/расслабления [17]. В наших экспериментах Gd³⁺ подавлял сократимость миокарда, что, вероятно, является следствием уменьшения концентрации Ca²⁺ в цитозоле при аппликации Gd³⁺. В КМ вход внеклеточного Ca²⁺ осуществляется преимущественно через потенциал-управляемые Ca²⁺-каналы L-типа (Сa_V1.2) [17]. Блокирование этих каналов с помощью специфических блокаторов (верапамила, нифедипина) приводит к нарушению механизма запуска сокращения в сердечной мышце [18], осуществляемого по принципу Ca²⁺-индуцированного высвобождения Ca²⁺, к падению амплитуды F_max и в результате к нарушению сердечной деятельности.

В имеющейся литературе нет указаний на механизм действия Gd³⁺ как на кальциевые каналы плазматической мембраны в КМ, так и на сокращение КМ. Предполагается, что в электровозбудимых клетках лантаноиды блокируют входящие Ca²⁺ токи, активируемые деполяризацией поверхностной мембраны [19]. Сравнение влияния хлорида гадолиния и хлористого лантана на параметры сокращения КМ указывает на сходство в ингибирующем действии этих соединений, что может свидетельствовать об общем механизме их блокирующего действия на Сa_V1.2. Полученные результаты могут свидетельствовать о возможном действии Gd³⁺ на потенциал-управляемые Ca²⁺-каналы сердечных клеток, что выражается в уменьшении F_max спонтанно сокращающихся препаратов, а также в снижении частоты спонтанных сокращений. Ионы Gd³⁺ практически не влияли на время полурасслабления сердечной мышцы, что может свидетельствовать о том, что Gd³⁺ не влияет на реабсорбцию кальция из цитозоля.

Не исключено, что отрицательный инотропный эффект Gd³⁺ мог быть обусловлен не только его конкурентным действием на кальциевые каналы плазматической мембраны, но и его влиянием на кальциевые транспортеры МСК. В этой связи представлялось важным определить влияние Gd³⁺ на функциональное состояние митохондрий и установить его действие на катионный транспорт через ВММ.

Ранее мы обнаружили, что иттрий не оказывал заметного влияния на дыхание изолированных МСК [10]. Однако, учитывая физико-химические различия этих двух металлов, можно предположить и наличие у них разной биологической активности.

Учитывая наши экспериментальные данные и данные литературы о блокирующем действии лантаноидов на Ca_V-каналы [9, 10, 20], мы предположили, что в КМ гадолиний, подобно действию других, ранее изученных нами лантаноидов [8–10], может оказывать заметное влияние на кальцийзависимые процессы в митохондриях и, в частности, ингибировать митохондриальный Ca²⁺-унипортер и влиять на дыхание митохондрий, находящихся в различных энергетических состояниях.

Действие Gd³⁺ на набухание митохондрий. Ранее было показано, что пассивную протонную проницаемость ВММ можно оценить по набуханию неэнергизованных митохондрий в среде с NH₄NO₃ [21]. Можно увидеть (рис. 2), что набухание неэнергизованных МСК в содержащей Gd³⁺ среде с NH₄NO₃ (кривая 2) было таким же, как в контроле, без Gd³⁺ (кривая 1). Далее, после внесения глутамата с малатом и независимо от наличия или отсутствия в среде Gd³⁺, энергизованные МСК во всех опытах сжимались (рис. 2, кривые 1, 2) из-за откачки протонов из матрикса протонными насосами дыхательной цепи [21]. Еще до внесения глутамата и малата в среду, МСК в среде с Ca²⁺ и не зависимо от наличия в ней Gd³⁺ (рис. 2, кривые 3, 4) демонстрировали гораздо большее набухание в сравнении с аналогичными опытами без Ca²⁺ (рис. 2, кривые 1, 2). Скорее всего, это связано с транспортом кальция в матрикс при участии эндогенных субстратов [9]. Энергизация МСК в среде с Ca²⁺ (кривая 4) стимулировала сжатие митохондрий, которое в среде с Gd³⁺ было сильнее, чем в аналогичных опытах с Ca²⁺ (кривая 3).

Известно [12], что набухание энергизованных митохондрий в гипоосмотической (160 мОсм) среде с 25 мМ K-ацетатом и 100 мМ сахарозой позволяет оценить энергозависимый транспорт ионов K⁺, поступающих в матрикс по механизму электрофоретического унипорта [11]. Параллельно этому в митохондрии, по градиенту концентрации, поступают молекулы уксусной кислоты, для которых ВММ свободно проницаема [11]. В матриксе они диссоциируют на анионы ацетата и ионы водорода, которые удаляются из энергизованных митохондрий протонными помпами электрон-транспортной цепи, что в конечном итоге приводит к накоплению в нем K-ацетата и набуханию органелл. Ранее мы получили экспериментальные доказательства того, что усиление набухания энергизованных МСК в среде с K-ацетатом в присутствии редкоземельных элементов (La³⁺, Y³⁺, Pr³⁺, Nd³⁺) связано с активацией этими ионами транспорта калия в матрикс митохондрий [8–10]. В наших экспериментах с Gd³⁺ (рис. 3) набухание МСК еще до внесения глутамата и малата в среду с K-ацетатом заметно ускорилось при наличии в ней Gd³⁺ (кривая 2) по сравнению с контролем (кривая 1). При последующей энергизации митохондрий набухание митохондрий дополнительно возросло. В аналогичных опытах с одним Ca²⁺ (рис. 3, кривая 3) набухание деэнергизованных митохондрий было заметно сильнее в сравнении с контролем (кривая 1). Однако это набухание ощутимо снизилось при совместном присутствии в среде Ca²⁺ и Gd³⁺ (кривая 4). Последующее внесение субстратов окисления не повлияло на соотношение величины этого набухания (кривые 3 и 4). Эти данные позволяют предположить, что дополнительное ускорение набухания митохондрий сердца крысы в среде с K-ацетатом и Gd³⁺ может быть связано со стимуляцией ионами Gd³⁺ калиевой проницаемости внутренней мембраны. Торможение набухания МСК в этой среде с Ca²⁺ в присутствии Gd³⁺, скорее всего, вызвано конкурентным ингибированием ионами Gd³⁺ митохондриального кальциевого унипортера [22]. А это, в свою очередь, может уменьшать поступление Ca²⁺ в матрикс митохондрий и снижать вероятность открытия МКЗП во внутренней мембране.

Действие Gd³⁺ на дыхание митохондрий. Ранее нами было показано, что ионы La³⁺, Y³⁺, Pr³⁺ и Nd³⁺ активировали дыхание МСК, находящихся в состоянии 4₀ [8–10]. На рис. 4 (кривая 2) видно, что Gd³⁺ также незначительно активировал дыхание МСК, находящихся в состоянии 4₀ и энергизованных глутаматом и малатом. По-видимому, этот эффект Gd³⁺ связан с активацией транспорта K⁺ в матрикс митохондрий, на что могут указывать данные, представленные на рис. 3, а также результаты, полученные нами ранее в аналогичных экспериментах с другими лантаноидами (см. выше). Ионы Gd³⁺, по сравнению с контролем, не действовали на дыхание МСК, находящихся в состояниях 3 и 3Р_ДНФ (рис. 4, кривые 2 и 1). После внесения Ca²⁺ в среду (кривая 3) происходила кратковременная активация дыхания в состоянии 4₀, связанная с потенциал-зависимым поступлением ионов Ca²⁺ в матрикс с последующим снижением дыхания МСК в состояниях 3 и 3Р_ДНФ. В том случае, когда Gd³⁺ вносили в среду до Ca²⁺ (кривая 4) скорости дыхания в состояниях 3 и 3Р_ДНФ практически не изменялись. Подобные результаты были получены в аналогичных опытах с указанными выше трехвалентными катионами, что указывает на сходство механизмов действия ранее изученных лантаноидов и Gd³⁺ на МСК. Отсутствие эффекта Gd³⁺ на дыхание митохондрий в состояниях 3 и 3Р_ДНФ в опытах без кальция (рис. 4, кривая 2) не позволяет говорить о каком-либо токсическом эффекте Gd³⁺ на МСК. Это отличает действие Gd³⁺ и других изученных нами редкоземельных элементов от действия тяжелого металла (Cd²⁺), который в подобных экспериментах заметно угнетал дыхание фосфорилирующих митохондрий [23]. С другой стороны, снижение скоростей дыхания митохондрий, находящихся в состоянии 3 и 3Р_ДНФ в опытах с Са²⁺, вероятнее всего, связано с набуханием митохондрий [8] (рис. 2 и 3) и с активацией митохондриальной кальцийзависимой поры в их внутренней мембране [8, 24].

Действие Gd³⁺ на потенциал внутренней мембраны. На рис. 5 показано влияние Gd³⁺ и Ca²⁺ на потенциал внутренней мембраны МСК. Добавка в среду глутамата и малата (кривые 1–3) индуцировала потенциал-зависимое поглощение сафранина митохондриями, что наряду с данными полярографических опытов (рис. 4) доказывает их жизнеспособность и возникновение разности потенциалов на ВММ. Последующая добавка Gd³⁺ не приводила к изменению величины флуоресценции сафранина (кривая 3) и соответственно ΔΨ_мито. Итоговая инъекция ДНФ приводила к сбросу ΔΨ_мито на внутренней мембране МСК (кривые 1–3). После добавления Са²⁺ (в среду без Gd³⁺) (рис. 5, кривая 2) наблюдалось кратковременное повышение флуоресценции сафранина, связанное с потенциал-зависимым поглощением Ca²⁺ энергизованными митохондриями [25]. После этого происходило Ca²⁺-индуцированное снижение ΔΨ_мито, связанное с выходом сафранина в среду из-за открытия МКЗП [8, 25]. Внесение в среду Gd³⁺ (рис. 5, кривая 3) несколько ослабляло последующее действие Са²⁺ на ΔΨ_мито и вызывало задержку выхода сафранина из митохондрий, что видно при сравнении скоростей Ca²⁺-индуцированного увеличения сигнала сафранина в опытных (рис. 5, кривые 2, 3) и в контрольной пробах (рис. 5, кривая 1). Вызванное Gd³⁺ торможение кальцийзависимого кратковременного снижения потенциала и скорости Ca²⁺-индуцированного выхода сафранина из митохондрий можно объяснить уменьшением транспорта Ca²⁺ в матрикс МСК за счет конкурентного ингибирования митохондриального Ca²⁺-унипортера и, как следствие, последующего ингибирования Са²⁺-индуцированного открытия МКЗП во внутренней мембране митохондрий по аналогии с другими изученными нами лантаноидами [8–10, 26].

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что ионы Gd³⁺ обладают значительным отрицательным инотропным и незначительным хронотропным действием при спонтанном сокращении миокарда (предсердия). Кроме того, ионы Gd³⁺ увеличивают ионную проницаемость внутренней мембраны митохондрий, оказывают блокирующее действие на энергозависимый транспорт Ca²⁺ в митохондрии, но при этом практически не влияют на дыхание изолированных митохондрий. Сочетание этих эффектов Gd³⁺ может быть причиной снижения сократимости сердечной мышцы при попадании солей Gd³⁺ в организм человека.

Исследования по определению митохондриального потенциала проводили на базе Центра коллективного пользования в ИЭФБ РАН.