Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2020, T. 56, № 6, стр. 430-438

ВВЕДЕНИЕ

В конце прошлого века были идентифицированы каротиноиды многих морских двустворчатых моллюсков, благодаря которым и были определены основные пути трансформации растительных каротиноидов [1, 2]. Однако, помимо хорошо известных и часто встречающихся метаболических путей трансформации каротиноидов, характерных для большинства видов двустворчатых фильтрующих моллюсков, существуют еще для отдельных видов индивидуальные пути метаболических преобразований, с образованием видоспецифичных каротиноидов [3]. Возникновение этих каротиноидов напрямую связано с их особой функциональной ролью в данном организме – это представляет особый научный интерес. Среди факторов, влияющих на накопление и метаболизм каротиноидов животных, наиболее важными являются изменения в спектре питания [2–6].

Одним из типичных представителей черноморской малакофауны является двустворчатый моллюск Cerastoderma glaucum, фильтрующий сестон на рыхлых почвах Крымского побережья [7]. Несмотря на широкий спектр питания, взрослые особи предпочитают детрит, взвешенные органические вещества, а более молодые особи питаются, в основном, одноклеточными водорослями [9]. Источником последних может быть как фитопланктон, так и бентосные виды [10]. Ранее нами была исследована сезонная изменчивость состава каротиноидов у этого черноморского вида моллюсков [8]. Всего было обнаружено 11 свободных и 4 этерифицированных каротиноида, среди которых был иденифицирован видоспецифичный каротиноид – мактраксантин, который накапливался в 2 изомерных формах, в свободном и этерифицированном состоянии. Для моллюска C. glaucum была отмечена чувствительность к сезонным изменениям места обитания [8]. Известно, что прибрежный состав крымского черноморского фитопланктона представлен 386 видами микроводорослей, 4% из которых принадлежат Chlorophyta [10]. В некоторых местах поселений моллюсков во время отлива, в бухтах, часто наблюдается временное заболачивание. В этих местах в эти периоды увеличивается рост зеленых макрофитов и микроводорослей Chlorophyta, которыми обрастают раковины моллюсков. Чувствительность C. glaucum к сезонным изменениям, малоизученность путей метаболизма каротиноидов у этого вида, а также обрастание раковин моллюска в естественных условиях обитания зелеными макро- и микроводорослями привели к возникновению научного интереса к трансформации каротиноидов у этого вида моллюсков.

Цель данной работы – исследовать накопление и трансформацию растительных каротиноидов зеленых микроводорослей в тканях морского двустворчатого моллюска C. glaucum при использовании в пищу монокультуры зеленых микроводорослей Tetraselmis viridis. Для этого решались задачи по установлению состава и содержания каротиноидов T. viridis и C. glaucum, а затем поставлен и проведен шестидневный эксперимент в лабораторных условиях по содержанию группы особей морских двустворчатых моллюсков C. glaucum на диете из зеленых микроводорослей T. viridis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объект исследования – Cerastoderma glaucum (Bruguière, 1789), морской вид двустворчатых моллюсков (сестонофагов) из семейства Cardidae. Исследования моллюсков проводились в осенний период 2016 и 2017 г. В начале была проведена работа по подробному исследованию состава каротиноидов C. glaucum из естественного поселения в районе Казачьей бухты (г. Севастополь), а потом был подготовлен и проведен 6-дневный эксперимент. На этапе подготовки к эксперименту были отобраны моллюски C. glaucum в количестве 60 особей с длиной раковины 25 мм и более. После трехдневной акклимации животных в лаборатории в естественной морской воде, взятой в прибрежной части залива, их разделили на 2 равные группы: контрольную и экспериментальную. Контрольная группа продолжала содержаться в морской воде из бухты; для экспериментальной группы морскую воду сначала фильтровали через мембранные фильтры диаметром пор 0.45 мкм, затем стерилизовали при температуре 75°С [11]. Обмен морской воды в контрольной и экспериментальной группах на удаление метаболитов проводили один раз в день в одно и то же время, после чего в экспериментальную группу вносили корм – микроводоросли Tetraselmis viridis из расчета 1–3 мг сухой массы на 3 л морской воды один раз в день [11]. Tetraselmis viridis (Rouchijajnen) относятся к зеленым микроводорослям (Chlorodendraceae (семейство); Tetraselmis (род)), были взяты из центра коллективного пользования “Коллекция гидробионтов Мирового океана” ФИЦ ИнБЮМ и были выращены на среде F/2 [12]. В обеих емкостях круглосуточно проводилась аэрация.

Состав каротиноидов T. viridis определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в тех же условиях, что и у C. glaucum. Лабораторная обработка тканей моллюсков с целью определения суммарного содержания каротиноидов (ССК) и дальнейшая тонкослойная хроматография (TСХ), подготовка и хранение образцов проводились в соответствии с мерами предосторожности, рекомендованными при работе с пигментами [13].

Спектрофотометрические методы. Мягкие ткани гомогенизировали в фарфоровой ступке пестиком, затем проводили экстракцию 100%-ным ацетоном [14]. Определение ССК проводили спектрофотометрическим методом [14]. Суммарный экстракт каротиноидов для идентификации методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии (MS) [15] был запечатан в ампулах в атмосфере азота и транспортирован при низкой температуре в Институт химии ДВО РАН.

Хроматографические методы и масс-спектрометрия. Разделение пигментов проводили хроматографическими методами: ТСХ и ВЭЖХ. При проведении ТСХ использовались пластины “Сорбфил” (Россия, Краснодар). Ацетоновые экстракты ССК выпаривали в вакууме, растворяли в хлороформе и разделяли на ацетон:гексан (2:8) при температуре воздуха 18–20°С.

Для ВЭЖХ использовались: хроматограф Shimadzu LC-20 с матричным фотодиодным детектором SPD-M20A; колонка с нормальной фазой Zorbax Sil 4.6 × 250 мм, скорость потока 1 мл × мин^–1, градиент гексан–ацетон (0–20 мин гексан:ацетон 8:2 изократический, градиент от 20 до 25 мин до 80% ацетона, 25–35 мин – гексан:ацетон 2:8 (изократический)). Фракции каротиноидов собирали после разделения (приблизительно 10–15 разделений), объединяли, упаривали досуха на роторном испарителе при 40°C, снова растворяли в метаноле, затем масс-спектры регистрировали с использованием масс-спектрометрического детектора низкого разрешения Shimadzu LCMS-2010EV, источник APCI, в режиме положительных ионов.

Омыление каротиноидов проводили повторным растворением их в 5%-ном растворе КОН в метаноле.

Оценка количественного содержания каротиноидов была основана на результатах ВЭЖХ с учетом коэффициента ${\text{A}}_{{1\,{\text{cm}}}}^{{1\,\% }}$ 2500 при 450 нм. Отношение максимумов III/II, % в спектрах поглощения рассчитывали, как описано в [15].

Статистический анализ. Статистическая обработка и графическое оформление полученной информации проводились при помощи пакета “Grapher-7”. Результаты расчета суммарных каротиноидов представлены как среднее арифметическое ($\bar {x}$) и стандартная ошибка средней ($S\bar {x}$). Сравнение значений ССК для опытной и контрольной групп проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни.

Все экспериментальные протоколы были выполнены в соответствии с руководящими принципами ЕС по использованию лабораторных животных и уходу за ними (86/609/CEE) и при соблюдении правил, утвержденных распоряжением Президиума АН СССР от 2 апреля 1980 г. № 12000-496 и приказом Минвуза СССР от 13 сентября 1984 г. № 22. Все усилия были предприняты, чтобы использовать только минимальное количество животных, необходимое для получения надежных научных данных. Настоящая статья не содержит результатов каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При отборе моллюсков C. glaucum из естественных условий обитания в Казачьей бухте осенью 2016 и 2017 г. диапазон ССК составлял от 2.0 до 3.5 мг × 100 г^–1 сырого веса ткани. После трех дней в лабораторных условиях среднее значение ССК уменьшилось до 1.9 ± 0.2 мг × 100 г^–1. В ходе эксперимента этот показатель в контрольной группе моллюсков практически не изменился, а в опытной группе (которую кормили только Т. viridis) он увеличился до 2.3 ± 0.1 мг × 100 г^–1 (в 1.2 раза, p < 0.05) (рис. 1).

Рис. 1.

Динамика содержания суммарных каротиноидов (мг/100 г^–1) C. glaucum в 6-дневном эксперименте. Примечание/Note: ○ – ССК в опыте/TCC in experiment, ● – ССК в контроле/TCC in control.

Fig. 1. Dynamics of the total carotenoid content (mg/100 g^–1) in C. glaucum during a 6-day experiment.

Рост ССК в течение эксперимента в опытной группе сопровождался смертностью 20% особей относительно контрольной группы.

Качественный состав каротиноидов C. glaucum. ТСХ. С помощью тонкослойного разделения в системе ацетон:гексан (2:8) общего экстракта каротиноидов можно визуально выделить до 10 фракций. Очередность распределения фракций на ТСХ сверху вниз сравнима с временем выхода фракций на ВЭЖХ (рис. 2 и 3).

Рис. 2.

ТСХ экстракта суммарных каротиноидов (в системе растворителей: ацетон:гексан (2:8)) C. glaucum в эксперименте: контроль и опыт.

Fig. 2. TLC of the total carotenoid extract [acetone:hexane (2:8)] from C. glaucum in the experiment and control.

Рис. 3.

ВЭЖХ экстракта суммарных каротиноидов C. glaucum в эксперименте: А – контроль; Б – опыт. По оси ординат: интенсивность при 450 нм; по оси абсцисс – время, мин. Обозначения пиков: 1 – каротин (β, β- и β, ε-), 2 – эфиры гетероксантина, 3 – эфир мактраксантина¹, 4 – эфир фукоксантина, 5 – эфир мактраксантина², Chl – хлорофилл, 6 – аллоксантин, 7 – лютеин, 9 – диадиноксантин, 10 – фукоксантин, 12 – неоксантин, 13 – гетероксантин, 14 – (транс-изомер) мактраксантина, 15 – (цис-изомер) мактраксантина. ^1–2 – эфиры мактраксантина, образованные разными карбоновыми кислотами.

Fig. 3. HPLC of the total carotenoid extract from C. glaucum: A – control; B – experiment. Ordinate: intensity at 450 nm; abscissa – time, min. Peak designations: 1 – carotene (β, β- and β, ε-), 2 – heteroxanthin ester, 3 – mactraxanthin ester¹, 4 – fucoxanthin ester, 5 – mactraxanthin ester², Chl – chlorophyll, 6 – alloxanthin, 7 – lutein, 9 – diadinoxanthin, 10 – fucoxanthin, 12 – neoxanthin, 13 – heteroxanthin, 14 – (trans-isomer) mactraxanthin, 15 – (cis-isomer) mactraxanthin. ^1–2 mactraxantin esters formed by different carboxylic acids.

Метод ВЭЖХ имеет более высокую чувствительность и эффективность разделения, что позволяет определить даже незначительное содержание каротиноида в суммарном экстракте, которое на ТСХ визуально определить невозможно. Последовательность выхода идентифицированных фракций каротиноидов на ВЭЖХ (рис. 3) пронумерована и соответствует номерам каротиноидов в таблице. Результаты по содержанию каждого каротиноида у C. glaucum в экспериментальном и контрольном аквариумах представлены как доля (%) от ССК. Всего при использовании ВЭЖХ и МС было выделено и идентифицировано 11 каротиноидов, включая сложные эфиры (рис. 3). Состав остатков жирных кислот для этерифицированных каротиноидов не определялся. На хроматограммах, помимо каротиноидов, есть ряд пиков хлорофилла и их производных, которые присутствуют в пищеварительной системе моллюска. В табл. 1 представлены результаты качественного состава каротиноидов контрольной и опытной группы моллюсков C. glaucum, структурные формулы каротиноидов приведены на рис. 4 [16].

Рис. 4.

Структурные формулы каротиноидов C. glaucum [16].

Fig. 4. Structural formulae of carotenoids in C. glaucum [16].

Качественный состав каротиноидов Т. viridis. ВЭЖХ хроматограмма пигментов микроводорослей представлена на рис. 5, нумерация пиков соответствует номерам каротиноидов в табл. 1, где также приведены их процентные соотношения (табл. 1). Были идентифицированы каротиновая фракция (соотношение β, β- и β, ε-изомеров не было определено), лютеин, зеаксантин, виолаксантин, неоксантин.

Рис. 5.

ВЭЖХ экстракта суммарных каротиноидов зеленых микроводорослей T. viridis. По оси ординат: интенсивность при 450 нм; по оси абсцисс – время, мин. Обозначения пиков: 1 – Carotene (β, β- и β, ε), Chl – хлорофилл, 7 – лютеин, 8 – зеаксантин, 11 – виолаксантин, 12 – неоксантин.

Fig. 5. HPLC of the total carotenoid extract from the green microalgae T. viridis. Ordinate: intensity at 450 nm; abscissa – time, min. Peak designations: 1 – carotene (β, β- and β, ε-), Chl – chlorophyll, 7 – lutein, 8 – zeaxanthin, 11 – violaxanthin, 12 – neoxanthin.

Идентификация каротиноидов ССК моллюсков и микроводорослей проводилась по следующим хроматографическим и масс-спектрометрическим данным:

β-каротин – время удерживания (R_t) 2.72 мин, максимумы поглощения в элюенте (λ_max) 425, 449, 479, соотношение %III/II 41, m/z иона [M+H]⁺ 537;

Эфир гетероксантина – R_t 2.88 мин (30.5 мин после омыления), λ_max 426, 447, 477, %III/II 42;

Эфир мактраксантина¹ – R_t 2.95 мин (33.0 мин после омыления), λ_max 418, 441, 470, %III/II 88, [M+H]⁺ 637 (после омыления);

Эфир фукоксантина – R_t 3.73 мин, λ_max 448, (468), %III/II 0;

Эфир мактраксантина² – R_t 3.89 мин (32.8 мин после омыления), λ_max 417, 441, 470, %III/II 90, [M+H]⁺ 637 (после омыления);

Лютеин – R_t 12.98 мин, λ_max 424, 446, 475, %III/II 66, [M+H]⁺ 569;

Зеаксантин – Rt 13.82 мин, λ_max 451, 478, %III/II 16, [M+H]⁺ 569;

Диатоксантин – Rt 14.70 мин, λ_max 449, 476, %III/II 62;

Аллоксантин – Rt 15.60 мин, λ_max 424 448, 477, %III/II 68;

Диадиноксантин – Rt 18.34 мин, λ_max 424, 446, 475, %III/II 66, [M+H]⁺ 583;

Фукоксантин – Rt 25.00 мин, λ_max 449, (469), %III/II 0, %III/II 66, [M+H]⁺ 659, [M+Na]⁺ 681, выделенная фракция неразделима со стандартом, выделенным из Laminaria sp.;

Виолаксантин – Rt 26.31 мин, λ_max 418, 441, 471, %III/II 92, [M+H]⁺ 601;

Неоксантин – Rt 29.10 мин, λ_max 415, 438, 461, %III/II 80, [M+H]⁺ 601;

Гетероксантин – Rt 30.45 мин, λ_max 425, 449, 478, %III/II 58, [M+H]⁺ 601;

Мактраксантин – Rt 32.88 мин, λ_max 418, 442, 471, %III/II 91, [M+H]⁺ 637;

Мактраксантин (цис-изомер) – R_t33.90 мин, λ_max 418, 440, 471, %III/II 94,[M+H]⁺ 637.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что в неблагоприятных условиях у моллюсков (и у других организмов) происходит временное повышение ССК, что связано с попыткой организма адаптироваться к неблагоприятным условиям среды обитания [14].

Естественная среда обитания популяции C. glaucum на рыхлой песчаной почве в Казачьей бухте г. Севастополя представляла собой обильные заросли зеленых морских макрофитов – таких как Cladophora, Ulva, а также Zoostera. Часто раковины моллюсков обрастали разнообразными зелеными и бурыми водорослями. Исследования подобных обрастаний на примере двустворчатого моллюска Anadara kagoshimensis, сходного с сердцевидкой по типу питания, показали благоприятное влияние экзометаболитов моллюсков на рост микро- и макрофитов [17].

В опытном варианте питание моллюсков C. glaucum монокультурой T. viridis привело к увеличению концентрации β-каротина и появлению диадиноксантина в тканях, в то время как фуко-ксантин, характерный для диатомовых и динофитовых микроводорослей, заметно снизился из-за его отсутствия в спектре питания. Вероятно, отсутствие полноценного питания приводило в опытном варианте к смертности 20% особей.

Согласно табличным данным, основными каротиноидами C. glaucum являются мактраксантин и гетероксантин (включая их сложные эфиры и изомеры), которые составляют около 70% от ССК. Гетероксантин является основным каротиноидом желто-зеленых жгутиковых микроводорослей [18]. Макраксантин, единственный каротиноид C. glaucum животного происхождения, впервые был изучен на японских моллюсках Mactra chinensis [19]. Как единственный каротиноид животного происхождения, который способен образовываться в тканях сердцевидки посредством трансформации растительного каротиноида, поступающего с пищей, его можно отнести к видоспецифичным, т.е. характерным для данного вида моллюска-сестенофага. Возможным метаболическим предшественником мактраксантина является виолаксантин [20].

Другой характеристикой метаболизма каротиноидов у C. glaucum является этерификация основных каротиноидов. Это явление широко распространено у моллюсков [21, 22] и, вероятно, связано с возможностью дополнительного быстрого извлечения свободных каротиноидов через их эфиры, если животные испытывают дефицит в спектре питания.

Состав каротиноидов микроводоросли T. viridis (табл. 1) хорошо согласуется с ранее опубликованными данными [23]. В ходе эксперимента в опытном варианте у C. glaucum наблюдались появление диадиноксантина, рост неоксантина и относительно стабильная концентрация гетероксантина, несмотря на его отсутствие в T. viridis. Вероятно, появление диадиноксантина в тканях C. glaucum в экспериментальной группе может указывать на превращение неоксантиновой алленовой связи, которая происходит при элиминации воды, в ацетиленовую с образованием диадиноксантина. Подобное преобразование концевой группы описано для мидии Mytilus edulis [24]. Наряду с прямой ассимиляцией гетероксантина из микроводорослей (в контрольной группе), его возможным предшественником (в экспериментальной группе) может быть диадиноксантин: аналогичное превращение 3-гидрокси-5,6-эпоксигруппы приведет к образованию гетероксантина (рис. 4). Подобная трансформация была предложена ранее для мидии Mytilus edulis [4].

При изменениях состава каротиноидов, вызванных ассимиляций пигментов из T. viridis, наблюдалось появление геометрического изомера мактраксантина с неидентифицированным положением двойной цис-связи. Снижение уровня сложных эфиров мактраксантина, вызванное, скорее всего, отсутствием полноценного питания, сопровождалось увеличением концентрации свободного мактраксантина и появлением его цис-изомера. Подобные трансформации каротиноидов (переход изомерных форм) сопровождаются повышением антиоксидантных свойств этого каротиноида [25]. Это может быть связано с попыткой моллюска адаптироваться к неблагоприятным условиям питания в опыте.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, методами ВЭЖХ и МС был определен состав пигментов моллюска C. glaucum. Он включает 8 каротиноидов (β-каротин, аллоксантин, лютеин, неоксантин, диадиноксантин, фукоксантин, гетероксантин, мактраксантин (цис- и транс-изомеры)) и 4 эфира каротиноидов, что составляет 90% ССК. Состав каротиноидов Tetraselmis viridis был представлен β, β-каротином, лютеином, зеаксантином, виолаксантином, неоксантином.

Шестидневная диета моллюсков C. glaucum на монокультуре T. viridis сопровождалась увеличением ССК в тканях моллюсков, главным образом за счет каротиноидов, характерных для этого вида микроводорослей. С другой стороны, происходило уменьшение (до полного исчезновения) других растительных пигментов – гетероксантина, фукоксантина и их эфиров. Снижение концентрации эфиров мактраксантина сопровождалось увеличением его количества в свободном состоянии и появлением цис-изомера. Смертность моллюсков в опыте (гибель 20% особей) свидетельствует о неблагоприятном влиянии такой монодиеты на C. glaucum и неспособности этого вида к адаптации в подобных условиях.

Большинство каротиноидов моллюска C. glaucum накапливаются из спектра питания без дополнительных преобразований. Исключениями являются процессы этерификации гетероксантина, мактраксантина и фукоксантина; в случае недостатка гетероксантина возможна конверсия: неоксантин → диадиноксантин → гетероксантин, а также образование мактраксантина и его изомеризация. В роли предшественника мактраксантина возможен виолоксантин, но он не был обнаружен в тканях моллюсков. Мактраксантин является видоспецифичным для этого типа моллюсков.