Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 513, № 1, стр. 570-574

Салициловая кислота (СК) является полифункциональным регулятором фенольной природы, который участвует во многих физиологических процессах у растений, включая дыхание, фотосинтез, транспирацию и водный обмен [1, 2]. Она также участвует в регуляции морфогенеза, движения устьиц, транспорта веществ, термогенеза, формировании устойчивости растений к патогенам и в их адаптации к некоторым абиотическим стрессорам, таким, в частности, как тяжелые металлы [1–3].

Известно, что одной из основных причин отрицательного воздействия тяжелых металлов на растения является нарушение структуры и функций фотосинтетического аппарата (ФСА), приводящее к торможению их роста и развития, и в конечном итоге к снижению продуктивности [3, 4]. Поэтому изучению защитного действия СК, направленного на поддержание активности ФСА в условиях избытка тяжелых металлов, уделяется в последние годы повышенное внимание. При этом обнаружено, что в присутствии таких металлов, как кадмий, ртуть или цинк обработка СК растений способствует поддержанию нативной ультраструктуры хлоропластов [5] и фотохимической активности фотосистем [6], а также необходимого уровня фотосинтетических пигментов [7, 8], что обеспечивает высокую скорость фотосинтеза [5]. Кроме того, обнаружено, что у обработанных СК растений, испытывающих кадмиевый стресс, экзогенная СК вызывает увеличение активности РУБИСКО и ФЕП-карбоксилазы [5].

В последнее время изучается роль СК в регуляции активности цинксодержащего фермента карбоангидразы (КА, КФ 4.2.1.1), который ускоряет взаимопревращение форм неорганического углерода и обеспечивает РУБИСКО молекулами CO₂ [9–11]. В листьях высших растений КА локализована в строме хлоропластов и цитоплазме и является одним из наиболее массовых белков, уступая по количеству только РУБИСКО [9]. Представители разных семейств КА (α-, β-, γ-типы) участвуют в дыхании и фотосинтезе, движении устьиц и биосинтезе липидов [9, 11]. Обсуждается также вовлечение КА в сигналинг СК, поскольку она относится к СК-связывающим белкам – SABPs (Salicylic Acid Binding Protein) [10–12]. Взаимодействие СК с КА (SABP3) приводит к изменению активности последней, однако, характер этих изменений может быть различным, в том числе в зависимости от условий роста растений [10, 13]. Например, обнаружено, что обработка СК мяты (Mentha piperita L.) вызывает увеличение активности КА в присутствии кадмия, что способствует поддержанию фотосинтетической активности и снижению негативного эффекта металла на растения [14]. В отношении возможного влияния СК на активность КА при избытке цинка в окружающей среде данные в известной нам литературе отсутствуют. Отмечаются только снижение активности КА в условиях дефицита цинка [11] и повышение ее активности при добавлении этого металла в среду роста [15].

Исходя из вышеизложенного, целью данной работы было изучение влияния обработки СК семян на активность КА, скорость фотосинтеза, устьичную проводимость и содержание пигментов в листьях растений пшеницы, находящихся в условиях избытка цинка в корнеобитаемой среде.

Исследования проводили на растениях яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Злата. Семена были предоставлены ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр “Немчиновка”». Часть семян проращивали в течение трех суток на дистиллированной воде (вариант “без обработки”), другую часть – в течение первых суток выдерживали на растворе СК, затем отмывали и продолжали проращивать на дистиллированной воде (вариант “обработка СК семян”). Концентрация СК (100 мкМ) и длительность обработки (1 сут) были выбраны на основании предварительных опытов. Проклюнувшиеся семена обоих вариантов высаживали в пластиковые контейнеры (объемом 1.4 л) с питательным раствором Хогланда-Арнона с оптимальным (2 мкМ) или избыточным (1500 мкМ) содержанием цинка. Растения выращивали в камере искусственного климата при температуре 22°С, относительной влажности воздуха 60–70%, ФАР 180 мкмоль/(м²·с) и 14-часовом фотопериоде в течение 11 сут. После чего в их листьях измеряли активность КА, интенсивность фотосинтеза, содержание фотосинтетических пигментов и устьичную проводимость.

Активность КА определяли по изменению оптической плотности реакционной смеси (100 мМ K-фосфатный буфер, pH 7.8 и 1.5 mM pNPA) после добавления ферментного экстракта при 348 нм [16]. Измерение интенсивности фотосинтеза и устьичной проводимости проводили с использованием системы для исследования СО₂-газообмена и водяных паров HСM-1000 (“Walz”, Германия). Скорость ассимиляции CO₂ измеряли при интенсивности ФАР 200 мкмоль/(м²·с). Содержание пигментов определяли спектрофотометрически, экстрагируя их 80% ацетоном. Все измерения проводили на втором листе. Биологическая повторность составляла 3–5 растений в зависимости от показателя, аналитическая повторность – 3-кратная. Весь опыт повторяли дважды. На рисунках и в таблицах приведены средние значения и их стандартные ошибки. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программ Microsoft Excel 2007 и PAST 4.0. Статистически значимо различающиеся величины каждого изученного показателя (при p < 0.05) обозначены разными латинскими буквами.

В ходе исследований установлено, что при оптимальном содержании цинка (Zn 2) у растений пшеницы после обработки СК семян активность КА была несколько выше, чем у растений, семена которых не подвергались обработке (рис. 1а). Подобный эффект ранее был обнаружен при опрыскивании СК растений горчицы (Brassica juncea L. Czern & Coss) [17] и томата (Lycopersicon esculen-tum L.) [18] в оптимальных условиях роста.

Рис. 1.

Активность карбоангидразы (а) и интенсивность фотосинтеза (б) в листьях пшеницы при оптимальном (2 мкМ) или избыточном (1500 мкМ) содержании цинка. Здесь и далее: 1 – растения выращены из семян, необработанных СК; 2 – растения выращены из семян, обработанных СК (100 мкМ).

При избытке цинка (Zn 1500) в корнеобитаемой среде активность КА снижалась как у необработанных СК растений, так и у обработанных, но у последних в большей степени (рис. 1а). Об отрицательном воздействии тяжелых металлов, включая цинк, на синтез ферментов, их структуру и функционирование в растительных клетках уже неоднократно указывалось ранее [3, 4, 19]. К примеру, присутствие в среде ионов свободного цинка вызывало существенное снижение эстеразной и фосфотазной активности у растений рапса (Brassica napus L.) [19]. Однако, как влияет СК на активность ферментов у растений в условиях избыточного содержания цинка, пока практически неизвестно. Результаты нашего исследования показали, что обработка СК усиливает ингибирующее действие избытка цинка на активность КА (рис. 1а). Как известно из литературы, СК в концентрациях, превышающих физиологические, может снижать активность КА, как это показано на растениях табака (Nicotiana benthamiana Domin) [12]. Можно предположить, что в условиях избытка цинка происходило повышение эндогенного уровня СК в клетках растений, что, например, наблюдалось ранее при действии других тяжелых металлов [1]. Кроме того, сама обработка могла усилить накопление СК вследствие гидролиза ее связанных форм или синтеза новых молекул.

В ходе экспериментов было также выявлено, что при оптимальном содержании цинка (Zn 2) обработка СК семян не сказывается на интенсивности фотосинтеза у пшеницы. Скорость этого процесса оказалась практически равной у растений в обоих вариантах опыта (рис. 1б). Избыток цинка (Zn 1500) вызывал заметное торможение (по сравнению с Zn 2) скорости этого процесса, причем у необработанных СК растений в большей степени, чем у обработанных (рис. 1б).

Поскольку скорость фотосинтеза во многом зависит от фотосинтетических пигментов, нами было определено содержание хлорофиллов и каротиноидов в листьях пшеницы. Обнаружено, что если при оптимальном содержании цинка (Zn 2) обработка СК семян не приводила к увеличению содержания изученных пигментов, то в условиях избытка металла (Zn 1500) их уровень превышал таковой у необработанных растений (табл. 1). Подобный эффект мог быть обусловлен участием СК в регуляции активности генов синтеза хлорофилла. В пользу этого предположения свидетельствуют, в частности, данные о повышении у обработанных СК растений мелиссы (Melissa officinalis L.) содержания транскриптов гена CHLG, кодирующего один из ферментов метаболизма хлорофилла – хлорофиллсинтазу, при действии ртути [7]. Нами также зафиксировано, что в условиях избытка цинка обработка СК семян способствовала увеличению по сравнению с необработанными растениями содержания в листьях каротиноидов (табл. 1), которые, как известно, не только участвуют в поглощении световой энергии, но и в защите клеток от негативного действия АФК [8].

Помимо пигментов, скорость фотосинтеза в значительной мере зависит от степени открытия устьиц и устьичной проводимости. В наших исследованиях при оптимальном содержании цинка (Zn 2) обработка СК приводила к повышению устьичной проводимости, а при избытке цинка (Zn 1500) в корнеобитаемой среде она обеспечивала меньшее по сравнению с необработанными растениями снижение устьичной проводимости (табл. 1), т.е. положительно сказывалась на активности ФСА в этих условиях. Заметим, что имеются данные о том, что в регуляции работы устьичного аппарата может участвовать КА. В частности, у двойного мутанта кукурузы (Zea mays L.) ca1ca2 со сниженной активностью КА наблюдалась более высокая устьичная проводимость по сравнению с растениями дикого типа [20]. Поэтому нельзя исключить, что уменьшение активности КА, регистрируемое в наших опытах у растений в варианте с обработкой СК семян, явилось одной из причин увеличения у них устьичной проводимости.

Таким образом, нами впервые обнаружено, что обработка СК семян приводит в дальнейшем в оптимальных условиях роста растений пшеницы к усилению (по сравнению с необработанными растениями) в листьях активности КА и увеличению устьичной проводимости, не сказываясь при этом на скорости фотосинтеза. При избытке в корнеобитаемой среде цинка у растений, выращенных из обработанных СК семян, наблюдается снижение активности КА, но скорость фотосинтеза при этом поддерживается на более высоком уровне, чем у необработанных растений, очевидно, за счет более высокого содержания хлорофиллов и каротиноидов, и устьичной проводимости. Кроме того, из полученных данных и анализа литературы можно, на наш взгляд, сделать также ряд обобщений. Во-первых, результаты проведенного исследования служат дополнительным аргументом в пользу представления о том, что устойчивость к тяжелым металлам, и избытку цинка в частности, складывается из большого числа защитно-приспособительных реакций [3, 4, 7], в которых наряду с другими факторами негормональной природы и гормонами принимает участие СК. Во-вторых, защитный эффект СК на растения носит достаточно пролонгированный характер, поэтому предпосевная обработка СК семян способна вызывать увеличение устойчивости растений пшеницы к избытку цинка, находящихся на более поздних стадиях развития. В-третьих, в селекционно-генетических исследованиях, направленных на выявление генотипов, отличающихся повышенной металлоустойчивостью, можно использовать в качестве одного из дополнительных диагностических признаков способность растений реагировать на избыток тяжелых металлов в окружающей среде усиленным образованием СК и/или характеризующихся повышенным содержанием СК в листьях.