Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 513, № 1, стр. 595-598

Форум-домены – это области хромосом эукариот длиной около 100 kb, расположенные между горячими точками двухцепочечных разрывов ДНК (ДЦР) в хромосомах эукариот [1–3]. Эти домены содержат координированно экспрессирующиеся гены [3]. Природа такой экспрессии пока не понятна. Однако известно, что на границах этих доменов связываются белки PARP1 и HNRNPA2B1 [3]. Известно, что PARP1, наряду с участием в репарации ДНК, является регулятором структур хромосом и транскрипции, а HNRNPA2B1 участвует в сплайсинге пре-мРНК и может функционировать вместе PARP1 [3]. Двухцепочечные разрывы ДНК являются наиболее частыми и опасными для клетки повреждений хромосом эукариот [4]. Эти разрывы с неизбежностью появляются in vivo как при эндогенных физиологических процессах (транскрипция, репликация, транспозиции, рекомбинации), так и в результате ряда экзогенных химических или физических воздействий [5–7]. Стабильность генома обеспечивают мощные механизмы репарации ДНК, которые полностью залечивают все разрывы, иначе бы происходила гибель клетки [8]. Обнаружено, что двухцепочечные разрывы ДНК чаще всего происходят в активно работающих генах, контролирующих дифференцировку, развитие и морфогенез [3]. Предполагается, что это связано с активной транскрипцией, при которой образуются так называемые Р-петли (R-loops), области расплетенной ДНК, в которых синтезируется РНК.

Для того, чтобы выяснить, какие еще белки связываются с концевыми областями форум-доменов, и как это может быть связано с координированной экспрессией генов, мы использовали полногеномные данные картирования горячих точек ДЦР и доступные данные ChIP-Seq для десяти белков в линии клеток HEK293T. В результате впервые обнаружено, что места горячих точек ДЦР, которые ограничивают эти домены, значительно обогащены местами связывания ко-активатора транскрипции CBP и белка RAD21, вовлеченного в репарацию ДНК. Эти данные могут объяснять координированную экспрессию генов в доменах, а также свидетельствуют об активной репарации ДНК в областях горячих точек ДЦР.

Полногеномные данные о сайтах ДЦР в клетках HEK293T c точностью до 1 bp были взяты из ранее полученной нами базы данных GSE201829. Чтения двух реплик из базы данных выравнивали на секвенированный геном человека (версия GRCh37/hg19 p.13). Соответствие данных картирования ДЦР в репликах было достаточно высоким (Pearson = 0.88, Spearman = 0.93). Для анализа были выбраны наиболее частые разрывы в ДНК (горячие точки ДЦР), которые ограничивают домены ДНК длиной 100 kb и более.

Результаты экспериментов ChIP-Seq для белков CBP, RAD21, TAF15, FUS, ELK4, HDGF, TRIM28, FOXM1, TCF7L2, LEF1и для сайтов, доступных для DNase I, взяты из базы данных ENCODE (accession numbers: GSM1239075, GSM1081542, GSM1895987, GSM1895985, ENCFF658HSX, ENCFF347GJE, ENCFF340FXG, ENCFF784PBW, ENCFF851WEQ, ENCFF112HIM и ENCFF716SFD соответственно).

Профили связывания указанных белков и сайтов DNase I вокруг горячих точек ДЦР (±1.5 kb) получали интерактивно с помощью программы S-eqPlots [9]. При этом использовали 10-bp шаг профилирования и нормализацию по z-критерию.

На рис. 1 представлены полногеномные профили мест связывания некоторых белков и сайтов DNase I на границах форум-доменов.

Рис. 1.

Профили связывания белков и сайтов DNase I на границах форум-доменов в линии клеток HEK293T. По оси X указаны расстояния от центра горячих точек ДЦР (±1.5 kb). По оси Y указаны значения z-критерия (± 4). Размытость на кривых указывает на разбросы данных при полногеномном анализе.

Оказалось, что CBP связывается с горячими точками ДЦР. Ранее было обнаружено, что конкретные сайты разрывов в горячих точках рассеяны во фрагментах ДНК длиной 20–100 bp. Узкий пик профиля связывания CBP указывает на примерное соответствие размерам горячих точек ДЦР. Этот белок постоянно экспрессируется и является ацетилтрансферазой, которая ацетилирует гистон H3 по лизину 27 (H3K27ac) на энхансерах и промоторах [10]. Похожий профиль связывания обнаружил и белок RAD21. Он входит в кохезиновый комплекс наряду с белками SMC1a, SMC3, SCC3 и STAG2 [11]. Комплекс вовлечен в репарацию ДЦР, а также выполняет ряд других функций в ядре. Связывание RAD21 было ожидаемым, поскольку горячие точки ДЦР должны репарироваться. Ранее было обнаружено связывание белков UBF, CTCF, TCF7L2, KAP1, PARP1 и H2AX в девяти горячих точках ДЦР в генах рРНК (Плеяды), которые являются самыми хрупкими сайтами в хромосомах человека [6]. Последние три белка также ассоциированы с репараций ДЦР.

Мы не обнаружили связывание двух других анализируемых белков – TAF15 и FUS – на границах форум-доменов (рис. 1). TAF15 (TATA-Box Binding Protein Associated Factor 15) входит в общий фактор транскрипции TFIID [12], а FUS участвует в сплайсинге пре-мРНК и экспорте зрелых мРНК в цитоплазму [13]. Профили этих белков служат отрицательными контролями в данной работе. Другие белки (ELK4, HDGF, TRIM28, FOXM1, TCF7L2, LEF1) также не обнаружили связывания на границах доменов (не показано). Они были выбраны, поскольку все они являются факторами транскрипции и, как мы предполагали, могут участвовать в регуляции экспрессии в форум-доменах, связываясь на их границах.

Ранее было описано, что горячие точки ДЦР образуются in vivo с помощью эндогенных ферментов, тогда как DNase I чувствительные сайты выявляются   in vitro   с   помощью   экзогенной ДНКазы [3]. Этот вывод независимо подтверждается профилем сайтов, чувствительных к ДНКазе, указанном на рис. 1. Природа горячих точек ДЦР иная, эти точки, как видно, не доступны экзогенному ферменту и, следовательно, расположены в закрытом хроматине.

Данные о профилях не отражают возможной сложности распределения мест связывания CBP, RAD21 и их взаимоотношений с горячими точками ДЦР в хромосомах. Для выяснения этих взаимоотношений мы изучили характер их распределения вдоль хромосом, используя геномный браузер. На рис. 2 приведены две области генома. Одна – 1-Mb область хромосомы 4, другая – 800-kb фрагмент chr10. Видно, что почти всегда пикам ДЦР соответствуют области связывания CBP и RAD21. Иногда на один пик ДЦР приходится целая область мест связывания CBP (область 42.8 Mb во фрагменте chr10). Ранее было показано, что менее частые ДЦР находятся и внутри больших доменов [3]. В целом распределение разрывов в ДНК и мест связывания этих двух белков соответствует данным профилирования (рис. 1).

Рис. 2.

Характер перекрывания областей связывания CBP, RAD21 и горячих точек ДЦР в линии клеток HEK293T человека. (а) область хромосомы 4. (б) область хромосомы 10. Координаты указаны для версии генома человека hg19. Области связывания CBP показаны бирюзовым, RAD21 – красным, а горячие точки ДЦР – синим цветом.

Почему нет однозначного соответствия между местами разрывов в ДНК и сайтами связывания RAD21? Мы предполагаем, что это связано с тем, что данный белок вовлечен не только в репарацию ДНК. Известно, что в составе кохезинового комплекса RAD21 играет важную роль в формировании петель хроматина и в организации 3D структур хромосом [14]. Мы предполагаем, что места связывания RAD21 вне горячих точек ДЦР (рис. 2) указывают на области, в которых когезиновый комплекс образует петли хроматина внутри форум-доменов.

Наши данные указывают на то, что белки CBP и RAD21, выполняя разные функции, вместе участвуют в организации координированной экспрессии в форум-доменах. В процессе формирования петель хроматина CBP может вносить активную метку хроматина H3K27ac. Это может обеспечивать координированную активацию экспрессии в форум-доменах. Ранее было выяснено, что около 80% форум-доменов подвергается сайленсингу во всех хромосомах человека [3]. Возможно, что и координированный сайленсинг генов в форум-доменах может проходить сходным образом. Только неактивные метки в гистоны может вносить другой фермент(ы), например, метку H3K27me3, входящие в комплекс PCR2. Это предположение подкрепляется тем, что данная эпигенетическая метка связана с репарацией ДЦР в ДНК с помощью гомологичной рекомбинации [15]. В настоящее время мы проверяем эти предположения экспериментально.