Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 513, № 1, стр. 586-589

Процесс экспрессии генов состоит из множества этапов, на каждом из которых действуют определенные комплексы белков, регулирующие этот процесс. Комплекс TREX-2, участвующий в экспорте мРНК из ядра, у D. melanogaster состоит из четырех белков: Xmas-2, PCID2, ENY2, Sem1p [1–3]. Некоторые из субъединиц комплекса участвуют и в других этапах экспрессии генов. Известно, что одна из субъединиц комплекса, белок ENY2 также входит в состав комплекса SAGA и взаимодействует с комплексом THO, таким образом, участвуя и в этапе инициации, и в этапе элонгации транскрипции [4–6]. dENY2 также участвует в барьерной активности различных инсуляторов [7, 8]. Белок же PCID2 не только участвует в экспорте мРНК в ядре, но и участвует в транспорте мРНК в цитоплазме [9, 10]. В составе комплекса PCID2 взаимодействует с мРНК в реакциях иммунопреципитации РНК и, возможно, определяет специфичность взаимодействия TREX-2 с мРНК [10]. Несмотря на исследование функций комплекса TREX-2 в течение продолжительного времени, остается не ясным, как комплекс взаимодействует с мРНК [11–17]. При исследованиях на дрожжах было обнаружено, что гомологи Xmas-2 и PCID2 вместе связывают РНК, образуя общую поверхность связывания [18]. У гомолога PCID2 дрожжей за связывание с РНК отвечает домен, располагающийся на С конце белка. Были определены аминокислоты, участвующие во взаимодействии [18]. В нашей работе мы исследовали, принимает ли участие в связывании с РНК данный домен у PCID2 D. melanogaster и необходим ли этот домен для выполнения основных функций PCID2. Исследование взаимодействия PCID2 с мРНК у D. melanogaster проводили, используя метод Pull-down с биотинилированной РНК.

В качестве модельной РНК, с которой было исследовано связывание, была использована мРНК гена ras2, меченная биотином. Так как взаимодействие PCID2 в составе комплекса с данной мРНК было показано ранее в реакциях иммунопреципитации РНК [10]. В эксперименте были использованы экспрессированные в бактериальной системе белки: полноразмерный PCID2 и PCID2^1–360 (PCID2, у которого были удалены 35 аминокислот на С-конце белка). Схема белков представлена на рис. 1а.

Рис. 1.

С-концевой домен PCID2 взаимодействует с мРНК ras2 в экспериментах Pull-down. (a) – доменная структура белка PCID2. На рисунке отмечены взятые в эксперимент полноразмерный белок и PCID2^1–360, у которого на С-конце удалены 35 аминокислот. (б) – фореграмма Вестерн-блот-анализа связывания белков с биотинилированной мРНК ras2. Мембрана была гибридизована с антителами к PCID2 [1]. Дорожки 1, 3 – экспрессированные белки, взятые на связывание; 2, 4 – НБ – фракции белков, не связавшихся с мРНК ras2; 5, 7 – фракции, содержащие связавшиеся с мРНК ras2 белки; 6 – фракция связывания мРНК ras2 со стрептавидин-агарозой.

Белки связывали с биотинилированой мРНК ras2, затем инкубировали со стрептавидин-агарозой и отмывали от несвязавшегося белка раствором, содержащим высокую соль. Связавшийся с мРНК белок был визуализирован при разделении в ПААГ и Вестерн блот гибридизацией с антителами к PCID2 (рис. 1б). Оказалось, что форма PCID2^1–360 связывается с мРНК ras2 гораздо менее эффективно, чем полноразмерный PCID2. Таким образом, у PCID2 D. melanogaster на С-конце белка располагается домен связывания РНК, в тех 35 аминокислотах, которые были удалены. Однако, поскольку связывание белка с РНК ras2 не исчезало совсем, можно предположить, что у PCID2 есть и другой домен связывания РНК.

Влияние данной делеции на основную функцию PCID2 – экспорт мРНК из ядра в цитоплазму было изучено на S2 клетках D. melanogaster. В клетках были проведены нокдаун PCID2 с помощью метода интерференции РНК и трансфекция клеток конструкцией pAC-PCID2^1–360 c HA эпитопом. В качестве контрольных клеток были использованы клетки с нокдауном PCID2 и трансфекцией конструкцией pAC-PCID2 c HA эпитопом (рис. 2а, б).

Рис. 2.

С-концевой домен PCID2 необходим для экспорта мРНК. (а) РНК FISH был выполнен с использованием Cy3-меченного oligo-dT-праймера для визуализации полиА РНК, ядра были окрашены DAPI. Клетки были обработаны двуцепочечной РНК, соответствующей PCID2. Клетки с нокдауном PCID2 были использованы в эксперименте в качестве положительного контроля. Распределение мРНК (зеленый сигнал), клеточное ядро (красный сигнал) показаны для необработанных клеток (норма), при нокдауне PCID2 (контроль), при нокдауне и трансфекции клеток с нокдауном PCID2 полноразмерным PCID2 (+PCID2), при нокдауне PCID2 и трансфекции PCID2^1–360 (+PCID2^1–360) (1000× увеличение). (б) Количественное представление результатов эксперимента на рис. 2а. Столбики показывают процент клеток с нарушенным экспортом мРНК (около 200 клеток было исследовано). (в) – Гистограммы уровня интерференции мРНК pcid2 и уровня трансфекции интерферированных S2 клеток PCID2 и PCID2^1–360.

Анализ уровня нокдауна белка проводился с помощью Вестерн блот гибридизации, процент трансфицированных клеток определялся по количеству клеток при иммуноокрашивании их антителами к HA эпитопу, представлены в виде гистограмм (рис. 2в). В нормальных, необработанных клетках мРНК распределяется неравномерно, преимущественно в цитоплазме. Нокадаун PCID2 приводил к задержке в ядре и перераспределению мРНК в 91% случаев. Трансфекция полноразмерным белком на фоне нокдауна приводила к уменьшению количества аберрантных клеток до 27%. В то же время трансфекция белком PCID2^1–360 не приводила к данному эффекту и количество клеток с задержкой и перераспределением мРНК не менялось (88%). Исходя из данного эксперимента можно предположить, что С-концевой домен необходим для выполнения функций PCID2 в ядре.

Таким образом, в нашей работе мы показали, что С-концевой домен PCID2 D. melanogaster отвечает за взаимодействие белка с РНК и необходим для эффективного экспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Представленные данные также показали, что в отличие от гомолога PCID2 дрожжей, у PCID2 D. melanogaster существует(ют) еще домен(ы) связывания РНК.