Доклады Российской академии наук. Науки о жизни. T. 513, Номер 1, 2023

  1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 513, № 1, 2023

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 513, № 1, стр. 575-580

Синтетические пептидные фрагменты токсина WTX снижают артериальное давление у крыс в состоянии общей анестезии

М. С. Северюхина 1, 2, А. М. Исмаилова 1, Э. Р. Шайхутдинова 1, И. А. Дьяченко 1, Н. С. Егорова 3, А. Н. Мурашев 1, член-корреспондент РАН В. И. Цетлин 3, Ю. Н. Уткин 3, *, **

1 Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Московская область, Пущино, Россия

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Пущинский государственный естественно-научный институт
Пущино, Россия

3 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Москва, Россия

* E-mail: utkin@ibch.ru
** E-mail: yutkin@yandex.ru

Поступила в редакцию 10.07.2023
После доработки 29.07.2023
Принята к публикации 29.07.2023

Полный текст (PDF)

Аннотация

Ранее нами было показано, что необычный токсин WTX из яда кобры Naja kaouthia при внутривенном введении вызывал снижение артериального давления (АД) и повышение частоты сердечных сокращений (ЧСС) у крыс (Ogay et al., 2005). Для идентификации участка молекулы токсина, отвечающего за эти эффекты, нами исследовано влияние синтетических пептидных фрагментов WTX на АД и ЧСС нормотензивных самцов крыс линии Sprague Dawley, находящихся в состоянии общей анестезии, вызванной препаратами Телазол и Ксилазин. Установлено, что пептиды, соответствующие центральной полипептидной петле WTX и стабилизированные дисульфидной связью, при внутривенном введении в концентрациях от 0.1 до 1.0 мг/мл вызывали продолжительное дозозависимое снижение АД. При этом ЧСС повышалась лишь в первые 5–10 мин после введения. Таким образом, фрагменты WTX, соответствующие центральной полипептидной петле, воспроизводят снижение АД, вызываемое токсином.

Ключевые слова: необычный токсин, WTX, артериальное давление, частота сердечных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Токсин WTX из яда кобры Naja kaouthia относится к семейству трехпетельных токсинов [1, 2], состоит из 65 аминокислотных остатков и содержит пять дисульфидных связей (рис. 1) [3]. Один из дисульфидов расположен в N-концевой петле, что характерно для нетипичных (non-conventional) токсинов змей [4]. WTX проявляет свойства как α-нейротоксинов змей, так и мускариновых токсинов: он блокирует никотиновые холинорецепторы (нХР) мышечного (αβγδ) и α7-типа, а также аллостерически взаимодействует с мускариновыми холинорецепторами [5]. Ранее было показано, что артериальное давление (АД) и частота сердечных сокращении (ЧСС) напрямую зависят от функции нХР, а активация или блокада различными агонистами или антагонистами приводит к изменениям гемодинамических параметров [6].

Рис. 1.

Пространственная структура токсина WTX (аналог P33A), установленная методом ЯМР (код PDB – 2MJ0). N и C обозначают N- и C-концевые остатки соответственно. Римские цифры обозначают номера полипептидных петель. Дисульфидные связи показаны в виде стержней (выделены зеленым цветом).

Имеющиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что наибольший вклад во взаимодействие с нХР вносит центральная петля II WTX (рис. 1) [7, 8]. Эта петля взаимодействует с ацетилхолин-связывающим карманом нХР, при этом петля I, предположительно, взаимодействует с мембраной, окружающей рецептор [8]. Важная роль петли II во взаимодействии с нХР была установлена ранее для α-нейротоксинов змей [9, 10]. Показано также, что петля II WTX играет существенную роль во взаимодействии с мускариновым холинорецептором [11], и это согласуется с данными для мускариновых токсинов [12].

Ранее было установлено, что внутривенное введение WTX вызывает дозoзависимое снижение артериального давления (АД) и повышение частоты сердечных сокращении (ЧСС), и в этом процессе участвуют холинергические рецепторы [13]. Учитывая тот факт, что полипептидная петля II WTX участвует во взаимодействии токсина с холинорецепторами, мы решили проверить, будут ли пептидные фрагменты аминокислотной последовательности WTX, соответствующие этой петле, оказывать влияние на АД и ЧСС. Следует отметить, что ранее синтетический фрагмент, включающий петлю II, циклизованную дисульфидными связями, был получен для нейротоксина кобры N. naja philippinensis [14]. Пептидный фрагмент сохранил способность взаимодействовать с нХР, присущую исходному токсину, хотя и гораздо менее эффективно. Методом пептидного синтеза были синтезированы два пептидных фрагмента токсина WTX (WTXf1 и WTXf2), N- и C-концевые участки которых соединены дисульфидной связью, и исследовано влияние этих пептидов на АД и ЧСС крыс, находящихся в условиях общей анестезии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пептиды WTXf1 (17 а.о.) и WTXf2 (21 а.о.) получили методом твердофазного синтеза по методике, использованной ранее для синтеза фрагмента центральной петли трех-петельного белка человека; пространственная структура фрагмента была фиксирована введением дисульфида [15]. Чистоту пептидов подтверждали с помощью аналитической ВЭЖХ, а молекулярные массы определяли с помощью масс-спектрометрии. Молекулярная масса WTXf1 составила 2240.2 Да, а WTXf2 – 2618.4 Да, что в пределах ошибки измерений соответствует расчетным величинам.

В опытах использовали самцов крыс аутбредной линии Sprague-Dawley статуса SPF c массой тела 250–300 г (НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН). Все процедуры были одобрены комиссией ФИБХ РАН по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных (протокол-заявка № 910/22). Для исследования отобрали животных с исходным значением АД в пределах 100–140 мм. рт.ст., соответствующих норме [16]. Животным под наркозом препаратами телазол (4 мг/кг) и ксилазин (12 мг/кг, внутримышечно) [17] через надрез на вентральной стороне шеи имплантировали катетеры в общую сонную артерию и яремную вену. Исследуемые вещества и растворитель (физиологический раствор) вводили через внутривенный катетер в объеме 1 мл/кг. Для регистрации АД и ЧСС прямым способом артериальный катетер подключали к установке Powerlab ML125 (AD Instrument, Australia).

Животных распределяли на 7 групп: 1 группа – контроль с введением физиологического раствора (n = 6); 2–4 группы – введение WTXf1 в концентрациях 0.1 мг/кг (n = 6), 0.3 мг/кг (n = 3) и 1 мг/кг (n = = 1); 5–7 группы – WTXf2 в концентрациях 0.1 мг/кг (n = 3), 0.3 мг/кг (n = 6) и 1 мг/кг (n = 3) соответственно. Эксперимент ставился в условиях общей анестезии (телазол + ксилазин). После 15‑минутной регистрации исходных значений (baseline) АД и ЧСС через венозный катетер животным вводили препарат согласно групповой принадлежности и продолжали регистрировать параметры в течение 90 мин после введения веществ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В проводившихся ранее экспериментах крысам вводили WTX в дозах 0.5, 1 и 2 мг/кг [13]. Мы начали исследование активности синтетических пептидов с дозы 1 мг/кг. При введении животному пептида WTXf1 в такой дозе произошло катастрофическое падение давления до 40 мм. рт. ст., сопровождавшееся гибелью животного. Вследствие этого более детального исследования WTXf1 в дозе 1 мг/кг не проводили.

При введении WTXf1 в дозе 0.3 мг/кг в первые пять минут наблюдалось резкое падение АД более чем на 50%; затем оно постепенно увеличивалось, но оставалось сниженным на 30% от исходных значений. Примерно через 30 мин после введения начался повторный спад АД, к концу регистрации значения также были на 45% ниже исходной величины (рис. 2а). Необходимо отметить, что два животных из этой группы погибло сразу после эксперимента, поэтому дальнейшее исследование WTXf1 в этой дозе было остановлено.

Рис. 2.

Изменения АД (а, в) и ЧСС (б, г) при внутривенном введении крысам пептидов WTXf1 (а, б) и WTXf2 (в, г). * p ≤ 0.05 по U-критерию Манна–Уитни для групп WTXf1 (0.1 мг/кг) и WTXf2 (0.1 мг/кг) в сравнении с контрольной группой; #p ≤ 0.05 по U-критерию Манна–Уитни для групп WTXf1 (0.3 мг/кг) и WTXf2 (0.3 мг/кг) в сравнении с контрольной группой. &p ≤ 0.05 по U-критерию Манна–Уитни группы WTXf2 (1 мг/кг) в сравнении с контрольной группой.

При введении WTXf1 в дозе 0.1 мг/кг наблюдалось резкое падение АД на 40% ниже исходного значения, однако к 25-й минуте оно практически вернулось к начальному уровню. После 25-й минуты регистрации АД достоверно снизилось и стабильно оставалось сниженным на 25% ниже исходного уровня до конца регистрации (рис. 2а).

На протяжении всего времени регистрации показателей, достоверных изменений АД у животных в контрольной группе не наблюдалось.

Введение WTXf2 в дозе 1 мг/кг привело к достоверному падению АД на 45% от исходных значений на 5-й минуте. До 40-й минуты давление имело тенденцию к восстановлению, но оставалось достоверно сниженным на 27% от исходного уровня до конца регистрации (рис. 2в). Введение WTXf2 в дозе 0.3 мг/кг вызвало падение АД на 31% в первую минуту регистрации с последующим восстановлением до 87% от исходных значений на 20-й минуте. Далее АД оставалось достоверно сниженным до конца записи (80–83% от исходных значений к 90-й минуте) (рис. 2в). Введение WTXf2 в дозе 0.1 мг/кг привело к падению АД на 45% в первую минуту с восстановлением до исходных значений в течение 3–4 мин. Далее наблюдалось кратковременное повышение АД на 5%, которое не являлось статистически достоверным и продолжалось до 15-й минуты после введения препарата. Затем АД постепенно снижалось на 26% по сравнению с исходными значениями в конце регистрации (рис. 2в).

В контрольной группе после введения физиологического раствора не наблюдалось статистически значимых изменений ЧСС в течение всего периода регистрации.

В группах с введением WTXf1 в дозе 0.1 мг/кг наблюдалось статистически значимое повышение ЧСС относительно контрольной группы на 5–10-й минутах записи и на 5-й минуте в дозе 0.3 мг/кг (рис. 2б). В группах, которым вводили WTXf1 в дозах 0.3 и 1 мг/кг, ЧСС статистически значимо повышалась до 5-й минуты регистрации (рис. 2г), тогда как в группе с введением WTXf2 в дозе 0.1 мг/кг статистически значимых различий относительно контрольной группы не наблюдалось.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее перспективными для дальнейшего более детального исследования являются дозы 0.1 и 0.3 мг/кг для WTXf1 и WTXf2 соответственно. Нами проведено сравнение влияния этих доз на АД и ЧСС (рис. 3). В общем наблюдаемые эффекты достаточно похожи. Однако имеются и некоторые различия. Так, для WTXf1 в дозе 0.1 мг/кг наблюдалось статистически значимое снижение АД на протяжении всего эксперимента, в то время как WTXf2 в дозе 0.3 мг/кг вызывал статистически значимое снижение АД с 1-й по 10-ю минуту и с 30-й минуты до конца регистрации (рис. 3а). Статистически значимое повышение ЧСС относительно исходных значений для WTXf1 в дозе 0.1 мг/кг наблюдалось с 1-й до 20-й минуты после введения, для WTXf2 в дозе 0.3 мг/кг лишь с 1-й по 5-ю минуту (рис. 3б). Таким образом, влияние WTXf1 более выражено и требует меньших доз для достижения сходных изменений АД по сравнению с WTXf2. Однако WTXf1 в дозах 0.3 и 1 мг/кг в условиях наркоза оказывает стойкое снижение АД и проявляет токсические свойства. Критическое снижение АД может указывать на дозозависимое угнетающее действие WTXf1 на вазоконстрикторный эффект симпатической нервной системы [18]. Интересно отметить, что эффективная доза WTXf1 (0.1 мг/кг  =  0.045 мкмоль/кг) существенно ниже, чем у известных низкомолекулярных  препаратов: 6.0–15.0 мкмоль/кг для фентоламина [19, 20] и 20.0–80.0 мкмоль/кг для каптоприла [21].

Рис. 3.

Сравнение влияния WTXf1 и WTXf2 в дозах 0.1 и 0.3 мг/кг, соответственно, на АД (а) и ЧСС (б). * p ≤ 0.05 для WTXf1 в дозе 0.1 мг/кг по сравнению с исходными значениями (Т-тест для зависимых выборок), # p ≤ 0.05 для WTXf2 в дозе 0.3 мг/кг по сравнению с исходными значениями (Т-тест для зависимых выборок).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные в ходе исследования различных доз двух исследуемых фрагментов токсина WTX на крысах линии Sprague-Dawley, в состоянии наркоза, выявили дозозависимое гипотензивное действие с первой минуты введения, что указывает на способность каждого из фрагментов оказывать прямое миотропное действие на сосуды. Также установлено, что введение фрагментов WTX статистически значимо повышает показатели ЧСС в первые 5–10 мин после введения с последующим быстрым возвращением к первоначальным значениям. Таким образом, фрагменты WTX, соответствующие аминокислотной последовательности центральной петли токсина, проявляют гипотензивное действие, наблюдавшееся ранее для целого токсина [13]. Поскольку исследованные пептиды составляют менее 1/3 аминокислотной последовательности WTX, они являются более перспективными в качестве основы для создания лекарственных препаратов, чем сам токсин. Особенно это касается более короткого пептида WTXf1, обладающего к тому же большей активностью.

Список литературы

  1. Kessler P., Marchot P., Silva M., et al. The three-finger toxin fold: a multifunctional structural scaffold able to modulate cholinergic functions. // J. Neurochem. 2017. V. 142. Suppl. 2. P. 7–18.

  2. Nirthanan S. Snake three-finger α-neurotoxins and nicotinic acetylcholine receptors: molecules, mechanisms and medicine. // Biochem. Pharmacol. 2020. V. 181. P. 114168.

  3. Utkin Y.N., Kukhtina V.V., Kryukova E.V., et al. “Weak toxin” from Naja kaouthia is a nontoxic antagonist of alpha 7 and muscle-type nicotinic acetylcholine receptors. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 19. P. 15810–15815.

  4. Nirthanan S., Gopalakrishnakone P., Gwee M.C., et al. Non-conventional toxins from Elapid venoms. Toxicon. 2003. V. 41. № 4. P. 397–407.

  5. Mordvintsev D.Y., Polyak Y.L., Rodionov D.I., et al. Weak toxin WTX from Naja kaouthia cobra venom interacts with both nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors. FEBS J. 2009. V 276. № 18. P. 5065–5075.

  6. Janssen B.J., Leenders P.J., Smits J.F. Short-term and long-term blood pressure and heart rate variability in the mouse. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2000. V. 278. № 1. P. R215–R225.

  7. Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Shenkarev Z.O., et al. Central loop of non-conventional toxin WTX from Naja kaouthia is important for interaction with nicotinic acetylcholine receptors. Toxicon. 2016. V. 119. P. 274–279.

  8. Shenkarev Z.O., Chesnokov Y.M., Zaigraev M.M., et al. Membrane-mediated interaction of non-conventional snake three-finger toxins with nicotinic acetylcholine receptors. Commun. Biol. 2022. V. 5. №1. P. 1344.

  9. Fruchart-Gaillard C., Gilquin B., Antil-Delbeke S., et al. Experimentally based model of a complex between a snake toxin and the alpha 7 nicotinic receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002. V. 99. № 5. P. 3216–3221.

  10. Nys M., Zarkadas E., Brams M., et al. The molecular mechanism of snake short-chain α-neurotoxin binding to muscle-type nicotinic acetylcholine receptors. Nat. Commun. 2022. V. 13. № 1. P. 4543.

  11. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., et al. Structural Insight into Specificity of Interactions between Nonconventional Three-finger Weak Toxin from Naja kaouthia (WTX) and Muscarinic Acetylcholine Receptors. J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 39. P. 23616–23630.

  12. Marquer C., Fruchart-Gaillard C., Letellier G., et al. Structural model of ligand-G protein-coupled receptor (GPCR) complex based on experimental double mutant cycle data: MT7 snake toxin bound to dimeric hM1 muscarinic receptor. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. № 36. P. 31661–31675.

  13. Ogay A.Y., Rzhevsky D.I., Murashev A.N., et al. Weak neurotoxin from Naja kaouthia cobra venom affects haemodynamic regulation by acting on acetylcholine receptors. // Toxicon. 2005. V. 45. № 1. P. 939–939.

  14. Juillerat M.A., Schwendimann B., Hauert J., et al. Specific binding to isolated acetylcholine receptor of a synthetic peptide duplicating the sequence of the presumed active center of a lethal toxin from snake venom. // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. № 6. P. 2901–2907.

  15. Mineev K.S., Kryukova E.V., Kasheverov I.E., et al. Spatial Structure and Activity of Synthetic Fragments of Lynx1 and of Nicotinic Receptor Loop C Models. // Biomolecules. 2020. V. 11. № 1. P. 1.

  16. Шаманаев А.Ю., Алиев О.И., Анищенко А.М., и др. Показатели сердечной деятельности у крыс линии SHR до и после установления стабильно высокого артериального давления // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016. № 4–6. С. 1115–1118.

  17. Кадомцев Д.В., Пасечникова Е.А., Голубев В.Г. Золетил-ксилазиновый наркоз в экспериментах у крыс // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2015. № 5–1. С. 56–57.

  18. Haass M., Kübler W. Nicotine and sympathetic neurotransmission. // Cardiovasc. Drugs Ther. 1997. V. 10. № 6. P. 657–665.

  19. Muntzel M.S., Abe A., Petersen J.S. Effects of adrenergic, cholinergic and ganglionic blockade on acute depressor responses to metformin in spontaneously hypertensive rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. V. 281. № 2. P. 618–623.

  20. Holte H.R., Bjørnstad-Ostensen A., Berg T. The role of endogenous bradykinin in blood pressure homeostasis in spontaneously hypertensive rats. // Br. J. Pharmacol. 1996. V. 118. № 8. P. 1925–1930.

  21. Sharma J.N., Amrah S.S., Noor A.R.. Suppression of hypotensive responses of captopril and enalapril by the kallikrein inhibitor aprotinin in spontaneously hypertensive rats. // Pharmacology. 1995. V. 50. № 6. P. 363–369.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал