Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 513, № 1, стр. 590-594

Для начала транскрипции необходимо взаимодействие транскрипционного аппарата, включающего РНК полимеразу II, основные факторы транскрипции и другие регуляторы с промоторной областью гена. Однако возможность такого связывания зависит от плотности расположения нуклеосом на промоторе, которая регулируется комплексами ремоделинга хроматина. Данные комплексы могут перемещать и убирать нуклеосомы на промоторе, меняя тем самым его структуру с так называемой “закрытой” на “открытую” (высокая и более низкая плотность нуклеосом соответственно).

Комплексы типа SWI/SNF, изменяющие структуру хроматина на промоторе генов, играют одну из важнейших функций в активации транскрипции. SWI/SNF делятся на подсемейства, комплексы BAF и PBAF, имеющие одинаковую структуру, в которой можно выделить каталитический модуль, включающий АТФазу BRG1, модуль ARP, имеющий структурную функцию, и модуль, отвечающий за взаимодействие комплекса с хроматином [1]. Комплекс PBAF отличается от BAF несколькими субъединицами модуля (специфическими субъединицами), ответственными за связывание с хроматином, что определяет избирательность его взаимодействия с хроматином, имеющим определенную эпигенетическую структуру (рис. 1а). Комплекс PBAF является важнейшим коактивационным комплексом, реструктурирующим хроматин. У млекопитающих PBAF вовлечен в активацию большого числа генов, участвуя в контроле таких процессов, как пролиферация, дифференцировка клеток и онкогенез [2].

Рис. 1.

(a) Структура PBAF комплекса. В таблице обозначены субъединицы модуля: общие для всех комплексов типа SWI/SNF и специфические, присутствующие только в PBAF. Показан модуль, в который они входят, и их функции. (б) Нокдаун специфической субъединицы PBAF, белка BAF200 (B200), по сравнению с контрольными клетками (Конт) приводит к деградации других субъединиц специфического модуля: BAF180, BRD7 и PHF10, но не общих субъединиц – BAF155 и BAF47 в клетках HEK293. Окраска антителами против тубулина использовалась как контроль нанесения белкового экстракта.

Ряд данных показывает, что комплексы SWI/SNF играют важную роль в активации генов воспаления. В ряде работ было показано взаимодействие субъединиц комплексов с белками транскрипционных факторов группы NF–kB, играющими центральную роль в индуцибельной экспрессии воспалительных генов. Так, АТФазы Brg1 и Brm взаимодействуют с Rel–A и Rel–B [3]. Rel–B также взаимодействует с несколькими субъединицами, общими для BAF и PBAF комплексов: BAF170, BAF155 и BAF60. Нокдаун субъединиц комплекса влияет на транскрипцию ряда генов воспаления, таких как Il12b, Ifnb1, Saa3, Ccl5, Nos2, Il6, Il12b [4]. Участие подсемейства BAF в активации генов воспаления было показано в нескольких работах. Так, его специфические субъединицы BAF45B и BAF45С взаимодействуют с p50, а BAF250 участвует в активации транскрипции генов Il6, CXCL1, IL1A, IL1B, IL6 и IL8. Однако роль PBAF в активации генов воспаления практически не изучена.

В настоящее время показано, что промоторы ряда генов раннего воспалительного ответа имеют более открытую структуру хроматина, чем промоторы поздних генов. Это делает их транскрипцию более независимой от необходимости ремоделирования хроматина (более подробная информация в обзоре [5]). Тем не менее комплекс PBAF был найден на промоторах ранних провоспалительных генов [6].

Данная работа была направлена на изучение роли PBAF в регуляции ранних генов воспаления, активирующихся сигнальным каскадом NF–κB и сигнальным путем JAK/STAT. Для работы была выбрана линия клеток HEK293, которая ранее эффективно использовалась другими авторами для изучения регуляции генов воспаления [7]. Была изучена транскрипция генов воспаления в норме и при связывании с их промотором PBAF, у которого был нарушен PBAF-специфический модуль, участвующий во взаимодействии с хроматином. Был проведен нокдаун компонента специфического модуля субъединицы BAF200. Клетки HEK293 были обработаны смесью транфецирующего реагента Metafecten (Biontex) и короткими дуплексами РНК против BAF200 (BAF200_for: 5'-CAAGGGACUUCUGGCAACCAGGdTdT, BAF200_rev: 5'-CCUGGUUGCCAGAAGUCCCUUGdTdT) или контрольными (Контр_for: 5'-AGGUCGAACUACGGGUCAAdTdC, Контр_rev: 5'-UUGACCCGUAGUUCGACCUdAdG) в течение 48 ч и затем клеточные лизаты проанализированы Вестер-блоттингом (рис. 1б). Антитела, использованные для детекции субъединиц, были ранее получены в нашей лаборатории и охарактеризованы [8, 9]. Наши эксперименты показали, что нокдаун BAF200 в клетках человека не влияет на каталитический модуль комплекса PBAF, но частично нарушает структуру модуля связывания хроматина, что приводит к деградации его компонентов, специфичных для PBAF: BAF180, BRD7 и PHF10. Как показано на рис. 1б, их уровень в клетке значительно понижается при нокдауне BAF200. В результате этого нарушается взаимодействие PBAF с хроматином на промоторах регулируемых генов [10].

Активацию транскрипции провоспалительных генов, зависящих от NF–κB сигнального пути, проводили добавлением к клеткам фактора некроза опухолей (ФНО) в количестве 20 нг/мл. Для работы были выбраны гены CXCL1, CXCL2, CXCL3, IL8, которые хорошо активируются при добавлении ФНО в клетках линии HEK293 (любезно предоставленной проф. И. Ронинсоном) [7]. Пик транскрипции этих генов достигается через один час после начала активации (рис. 2а). Поэтому все дальнейшие измерения проводили до активации транскрипции и через час после. Также с помощью иммунопреципитации хроматина мы показали локализацию BAF200 на промоторах данных генов без активации (рис. 2б). В основе этого эксперимента лежит осаждение изучаемого белка, взаимодействующего с хроматином, и предварительно сшитым с ним с помощью формальдегида, специфическими антителами. После осаждения, элюции и восстановления формальдегидных сшивок белки деградируют с помощью протеиназы К, а фрагменты ДНК выделяют и используют в качестве матрицы для количественной ПЦР в режиме реального времени со специфическими праймерами к определенному участку генома. Уровень транскрипции генов до активации, после активации ФНО и после активации на фоне нокдауна BAF200 также измеряли методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Экспрессию анализируемых генов нормировал на экспрессию гена RPLP0. Уровень транскрипции генов повышался примерно на порядок или больше после активации транскрипции. Нокдаун BAF200 приводил к значительному падению уровня мРНК генов CXCL1, CXCL2, CXCL3, что показывает, что PBAF является их ко-активатором (рис. 2в). Уровень мРНК IL8, наоборот, понижался при нокдауне.

Рис. 2.

(а) Активация генов воспаления CXCL1, CXCL2, CXCL3 и IL8 в процессе активации NF–kB сигнального пути с помощью ФНО в течение 24 часов. (б) Показана локализация субъединицы BAF200 на промоторах изучаемых генов с помощью хроматин-иммунопреципитации. По оси у показаны проценты обогащения относительно вносимого материала (% обогащения ИП). Измерения проведены в 3 повторностях и представлены в виде среднее ± стандартное отклонение. (в) Уровень экспрессии генов CXCL1, CXCL2, CXCL3 и IL8 без активации (Конт), при активации в течение одного часа (Конт (ФНО)) и при активации при нокдауне BAF200 (B200 (ФНО)) также в течение одного часа. По оси у показано изменение уровня РНК относительно контроля при нормировании на уровень экспрессии гена RPLP0. Во всех экспериментах измерения проведены в 3 повторностях и представлены в виде среднее ± стандартное отклонение. * – p < 0.001, ** – p < 0.01 по сравнению с контролем (однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Даннета).

Аналогичные эксперименты были проведены на генах JAK/STAT зависимого пути IFIT1, IFITM2, ISGF3G. Активацию проводили добавлением к клеткам HEK293 интерферона-A (ИФ) (1000 U/мл). В данном случае измерения проводили через 20 ч после начала активации, так как согласно нашим данным именно в это время достигается пик транскрипции изучаемых нами генов (рис. 3а). На промоторах этих генов BAF200 также локализуется в норме (рис. 3б). Наши результаты показали, что, в то время как все гены эффективно активировались добавлением ИФ, уровень мРНК генов IFIT1, IFITM2 падал от нокдауна BAF200 примерно в два раза. Однако транскрипция гена ISGF3G вырастала примерно в 1.5 раза (рис. 3в).

Рис. 3.

(а) Активация генов воспаления IFIT1, IFITM2 и ISGF3G в процессе активации JAK/STAT сигнального пути с помощью ИФ в течение 24 ч. По оси У справа показан относительный уровень активации генов IFITM2 и ISGF3G, по оси слева – уровень активации для гена IFIT1. (б) Показана локализация субъединицы BAF200 на промоторах изучаемых генов с помощью хроматин-иммуннопреципитации. По оси y показаны проценты обогащения относительно вносимого материала (% обогащения ИП). Измерения проведены в 3 повторностях и представлены в виде среднее ± ± стандартное отклонение. (в) Уровень экспрессии генов IFIT1, IFITM2 и ISGF3G без активации (Конт), при активации в течение двадцати четырех часов (Конт (ИФ)) и при активации при нокдауне BAF200 (B200 (ИФ)) также в течение двадцати четырех часов. По оси y показано изменение уровня РНК относительно контроля при нормировании на уровень экспрессии гена RPLP0. Во всех экспериментах измерения проведены в 3 повторностях и представлены в виде среднее ± стандартное отклонение. * – p < 0.001, ** – p < 0.01 по сравнению с контролем (однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Даннета).

Таким образом, наши результаты показывают, что PBAF в зависимости от гена, на котором он присутствует, способен как стимулировать, так и подавлять его активацию. Можно предположить, что различное влияние PBAF на транскрипцию обусловлено различной структурой хроматина промоторов ранних генов. На промоторе с более плотной организацией нуклеосом транскрипция не будет активироваться в отсутствие ремоделирования хроматина и нарушение взаимодействия комплекса с хроматином промотора приведет к значительному понижению транскрипции [11]. Наоборот, на открытых промоторах ремоделирование хроматина не является необходимым условием для начала транскрипции. В этом случае присутствие комплекса на промоторе может мешать связыванию других активаторов транскрипции, а его уход приводить к повышению транскрипционного уровня гена. То есть в данном случае PBAF не позволяет генам активироваться неограниченно и важен для поддержания транскрипции на уровне, необходимом для координированной экспрессии генов воспаления.

Также можно предположить, что PBAF ограничивает транскрипцию ряда генов воспаления за счет привлечения других регуляторных факторов. Так было показано, что в местах двойных разрывов ДНК субъединицы PBAF, белки BRD7 и BAF180 фосфорилируются и привлекают в данный локус ингибиторы транскрипции, репрессивные комплексы Polycomb, PRC1 и PRC2 [12].

Для некоторых генов раннего воспалительного ответа было показано, что их промоторы имеют открытую структуру хроматина и нокдаун АТФаз Brg1 и Brm не имеет значительного влияния на уровень их транскрипции [6]. Если структура промоторов исследованных нами генов также является открытой, можно предположить, что PBAF на их промоторах имеет функции, отличные от ремоделинга хроматина. Действительно, как было показано ранее, только часть субъединниц PBAF необходимо для ремоделинга in vitro [14]. Функции большинства субъединиц комплекса в регуляции транскрипции in vivo остаются неизвестны.