Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 509, № 1, стр. 191-195
Димеры хлорофилла а в составе водорастворимого белка BoWSCP фотосенсибилизируют восстановление цитохрома c
Ю. Н. Обухов 1, *, К. В. Неверов 1, Ю. В. Малеева 2, М. С. Крицкий 1
1 Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
Москва, Россия
2 Биологический факультет Московского государственного университета
имени М.В. Ломоносова
Москва, Россия
* E-mail: y.u.r.a.o@mail.ru
Поступила в редакцию 24.10.2022
После доработки 20.11.2022
Принята к публикации 30.11.2022
- EDN: LZAHVX
- DOI: 10.31857/S2686738922600790
Аннотация
При связывании с водорастворимыми белками семейства WSCP молекулы хлорофилла формируют димеры, структурно сходные со “специальной парой” хлорофиллов (бактериохлорофиллов) в фотосинтетических реакционных центрах. Под воздействием красного света (λ ≥ 650 нм) в бескислородной среде димеры хлорофилла a в холобелке BoWSCP (из Brassica oleracea var. botrytis) сенсибилизировали восстановление цитохрома c. Согласно данным спектроскопии (абсорбционной и кругового дихроизма), фотохимический процесс не вызывал существенным образом деструкции молекул хлорофилла a и не влиял на структуру их димеров в составе белка BoWSCP. Добавление трис(гидроксиметил)аминометана в качестве донора электронов для ревосстановления хлорофилла стимулировало процесс фотовосстановления цитохрома с.
Хлорофилл-связывающие белки семейства WSCP (Water-Soluble Chlorophyll Binding Proteins) обнаружены в высших растениях у представителей порядков Caryophyllales (гвоздичноцветные), Polygonales (гречихоцветные) и Brassicales (капустоцветные) [1, 2]. Эти белки водорастворимы, они локализованы вне хлоропластов и не принимают участия в фотосинтетическом процессе, а их физиологические функции, предположительно, связаны с активностью антистрессовых систем клетки [1–5]. Белки семейства WSCP формируют гомотетрамеры с молекулярной массой 69–80 кДа, а каждый из гомотетрамеров нековалентно связывает до четырех молекул хлорофилла (Хл) [6–8].
Для тетрамерных ансамблей белков класса II семейства WSCP показано, что четыре молекулы Хл организованы в них в виде двух димеров с углом между плоскостями порфириновых колец пигментов в димере около 30 градусов [6, 7]. Эти димеры Хл в WSCP структурно сходны, хотя и не идентичны, димерам Хл (или бактериохлорофилла), образующим “специальную пару” в реакционных центрах фотосинтетических систем [9]. Именно “специальная пара” (бактерио)хлорофиллов при поглощении квантов света (либо в результате миграции энергии от пигментов антенны) участвует в ключевом этапе преобразования энергии – первичном разделении зарядов, выступая в роли донора электрона, транспорт которого по цепи переносчиков приводит к образованию богатых энергией молекул [9].
Задача настоящего исследования состояла в выяснении способности димера Хл в составе холобелка WSCP при возбуждении светом сенсибилизировать восстановление акцептора электрона, в качестве которого использовали цитохром c. Выявление такой фотохимической активности у Хл в холобелке WSCP важно для углубления физико-химической характеристики белков этой группы и для прояснения их физиологических функций.
В качестве объекта исследования был выбран белок BoWSCP из цветной капусты (Brassica oleracea var. botrytis), относящийся к подклассу WSCP IIA, представители которого связывают практически только Хл a [1, 5, 10]. Белки родственного подкласса WSCP IIB способны связывать также и Хл b, что делает их более сложными объектами из-за гетерогенного пигментного состава [1, 10, 11]. Белки WSCP филогенетически отдаленного класса I не рассматривались нами в качестве объектов исследования ввиду отсутствия достоверных сведений о димерной упаковке молекул Хл a в их составе. Кроме того, наличие у WSCP класса I фотоконверсии (фотоиндуцированного превращения Хл а в бактериохлорин-подобные продукты) делает невозможным контроль их пигментного состава [1, 12].
Препараты апобелка BoWSCP получали методом гетерологической экспрессии его структурного гена в штамме Escherichia coli BL 21 DE3. Хранение и выращивание клеток E. coli с плазмидами, несущими гены целевого белка, а также экспрессию этих генов и выделение препаратов апобелка проводили согласно методикам, представленным в [5, 11] с незначительными модификациями. Самосборку тетрамерных Хл-белковых комплексов (холоформ) проводили в растворе при комнатной температуре, инкубируя апобелки WSCP с препаратами свежевыделенных тилакоидов из листьев шпината. Полученные тетрамерные комплексы, благодаря наличию на C-концах апобелков шести гистидиновых остатков, очищали аффинной хроматографией на Ni-агарозе [5, 11, 13].
Раствор холобелка BoWSCP (концентрация по OD673 нм = 0.2), содержащий 10 или 30 мкМ цитохрома с из сердца лошади (Sigma-Aldrich, США) в 10 мМ Трис-HCl буфере (Serva, Germany), pH 8.0, облучали красным светом (светофильтр КС-15, λ ≥ 650 нм) при непрерывной продувке аргоном. В качестве источника света использовали галогеновую лампу (W = 150 Вт), имеющую сплошной спектр излучения в видимой и ИК-области. Дальнюю инфракрасную часть спектра отсекали водным фильтром (3 см); свет фокусировали на кювету с реакционной смесью линзой (F = 97 мм). Квантовую интенсивность излучения измеряли радиометром LI-250A (LiCOR, USA) с диапазоном чувствительности 400–710 нм. С помощью нейтральных светофильтров получали плотность потока квантов на уровне объекта от 250 до 1800 μE м–2 с–1. В пробу добавляли 150 мМ NaCl для предотвращения коагуляции WSCP и цитохрома.
Повышение пика поглощения при 550 нм в процессе облучения указывало на восстановление цитохрома с (рис. 1). Без облучения восстановление происходило в несколько раз медленнее: за 15 мин инкубации OD550 монотонно возрастала до величины, не превышающей 0.003 ед. При отсутствии в пробе BoWSCP фотовосстановления цитохрома с не наблюдали. Можно заключить, что возбуждение светом Хл a в составе BoWSCP сенсибилизировало восстановление цитохрома с. Таким образом, молекулы Хл a, организованные в димерные структуры в составе белка из семейства WSCP, подобно Хл “специальной пары” фотосинтетических реакционных центров, сенсибилизировали фотовосстановление акцепторов электрона.
Скорость фотовосстановления цитохрома c снижалась при интенсивности света, превышающей 1000 μE м–2 с–1 (рис. 2а). Возможно, это свидетельствует о наличии диффузионного ограничения, понижающего эффективность прямого взаимодействия макромолекул цитохрома c и WSCP в условиях низкого времени жизни возбужденного состояния Хл, инициирующего фотохимическую реакцию.
Облучение растворов BoWSCP приводило к незначительной деструкции Хл a и нарушению димерной организации его молекул. О состоянии этих параметров судили по снижению поглощения в пике при 673 нм, а также уменьшению амплитуды характерного для димерной формы Хл специфического сигнала в спектре кругового дихроизма в области 650–700 нм (рис. 2б и 3).
Облучение в атмосфере аргона данных проб светом с интенсивностью 700 μE м–2 с–1 в течение 15 мин вызывало деструкцию Хл и нарушение его димерной структуры не более, чем на 10%, что свидетельствует о сравнительно высокой фотоустойчивости тетрамерного холобелка BoWSCP (рис. 2, 3).
Возникает вопрос, за счет какого источника происходило ревосстановление Хл, подвергшегося окислению при фотохимической редокс-реакции с цитохромом c? Согласно нашим результатам, таким донором служил трис(гидроксиметил)аминометан, присутствовавший в пробах в качестве основания Трис-HCl буферного раствора. Ранее сообщалось об использовании данного соединения в качестве донора электрона в фотохимических экспериментах [14–16].
В пользу участия трис(гидроксиметил)аминометана в качестве донора электрона свидетельствуют результаты опытов, в которых буферную систему (10 мМ Трис-HCl, pH 8.0) заменяли в пробах на 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 8.0. В первые минуты облучения красным светом (λ ≥ ≥ 650 нм, 1800 μE м–2 с–1) проб, содержавших холоформы BoWSCP (OD673 = 0.2), 30 мкМ цитохром с и 150 мМ NaCl в 10 мМ Na-фосфатном буфере, pH 8.0, оптическая плотность при 550 нм сначала незначительно повышалась. Далее происходило ее монотонное снижение, свидетельствовавшее об окислении цитохрома с. Причиной могло служить присутствие в коммерческих препаратах цитохрома c около 2.5% (по массе) примеси восстановленной формы, которая окислялась следовыми количествами кислорода, сохранившимися в пробах после продувки аргоном. При добавлении в пробы Трис-HCl буфера, pH 8.0, до концентрации 10 мМ перед началом световой инкубации или в ходе облучения, наблюдали прирост пика поглощения при 550 нм, что указывало на фотовосстановление цитохрома с (рис. 4).
Из рис. 4а видно, что кривая фотовосстановления цитохрома в присутствии Трис-HCl-буфера после 4 мин облучения выходит на плато. Возможно, это является следствием более эффективного окисления цитохрома c в фосфатном буфере, где была использована более высокая концентрация цитохрома c – 30 мкМ вместо 10 мкМ (рис. 2).
Можно заключить, что трис(гидроксиметил)аминометан выполнял при фотосенсибилизированном Хл a восстановлении цитохрома c роль донора электрона, восстанавливающего молекулы Хл, подвергшиеся окислению во время редокс-реакции.
Выявление фотохимической редокс активности у димеров Хл в составе холобелка BoWSCP ориентирует на конструирование на этой основе водорастворимых моделей реакционных центров фотосинтетических систем с целью исследования эволюции фотосинтетического аппарата, а также конструирование искусственных конверторов солнечной энергии. Очевидно, что реализация таких моделей и обоснование их плодотворности потребуют серьезного экспериментального исследования молекулярных механизмов пигмент-пигментных и пигмент-белковых взаимодействий в WSCP с использованием спектральных методик с высоким временным разрешением.
Список литературы
Satoh H., Uchida A., Nakayama K., Okada M. // Plant and Cell Physiology. 2001. V. 42. № 9. P. 906–911.
Малеева Ю.В., Неверов К.В., Обухов Ю.Н., Криц-кий М.С. // Молекулярная биология. 2019. Т. 53. № 6. С. 998–1011.
Schmidt K., Fufezan C., Krieger-Liszkay A., Satoh H., et al. // Biochemistry. 2003. V. 42. № 24. P. 7427–7433.
Damaraju S., Schlede S., Eckhardt U., Lokstein H., et al. // Journal of Plant Physiology. 2011. V. 168. № 12. P. 1444–1451.
Takahashi S., Yanai H., Nakamaru Y., Uchida A., et al. // Plant and Cell Physiology. 2012. V. 53. № 5. P. 879–891.
Horigome D., Satoh H., Itoh N., Mitsunaga K., et al. // Journal of Biological Chemistry. 2007. V. 282. № 9. P. 6525–6531.
Bednarczyk D., Dym O., Prabahar V., Peleg Y., et al. // Angewandte Chemie International Edition. 2016. V. 55. № 24. P. 6901–6905.
Takahashi S., Uchida A., Nakayama K., Satoh H. // The Protein Journal. 2014. V. 33. № 4. P. 337–343.
Blankenship R.E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. 2nd ed. In: Ch.7. Reaction centers and electron transfer pathways in oxygenic photosynthetic organisms, pp. 89–109. John Wiley & Sons, Ltd. Oxford, UK, etc. 2014. ISBN 978-1-4051-8976-7
Palm D.M., Agostini A., Averesch V., Girr P., et al. // Nature Plants. 2018. V. 4. № 11. P. 920–929.
Takahashi S., Yanai H., Oka‑Takayama Y., Zanma‑Sohtome A., et al. // Planta. 2013. V. 238. № 6. P. 1065–1080.
Hirabayashi H., Amakawa M., Kamimura Y., Shino Y., et al. // Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 2006. V. 183. № 1-2. P. 121–125.
Charlton A., Zachariou M. // Affinity Chromatography. Humana Press. 2008. P. 137–150. ISBN: 978-1-58829-659-7
Diesen V., Jonsson M. // Journal of Advanced Oxidation Technologies. 2012. V. 15. № 2. P. 392–398.
Nikandrov V.V., Shlyk M.A., Zorin N.A., Gogotov I.N., et al // FEBS Letters. 1988. V. 234. № 1. P. 111–114.
Никандров В.В., Надточенко В.А., Семенов А.Ю. и соавторы. Фотобиокатализатор для получения восстановленных форм никотинамидных коферментов NADH или NADPH и фотокаталитический способ получения NADH или NADPH. // Патент RU(11) 2416644. Cрок действия c 17.11.2009.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Доклады Российской академии наук. Науки о жизни