Цитология, 2021, T. 63, № 5, стр. 442-448

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Дизайн исследования. В эксперименте использовано 75 самцов крыс Вистар, из которых были сформированы 3 группы: контрольная группа (доношенные животные, 22 сут гестации), группа 1 (недоношенные крысы, 21.5 сут гестации) и группа 2 (недоношенные крысы, 21 сут гестации). Для получения потомства, самцов крыс Вистар (2-хмесячные, весом 180 ± 20 г) подсаживали на ночь к самкам крыс Вистар (3-хмесячные, весом 180 ± 20 г), находившихся на стадии проэструса полового цикла. Утром следующего дня анализировали влагалищные мазки самок крыс. Первым днем беременности считали день обнаружения у самок во влагалищном мазке сперматозоидов. Индукцию преждевременных родов через 21 и 21.5 сут беременности осуществляли накануне (20 и 20.5 сут беременности соответственно) подкожным введением самкам крыс мифепристона (1 мл, 10 мг на 1 кг массы тела; Sigma-Aldrich, США) (Dudley et al., 1996). Всех животных содержали в стандартных условиях вивария, беременных крыс содержали в отдельных клетках. Выведение потомства из эксперимента осуществляли на 1, 3, 5, 7 и 14 сут постнатального периода онтогенеза асфиксией CO₂. Животных и их сердца взвешивали на лабораторных весах (HL-100, Япония). Сердца фиксировали в формалине (БиоВитрум, Россия) для последующего гистологического, иммуногистохимического и морфометрического исследования. Относительную массу сердца (%) крыс рассчитывали по формуле: [масса сердца (г)/масса крысы (г)] × 100%.

Гистология и иммуногистохимия. Через 12–24 ч фиксации в забуференном растворе формалина (рН 7.4) сердца крыс промывали в проточной воде, обезвоживали в Isoprep (БиоВитрум, Россия) и пропитывали парафиновой смесью HISTOMIX (БиоВитрум, Россия). Срезы толщиной 5 мкм получали на автоматическом микротоме (HM355S, Thermo Fisher Scientific, Китай). Для гистологического изучения срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Для иммуногистохимии срезы монтировали на предметные стекла с полилизиновым покрытием. На срезах выявляли Ki67-позитивные клетки (пролиферирующие клетки), используя в качестве первичных антител ab16667 (Anti-Ki67 antibody [SP6] в разведении 1 : 300). Проводили высокотемпературную демаскировку антигенов в цитратном буфере (0.01 М; рН 6.0), затем срезы инкубировали с первичными антителами в течение 45 мин при комнатной температуре (25°С). Первичные антитела визуализировали при помощи системы детекции Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit – Micro-polymer (Abcam, Великобритания), после чего срезы докрашивали гематоксилином Джилла. Постановку отрицательного контроля осуществляли нанесением на срезы вместо первичных антител раствора для разведения антител Ab Diluent (Abcam, Великобритания).

Микроскопия образцов. Исследование микропрепаратов и фотосъемку осуществляли на световом микроскопе Axioscope 40 (Zeiss, Германия) с помощью цифровой камеры CanonG5 (Canon, Китай).

Морфометрия. На гистологических препаратах сердца крыс при помощи программы ImageJ 1.48 (NIH, США) измеряли толщину стенки левого желудочка, а также диаметр сократительных кардиомиоцитов левого желудочка. Подсчитывали количество Ki67-позитивных кардиомиоцитов в 1 мм² площади среза стенки левого желудочка.

Статистическая обработка данных. Анализ морфометрических показателей проводили при помощи SPSS 16.0 (IBM, USA) с использованием критериев Шапиро−Уилка и Манна−Уитни. Данные представлены в виде медианы и квартилей – Ме (Q₁; Q₃). Различия между показателями считали достоверными при уровне значимости p ≤ 0.01.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение преждевременно рожденного потомства. Продолжительность беременности контрольных крыс Вистар составляет 22 сут. В 100% случаев через 18–24 ч после введения беременным крысам мифепристона наблюдается начало преждевременных родов. Помет составляет в среднем 12 ± 2 особей. Гибель отдельных крыс (1–2 животное из помета) в группе 2 (недоношенные крысы, 21 сут гестации) наблюдали на 1–2 сут постнатального периода онтогенеза. Гибели крыс в контрольной группе и группе 1 (недоношенные крысы, 21.5 сут гестации) в исследуемые сроки не наблюдали.

Показатели массы тела и сердца крыс. Ранний постнатальный период онтогенеза крыс сопровождается динамичным изменением массы животных. Масса крыс в группах 1 и 2 ниже, чем у контрольных животных на всем протяжении эксперимента (табл. 1). Масса крыс в раннем постнатальном периоде онтогенеза тем меньше, чем меньше срок гестации.

Масса сердца крыс всех исследуемых групп увеличивается с 1 по 14 сут постнатального периода онтогенеза. Масса сердца преждевременно рожденных крыс ниже, чем у контрольных животных, начиная с первых суток, по 7–14 сут постнатального периода онтогенеза (табл. 1). Снижение массы сердца у крыс сохраняется тем дольше, чем меньше срок гестации.

В группе контрольных животных относительная масса сердца уменьшается в ходе эксперимента. У крыс групп 1 и 2 относительная масса сердца превышает аналогичный показатель контрольных животных на 14 сут постнатального периода онтогенеза (табл. 1).

Характеристика миокарда левого желудочка крыс. Толщина стенки левого желудочка крыс всех исследуемых групп возрастает в постнатальный период онтогенеза в течение всего срока наблюдения (1–14 сут). Толщина стенки левого желудочка преждевременно рожденных крыс не отличается от аналогичного показателя доношенных животных в исследуемые сроки (табл. 1).

Миокард левого желудочка крыс образован тремя слоями кардиомиоцитов, разделенных тонкими прослойками соединительной ткани. В ходе постнатального периода онтогенеза у крыс всех исследуемых групп увеличивается эозинофилия, а также выраженность поперечной исчерченности цитоплазмы сократительных кардиомиоцитов левого желудочка (рис. 1). На протяжении эксперимента в миокарде крыс всех исследуемых групп определяются фигуры митоза кардиомиоцитов. Двуядерные кардиомиоциты определяются в миокарде левого желудочка крыс и контрольной, и обеих экспериментальных групп, начиная с 1 сут постнатального периода онтогенеза. Количество двуядерных кардиомиоцитов в миокарде крыс в контрольной, 1-ой и 2-ой группе визуально увеличивается в ходе эксперимента. Установлено, что диаметр сократительных кардиомиоцитов левого желудочка крыс 2-ой группы превышает аналогичный показатель животных контрольной группы в первые сутки постнатального периода онтогенеза (табл. 1). Различий диаметра сократительных кардиомиоцитов левого желудочка крыс в контрольной, 1-ой и 2-ой группе с 3 по 14 сут постнатального периода онтогенеза не наблюдали.

Рис. 1.

Гистологический препарат миокарда левого желудочка крысы на 7 сут постнатального периода онтогенеза. (а) – Контрольная группа, 22 сут гестации; (б) – группа 1, срок гестации 21.5 сут, (в) – группа 2, срок гестации 21 сут. Окраска гематоксилином и эозином.

Выявление Ki67-позитивных клеток миокарда крыс. В стенке левого желудочка крыс исследуемых групп Ki67-позитивное окрашивание характерно для делящихся кардиомиоцитов, эндотелиоцитов и фибробластов (рис. 2). Ki67-позитивные кардиомиоциты в стенке левого желудочка крыс контрольной, 1-ой и 2-ой групп определяются в субэпикардиальных, средних и субэндокардиальных участках с 1 по 14 сут постнатального периода онтогенеза. Динамика количества Ki67-позитивных кардиомиоцитов в стенке левого желудочка крыс всех групп отражена на графике (рис. 3). Изменение количества Ki67-позитивных кардиомиоцитов в стенке левого желудочка крыс в 1-ой и контрольной группе носят схожий характер. Однако количество Ki67-позитивных кардиомиоцитов в стенке левого желудочка крыс 1-ой группы превышает соответствующий показатель контрольных животных на 3, 7 и 14 сут пренатального периода онтогенеза. У крыс группы 2 наблюдается более раннее увеличение количества Ki67-позитивных кардиомиоцитов в стенке левого желудочка по сравнению с таковым у животных контрольной и 1-ой групп. Уменьшение количества Ki67-позитивных кардиомиоцитов в стенке левого желудочка у крыс группы 2 также наблюдается раньше, чем у контрольных животных и в группе 1.

Рис. 2.

Срез миокарда левого желудочка крысы на 3 сут постнатального периода онтогенеза, окрашенный на выявление Ki67-позитивных кардиомиоцитов. (а) – Контрольная группа, 22 сут гестации; (б) – группа 1, срок гестации 21.5 сут, (в) – группа 2, срок гестации 21 сут. Головки стрелок указывают на маркер Ki67. Иммуногистохимическая окраска с докраской гематоксилином Джилла.

Рис. 3.

Динамика числа Ki67-позитивных кардиомиоцитов на 1 мм² среза миокарда левого желудочка доношенных крыс (контрольных) и недоношенных, рожденных через 21.5 сут (группа 1) и 21 сут (группа 2) в течение 14 сут постнатального периода онтогенеза. Результаты представлены в виде медианы (Me) и нижнего (Q₁) и верхнего (Q₃) квартилей, крестики показывают среднее значения показателя; различия достоверны при р < 0.01 при сравнении с соответствующим показателем предыдущего срока той же группы (а), контрольной группы(б) и показателя группы 1 (в).

ОБСУЖДЕНИЕ

Преждевременное рождение связано с повышенными гемодинамическими нагрузками на структурно незрелое сердце, что может быть причиной адаптивного ремоделирования миокарда. Структурные изменения миокарда, вызванные преждевременным рождением, вероятно, носят персистирующий характер (Bensley et al., 2010). Выявление структурных изменений миокарда, вызванных преждевременным рождением, является актуальной задачей.

Период с 18 по 22 сут пренатального периода онтогенеза крыс Вистар соответствует третьему триместру беременности у человека (Toyono et al., 1999). Анатомически сердце крысы сформировано к 16-м сут пренатального периода онтогенеза, однако вплоть до 22 сут пренатального периода онтогенеза продолжается его рост и созревание. За последние сутки пренатального периода онтогенеза у крыс увеличивается масса и объем левого желудочка, масса правого желудочка, площадь левого атриовентрикулярного отверстия (Ito et al., 1998, 2001). Мы считаем, что преждевременно рожденные (через 21 и 21.5 сут гестации) крысы могут быть использованы для изучения влияния недоношенности на морфофункциональное состояние миокарда.

Нами показано, что недоношенность у крыс ассоциирована с низкой массой тела при рождении, что согласуется с данными из литературы (Buhrdel et al., 1978a). Более низкая масса тела у преждевременно рожденных крыс на 1–7 сут постнатального периода онтогенеза, по сравнению с доношенными животными, сопровождается закономерным снижением массы сердца (Buhrdel et al., 1978b).

Мы показали, что, несмотря на более низкие абсолютные величины, относительная масса сердца преждевременно рожденных крыс превышает аналогичный показатель контрольных животных на 14 сут эксперимента. Снижение абсолютной массы сердца преждевременно рожденных крыс не сопровождается снижением толщины стенки левого желудочка в исследуемые сроки. Более того, преждевременное рождение крыс приводит к интенсификации роста миокарда в раннем постнатальном периоде развития, о чем свидетельствует увеличение количества Ki67-позитивных кардиомиоцитов в миокарде преждевременно рожденных крыс.

У крыс рост миокарда в пренатальном периоде онтогенеза протекает, в основном, по гиперпластическому типу (Xavier-Vidal et al., 1997), тогда как в раннем постнатальном периоде онтогенеза он обусловлен как гиперплазией, так и гипертрофией кардиомиоцитов. Переход с гиперпластического на гипертрофический тип роста миокарда крыс происходит на 3–4 сутки постнатального периода онтогенеза (Li et al., 1996).

Ki67 является неспецифичным маркером пролиферации, который не позволяет дифференцировать две популяции кардиомиоцитов: 1) проходящие истинный митоз и 2) претерпевающие эндорепликацию. Истинный митоз кардиомиоцитов приводит к увеличению пула одноядерных диплоидных кардиомиоцитов и отражает гиперпластический тип роста миокарда. Эндорепликация кардиомиоцитов является основой гипертрофического типа роста и заключается в прохождении кардиомиоцитами кариокинеза без цитотомии, в результате которого образуются полиплоидные многоядерные кардиомиоциты. Больший диаметр сократительных кардиомиоцитов стенки левого желудочка на 1 сут постнатального периода онтогенеза у преждевременно рожденных крыс, в сравнении с доношенными животными, может указывать на более ранний переход кардиомиоцитов преждевременно рожденных животных от гиперпластического типа роста к гипертрофическому типу.

Известно, что эндорепликация и формирование двуядерных кардиомиоцитов может быть ответной реакцией на стрессовое воздействие (Landim-Vieira et al., 2020). Показано, что у новорожденных мышей и крыс повреждение миокарда сопровождается практически полным его восстановлением за счет активации пролиферативной активности кардиомиоцитов. Однако регенераторный потенциал миокарда в раннем постнатальном периоде онтогенеза реализуется не за счет гиперплазии, а за счет эндорепликации и формирования двуядерных кардиомиоцитов (Zebrowski et al., 2017).

Гипертрофия кардиомиоцитов сопровождается увеличением их линейных размеров и связана с усилением их сократительной функции, однако сопровождается потерей способности претерпевать истинный митоз. Более ранний переход миокарда с гиперпластического на гипертрофический тип роста приводит к уменьшению абсолютного количества кардиомиоцитов и, следовательно, снижению миокардиального резерва (Lewandowski et al., 2020). Известно, что масса животного при рождении положительно коррелирует с количеством кардиомиоцитов в левом желудочке и межжелудочковой перегородке в половозрелом возрасте (Vranas et al., 2017). У преждевременно рожденных детей в возрасте 13 и 25 лет масса и размер желудочков меньше аналогичных показателей доношенных сверстников (Goss et al., 2020).

Таким образом, преждевременное рождение крыс приводит к увеличению количества Ki67-позитивных кардиомиоцитов в стенке левого желудочка в раннем постнатальном периоде онтогенеза. Мофрофункциональные изменения миокарда более выражены у крыс, рожденных на 21-е сут, чем у рожденных через 21.5 сут животных. Однако требуется дополнительное исследование, целью которого будет верификация интенсификации эндомитоза кардиомиоцитов в результате преждевременного рождения животных.